劉春菊　杜傳印　魏軍　劉宏　李斐　方敏　于成明　原雪峰

摘要：黃瓜花葉病毒（CMV ）和馬鈴薯 X 病毒（PVX ）在煙草中普遍存在、危害嚴(yán)重，對(duì)煙草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有重大影響。為預(yù)防田間煙草上黃瓜花葉病毒和馬鈴薯X 病毒，需要構(gòu)建能夠同時(shí)預(yù)防CMV 和PVX 的弱毒疫苗。本研究首先構(gòu)建了 CMV RNA2的2b 蛋白提前終止突變體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT ，在此突變體中插入200 bp 的 PVX 保守序列（5890-6089）獲得突變體質(zhì)粒 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。該突變體質(zhì)粒與含野生型 CMVFny RNA1和 CMVFny RNA3的質(zhì)粒等量混合后通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)方法分別接種中煙100、紅花大金元和林煙草，接種后煙草癥狀與野生型 CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接種煙草癥狀相比顯示弱侵染性。疫苗遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)證實(shí)疫苗載體中插入的 PVX 200 bp 保守片段穩(wěn)定存在，CMV 和 PVX 強(qiáng)毒株系攻毒試驗(yàn)表明該弱毒疫苗在中煙100上對(duì) CMV 和 PVX 同時(shí)具備交叉保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：交叉保護(hù)；黃瓜花葉病毒；馬鈴薯 X 病毒；弱毒疫苗

中圖分類號(hào)： S435.72?????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A?????????? 文章編號(hào)：1007-5119（2023）01-0044-07

Construction of an Attenuated Vaccine Against Both Potato Virus X and Cucumber Mosaic Virus

LIU Chunju1， DU Chuanyin1 ， WEI Jun1， LIU Hong1， LI Fei1， FANG Min1， YU Chengming2*， YUAN Xuefeng2*

（1. Shandong Weifang Tobacco Co.， Ltd.， Weifang， Shandong 261061， China;2. College of Plant Protection， Shandong AgriculturalUniversity， Taian， Shandong 271018， China）

Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） disease and potato virus X （PVX） disease major diasesese that cause great loss in tobacco production. In? order to prevent? CMV? and? PVX? an? attenuated vaccine? was? constructed? which? could prevent? CMV? and? PVX simultaneously. A mutant of CMV RNA2 named pCB301-CMVFny-R2-2bPT was constructed firstly in which the expression of 2b protein was terminated prematurely. Then an 200 bp conserved sequence （5890-6089） of PVX was inserted into pCB301-CMVFny- R2-2bPT? and? obtained? the? mutant? named? pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089. The? pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089 plasmid mixed with the plasmid containing the wild type CMVFny-RNA1 and CMVFny-RNA3 in the same amount was used to inoculate Zhongyan 100， Hongda and Nicotiana sylvestris with injection of Agrobacterium. The inoculated plants showed weak infectivity compared with the symptoms of wild type CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3 mixed inoculation. The stability test of the vaccine confirmed that the inserted PVX 200 bp conservative fragment could exist stably. The experiments of CMV and PVX intensity strains showed that the attenuated vaccine could cross protect CMV and PVX of Zhongyan 100 simultaneously.

Keywords： cross protection; cucumber mosaic virus; potato virus X; attenuated vaccines

防治植物病毒病的最有效方法是種植抗病品種，但存在育種周期長(zhǎng)、抗性易喪失等缺點(diǎn)。弱毒交叉保護(hù)是防治植物病毒病的一種有效策略，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系統(tǒng)從而預(yù)防強(qiáng)毒株侵染的一種方法[1-2]。病毒弱毒突變體可以天然存在，也可以通過(guò)分子生物學(xué)手段人工制備獲得。

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV ）是雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員[3]，可侵染100多科1200種植物[4]。CMV 基因組由3條正義單鏈 RNA 組成，分別為 RNA1、RNA2、RNA3。RNA1約3350 nt ，含1個(gè) ORF，編碼111 kDa 的1a 蛋白。 RNA2約3050 nt，含2個(gè)位置部分重疊的 ORF，編碼2a、2b 蛋白[5]。1a、2a 蛋白參與病毒復(fù)制酶復(fù)合體的形成，對(duì)侵染寄主植株的癥狀、傳播、溫度敏感性及與衛(wèi)星 RNA 的互作起決定性作用[6-7]；2b 蛋白強(qiáng)烈抑制寄主植物轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，是病毒編碼的基因沉默抑制因子，對(duì)維持 CMV 的強(qiáng)致病性是必需的，與1a 蛋白協(xié)作于 CMV 在植物體內(nèi)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸[8-10]。RNA3約2190 nt，含移動(dòng)蛋白（MP）和衣殼蛋白（CP）2個(gè) ORF，MP 決定病毒在寄主間的移動(dòng)， CP 通過(guò) RNA3的亞基因組 RNA4翻譯產(chǎn)生，與病毒顆粒組裝、蚜蟲(chóng)傳播、癥狀表達(dá)及寄主抗病毒信號(hào)通路有關(guān)[11-14]。黃瓜花葉病毒的廣寄主特性和基因組多樣性決定了創(chuàng)制CMV 弱毒疫苗的廣泛應(yīng)用價(jià)值。此外，有的 CMV 含有衛(wèi)星 RNA[15]，衛(wèi)星 RNA 是 CMV 基因組以外的遺傳因子，大小在307～405nt 之間，是線型單鏈的非編碼 RNA 分子，干擾病毒的復(fù)制，影響其對(duì)寄主的致病性和癥狀[13，16-18]。

病毒侵染常為復(fù)合侵染，僅對(duì)一種病毒進(jìn)行防治往往效果不好，多種疫苗的混合使用可能會(huì)引起疫苗間相互作用，影響防治效果，因此研制能夠同時(shí)防治多種病毒的單劑弱毒疫苗對(duì)防治植物病毒病具有重要意義。但目前對(duì)于植物病毒疫苗的研制存在疫苗寄主范圍窄、靶標(biāo)病毒譜窄、疫苗遺傳穩(wěn)定性差等多種缺陷。煙草極易被 CMV 侵染，在全世界的煙草主栽區(qū)均有 CMV 的分布和危害[19]。本研究以 CMV 作為基礎(chǔ)載體，在保持2a 蛋白完整的前提下對(duì)2b 蛋白的編碼基因進(jìn)行突變改造，使2b 蛋白的表達(dá)提前終止，并在新的終止密碼子后插入 PVX 的200bp 保守的片段，從而得到含有 PVX 片段的 CMV 弱毒突變體，獲得同時(shí)具備CMV 和PVX 交叉保護(hù)效果的弱毒突變體，以獲得同時(shí)防治煙草 CMV 和 PVX 兩種病毒的弱毒疫苗。

1材料與方法

1.1材料來(lái)源

1.1.1菌株與質(zhì)粒含黃瓜花葉病毒 CMVFny 的 pCB301侵染性克隆質(zhì)粒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授惠贈(zèng)；中煙100、紅花大金元、林煙草均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所惠贈(zèng)。含馬鈴薯 X 病毒（PVX ）（NCBI 登錄號(hào) EU571480）的質(zhì)粒、大腸桿菌 DH5α和農(nóng)桿菌 GV3101均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病毒室保存。

1.1.2引物所用引物見(jiàn)表1。引物 Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F 和Fny2-del2b 3'-B-2661-R 用于構(gòu)建中間載體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT ；引物 PVX-BamH I-5890-F 和 PVX-Sma I -6089-R 用于擴(kuò)增煙草 PVX 基因5890-6089的200 bp 片段；引物 CM-Fny2-2510-F 和 CM-Fny2-2760-R 用于 PCR 擴(kuò)增以驗(yàn)證異源病毒片段遺傳穩(wěn)定性。

1.1.3主要試劑限制性內(nèi)切酶、 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶、 T4 DNA 連接酶、 dNTP 購(gòu)自 TaKaRa 公司；植物總 RNA 提取試劑 TransZol、DNA Marker 購(gòu)自全式金公司；瓊脂糖膠回收試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司；植物總 RNA 提取試劑酚購(gòu)自 Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1 TransZol 法提取植物總RNA 取約1 cm2大小的植物葉片于2 mL 離心管中，加入1 mL TransZol 試劑，用組織研磨儀破碎，室溫靜置5 min；加入0.2 mL 氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min；4 C，13000 r/min 離心15 min，取上清并加入0.5 mL 異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；加入1 mL75%乙醇，劇烈振蕩，4 C 13000 r/min 離心5 min，去除液體；超凈工作臺(tái)內(nèi)晾干，溶解于20～50?L DEPC 處理的無(wú)菌水，-80 C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2中間載體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT 的構(gòu)建構(gòu)建策略見(jiàn)圖1，具體方法如下：

（1）以 CMVFnyRNA2的侵染性克隆質(zhì)粒 pCB301-Fny2為模板，引物 Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F 和Fny2-del2b 3'-B-2661-R 反向PCR 擴(kuò)增。 PCR 條件：98 C變性10 s ，55 C退火5 s ，72 C延伸8 min ，7個(gè)循環(huán)；98 C變性10 s ，68 C 延伸8 min ，25個(gè)循環(huán)；4 C保存。

（2）利用 Dpn I 酶降解（1）反應(yīng)中的質(zhì)粒模板 pCB301-Fny2，反應(yīng)條件為：37 C，2 h；80 C，20 min；擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收。

（3） BamH? I 酶切（2）的回收產(chǎn)物后再次切膠回收，回收產(chǎn)物用T4DNA 連接酶16 C過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α，涂100?g/mL 卡那霉素的 LB 平板，37 C培養(yǎng)8～12h 后做菌落 PCR 和質(zhì)粒酶切鑒定，陽(yáng)性菌落送公司測(cè)序。

1.2.3 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089構(gòu)建

（1） TransZol 法提取 PVX 毒源植物總 RNA，利用引物 PVX-Sma I -6089-R 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：80 C 變性3 min；加反轉(zhuǎn)錄酶，42 C反應(yīng)1.5 h。

（2）反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模版，用引物 PVX-BamH I-5890-F 和 PVX-Sma I-6089-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 條件：94 C預(yù)變性2 min；94 C變性30 s，53 C退火30 s，72 C延伸10 s，30個(gè)循環(huán)；72 C延伸2 min；4 C保存；PCR 產(chǎn)物切膠回收。

（3）質(zhì)粒 pCB301-CMVFny2-del2b 和（2）中獲得的片段經(jīng) BamH I 和 Sma I 雙酶切后，酶切產(chǎn)物回收，用 T4 DNA 連接酶16 C過(guò)夜連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α的感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含100?g/mL 卡那霉素的 LB 平板培養(yǎng)， PCR 篩選和酶切鑒定后陽(yáng)性菌落送公司測(cè)序。

1.2.4農(nóng)桿菌注射接種（1）活化菌液：將保存于-80 C的農(nóng)桿菌菌液，在含卡那霉素（Kanr ）（50?g/mL）和利福平（Rif）（100?g/mL）的固體 LB 培養(yǎng)基上劃線，28 C倒置培養(yǎng)48 h ，長(zhǎng)出單菌落。

（2）挑取單菌落在含 Kanr （50?g/mL）和 Rif（100?g/mL）抗生素的固體LB 培養(yǎng)基上劃線28℃倒置活化培養(yǎng)24h，做菌落 PCR 鑒定。

（3）小搖：用滅菌牙簽挑?。?）的陽(yáng)性菌落，放入3 mL 含 Kanr （50?g/mL）和 Rif（100?g/mL）的 LB 液體培養(yǎng)基，28 C，220 r/min 水平振蕩培養(yǎng)24 h。

（4）大搖：取300～600?L （3）的菌液，加入30 mL 含 Kanr （50?g/mL）和 Rif （100?g/mL）的 LB 液體培養(yǎng)基，28 C，220 r/min 水平振蕩培養(yǎng)12 h。

（5）集菌：將（4）的菌液28 C，4000 r/min 離心15 min ，棄上清。

（6）重懸：用10 mmol/L MgCl2[加入10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES）、150?mol/L 乙酰丁香酮（AS）]農(nóng)桿菌重懸液將（5）的菌重懸，調(diào)整接種混合樣濃度至 OD600=0.4～0.6，28 C靜置3～12 h。

（7）注射：用1 mL 一次性注射器去針頭吸取1 mL （6）的菌液，在煙草葉片背面葉脈之間利用無(wú)針頭注射器壓力注射菌液接種，每片葉子浸潤(rùn)面積約為2/3，每株煙草注射2片葉，每處理注射3株煙草；注射后25 C溫室培養(yǎng)。

2結(jié)果

2.1疫苗載體構(gòu)建

2.1.1中間載體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT 的構(gòu)建菌落 PCR 鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒用BamH I 和 Sma I 進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切結(jié)果顯示質(zhì)粒可以被這2個(gè)酶線性化，且線性化質(zhì)粒長(zhǎng)度約為7.6kb，確認(rèn)得到中間載體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT （圖2）；同時(shí)質(zhì)粒的 DNA 測(cè)序及序列比對(duì)證實(shí)成功插入了終止密碼子和酶切位點(diǎn)序列（圖3）。獲得質(zhì)粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT。

2.1.2? 含 PVX 片段的質(zhì)粒突變體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的構(gòu)建菌落 PCR 鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒用BamH I 和 Sma I 進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切結(jié)果顯示有約200 bp 的酶切條帶，并且剩余的酶切片段大小約為7.6 kb （圖4）；同時(shí)質(zhì)粒的 DNA 測(cè)序及序列比對(duì)證實(shí)成功插入了 PVX 的200bp 序列（圖5）。獲得質(zhì)粒 pCB301-CMVFny- R2-2bPT-PVX5890-6089。

2.2生物學(xué)效應(yīng)驗(yàn)證

2.2.1 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的生物學(xué)效應(yīng)野生型 CMVFnyRNA1、CMVFnyRNA2、 CMVFnyRNA3等比例混勻作為正對(duì)照，野生型 CMVFnyRNA1、CMVFnyRNA3和 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089等比例混勻作為試驗(yàn)處理組，通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法分別注射侵染中煙100、紅花大金元和林煙草。接種10 d 后觀察癥狀，顯示接種野生型 CMVFnyRNA1/RNA2/RNA3的3種煙草都出現(xiàn)葉片皺縮、植株矮化癥狀；接種 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3與健康對(duì)照基本一致，無(wú)明顯病毒病癥狀。表明 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089? 為 CMV RNA2的弱毒突變體（圖6）。

2.2.2 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的遺傳穩(wěn)定性分析為檢測(cè)突變體接種煙草后的遺傳穩(wěn)定性，分別在接種中煙100、紅花大金元和林煙草后第3、5、7、9天取被注射煙草葉片的上部葉片利用引物 CM-Fny2-2510-F 和 CM-Fny2-2760-R 做 RT-PCR 檢測(cè)異源病毒插入片段。 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089接種第3、5、7、9天，在被注射煙草植株葉片上部葉片中均可檢測(cè)到病毒 PVX 片段，表明接種突變體在煙草體內(nèi)具有遺傳穩(wěn)定性（圖7）。

2.2.3 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的交叉保護(hù)效果通過(guò)農(nóng)桿菌注射的方法，分別對(duì)預(yù)接種 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3及正常生長(zhǎng)的中煙100接種 CMV 和 PVX 強(qiáng)病毒測(cè)試交叉保護(hù)效果測(cè)試。結(jié)果顯示，CMV 和 PVX 強(qiáng)毒接種的健康中煙100，植株整體矮小，葉片呈現(xiàn)深淺綠相間花葉癥狀和典型的 CMV 侵染的鼠尾狀特征； CMV 和 PVX 強(qiáng)病毒接種預(yù)接種 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3的中煙100，植株生長(zhǎng)狀態(tài)良好，株高與健康對(duì)照基本一致，葉片表現(xiàn)微弱花葉癥狀，說(shuō)明預(yù)接種 RNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3的對(duì) CMV 和 PVX 同時(shí)具有較好的交叉保護(hù)防治效果，可作為兼抗 PVX 的 CMV 弱毒疫苗（圖8）。

3討論

影響交叉保護(hù)效果的因素有很多，例如株系?；浴⑦z傳穩(wěn)定性、保護(hù)間隔期長(zhǎng)短、與其他病毒的協(xié)生性等[20-22]。另外當(dāng)弱毒突變體在體內(nèi)達(dá)到一定的積累閾值時(shí)，才能夠啟動(dòng)植物的防御反應(yīng)，產(chǎn)生交叉保護(hù)效果，有效預(yù)防強(qiáng)毒株系的侵染[21]。并且，弱毒疫苗在交叉保護(hù)中是一個(gè)寄主-介體-環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的體系，一旦這個(gè)體系發(fā)生改變，交叉保護(hù)機(jī)制就會(huì)遭到破壞甚至是弱毒變?yōu)閺?qiáng)毒[23]。同時(shí)在病毒的不斷進(jìn)化中，弱毒存在恢復(fù)為強(qiáng)毒的可能性，RNA 病毒通過(guò)重組進(jìn)化將同源或異源的病毒重組重配導(dǎo)致病毒致病力更強(qiáng)、寄主范圍更廣[24-25]。因此，對(duì)于弱毒疫苗的研究應(yīng)用需要從多個(gè)角度多個(gè)層面驗(yàn)證。本研究中創(chuàng)制的弱毒疫苗預(yù)接種煙草10 d 后用靶標(biāo)強(qiáng)毒株系進(jìn)行攻毒，發(fā)現(xiàn)預(yù)接種弱毒突變體的植株再進(jìn)行靶標(biāo)強(qiáng)毒接種比直接接種強(qiáng)毒的植株長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)、株高正常、葉片生長(zhǎng)狀態(tài)良好，說(shuō)明弱毒突變體在接種后10 d 在體內(nèi)達(dá)到了一定量的積累，能預(yù)防靶標(biāo)強(qiáng)毒株系的侵染，起到交叉保護(hù)效果。本研究中通過(guò)農(nóng)桿菌注射的方法進(jìn)行的疫苗接種，疫苗接種量大，效果明顯，田間自然發(fā)病的病毒劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試驗(yàn)處理濃度，因此對(duì)接種疫苗濃度還需要進(jìn)行優(yōu)化提高利用效率同時(shí)降低成本。本研究對(duì)疫苗的遺傳穩(wěn)定性做了初步室內(nèi)驗(yàn)證，研究結(jié)果表明室內(nèi)條件下弱毒疫苗在10 d 內(nèi)遺傳穩(wěn)定。但是，遺傳穩(wěn)定性以及病毒的重組重配是受多種機(jī)制因素影響的，所以對(duì)于疫苗的遺傳穩(wěn)定性研究還需要進(jìn)行不同環(huán)境條件不同寄主以及不同時(shí)間等多方面的研究驗(yàn)證。目前所有數(shù)據(jù)均為室內(nèi)試驗(yàn)獲得且環(huán)境相對(duì)單一，在田間生產(chǎn)中自然環(huán)境的多樣性會(huì)對(duì)病毒發(fā)生及疫苗效果產(chǎn)生較大的影響，弱毒疫苗的田間應(yīng)用效果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4結(jié)論

本研究構(gòu)建了含馬鈴薯 X 病毒（PVX）片段的黃瓜花葉病毒（CMV） RNA2弱毒突變體質(zhì)粒載體 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089，該質(zhì)粒載體與含野生型 CMVFnyRNA1和 CMVFnyRNA3的質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌浸潤(rùn)方法混合接種中煙100、紅花大金元以及林煙草等品種，證明插入的 PVX 200 bp 保守片段在突變體中穩(wěn)定存在，并顯示弱致病癥狀。在中煙100中驗(yàn)證了該疫苗同時(shí)具備對(duì) CMV 和 PVX 的交叉保護(hù)效果。

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