曹玉珠, 賈其輝, 邢雨欣, 夏天, 王丹丹, 張珂,王陽陽, 田亞東,2,3, 康相濤,2,3, 劉小軍,2,3, 李紅,2,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院,河南 鄭州 450046;2.河南省家禽育種國際聯(lián)合實驗室,河南 鄭州 450046;3.河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室,河南 鄭州 450046)

成纖維細胞生長因子[1-2](fibroblast growth factor, FGF)是一種能夠調(diào)節(jié)細胞增殖和分化的多肽,由多個受體和配體組成,廣泛分布于機體多個組織和器官中[3]。FGF家族作為多功能蛋白家族,對不同類型的細胞作用不同,因此也被稱為混雜生長因子[4-5]。在哺乳動物上FGF家族有23個成員,各成員之間具有一定的序列同源性和結構相似性[6]。作為具有多種功能的信號分子,FGF家族參與了多種重要的生物學過程,包括生長發(fā)育[7-10]、血管形成[11-12]、細胞分化[13]、細胞增殖和細胞凋亡[14]、調(diào)節(jié)鈣磷平衡[15]、葡萄糖代謝平衡[16]及組織損傷修復[17-18]等。目前,FGF家族成員的相關研究主要集中在哺乳動物上,而對于該家族成員在雞上的生物學特性研究較為少見。通過整合相關肝臟轉錄組數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn),雞FGF家族存在19個成員[19]。在此基礎上,對雞FGF家族19個成員進行系統(tǒng)研究,利用氨基酸序列分析構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹、預測保守基序和蛋白質(zhì)結構;基于基因組重測序數(shù)據(jù),利用該家族成員上的遺傳變異位點對10個雞品種的形成分類貢獻進行了主成分分析;利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術分析了FGF家族在固始雞脂質(zhì)代謝相關器官上的表達分布,以及在20周齡和30周齡盧氏雞肝臟的表達水平變化;分別在細胞水平和活體水平研究了雌激素對雞肝臟FGF表達的影響;將FGF19基因上的遺傳變異與固始雞不同階段的產(chǎn)蛋量進行了關聯(lián)分析。本研究為進一步探究FGF家族相關成員的功能奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品及重測序數(shù)據(jù)收集

試驗對象(固始雞)來自河南農(nóng)業(yè)大學原陽種質(zhì)資源場,在相同飼養(yǎng)管理環(huán)境下,自由采食和飲水。將43周齡體質(zhì)量相近的健康固始雞(n=8)頸部放血處死,采集肝臟、腎臟、卵巢、腹脂和十二指腸,放在液氮中,存于-80 ℃冰箱,用于基因組織表達譜分析。試驗過程均在河南農(nóng)業(yè)大學機構動物護理和使用委員會(Institutional animal care and use committee, IACUC)(編號 11-0085)批準下進行。

20周齡(n=8)和30周齡(n=8)的盧氏雞肝臟及對應的轉錄組數(shù)據(jù)由河南省雞種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用重點實驗室(以下簡稱實驗室)保存提供[19]。雌激素處理組(n=8)和對照組(n=8)10周齡盧氏雞的肝臟及對應的高通量數(shù)據(jù)[20]用于基因表達驗證。

重測序數(shù)據(jù)包括肉雞(科寶KB,n=30)、蛋雞(白來航WL和洛島紅RIR,n=20)、地方雞(固始雞GS、盧氏雞LS、淅川烏骨雞XCBB和正陽三黃ZYSH,n=40)和野生型雞(紅原雞RJF,n=5)。其中,KB重測序數(shù)據(jù)由中國農(nóng)業(yè)大學提供,WL、RIR和RJF重測序數(shù)據(jù)從公共數(shù)據(jù)集獲取[21],其他4個河南省地方品種重測序數(shù)據(jù)由實驗室前期測序所得[22],用于主成分分析。

900只固始雞的重測序數(shù)據(jù),以及對應的21～25周齡、26～30周齡、31～35周齡、36～43周齡和21～43周齡不同階段的產(chǎn)蛋數(shù)均由實驗室保存提供[23],用于基因的遺傳變異與表型的關聯(lián)分析。

1.2 雞肝癌細胞系培養(yǎng)與處理

使用10%完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗、89%DMEM/F12培養(yǎng)基)在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)雞肝癌細胞系(leghorn male hepatoma cell line, LMH),待細胞融合80%時,采用細胞計數(shù)的方法以1×106個·mL-1的細胞密度接種至12孔板中,放入37 ℃、體積分數(shù)5% CO2和95%空氣的標準培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h,待細胞融合度為70%～80%時,用PBS液洗滌1次,用不含雙抗的完全培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基。根據(jù)徐春林等[24]研究結果,選取最佳處理濃度100 nmol·L-1的17β-雌二醇(Sigma,美國)處理雞肝癌細胞系LMH,對照組用等量的無水乙醇處理,24 h后用Trizol裂解液收集細胞,存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)試驗。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載人、鼠、雞、斑馬魚、非洲爪蟾、火雞和野鴨7個物種FGF家族的氨基酸序列。使用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)對雞FGF家族進行氨基酸保守基序分析,保守基序個數(shù)設置為10,其余參數(shù)采用默認值;利用MEGA11.0軟件中的鄰接法構建不同物種間FGF家族系統(tǒng)發(fā)育樹,基于ClustalW氨基酸序列比對結果,檢驗算法中Bootstrap method設置為2 000,其余參數(shù)采用默認值;使用SMART在線軟件(http://smart.embl.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)對雞FGF家族各成員的蛋白質(zhì)功能結構域進行預測。

1.4 引物設計及合成

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的雞FGF1～FGF10、FGF12～FGF14、FGF16、FGF18～FGF20、FGF22～FGF23基因和內(nèi)參基因GAPDH(GenBank)的mRNA序列,采用BLAST-Primer在線軟件設計qRT-PCR引物(表1)。引物由尚亞生物公司(上海)合成。

表1 qRT-RCR引物信息

1.5 總RNA提取和反轉錄

參照Trizol試劑盒(南京,諾唯贊)說明書提取器官和細胞總RNA,分別利用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000紫外分光光度計檢測RNA質(zhì)量,并稀釋至相同的濃度,按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(南京,諾唯贊)說明書反轉錄合成cDNA,-20 ℃保存。

1.6 qRT-PCR反應

根據(jù)QuantiFast SYBR Green PCR試劑盒(南京,諾唯贊)說明書,以GAPDH基因作為內(nèi)參基因,利用qRT-PCR技術檢測基因的相對表達水平。qRT-PCR反應體系:2×QuantiFast SYBR Green Master Mix 5 μL,10 μmol·L-1上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,用無RNase水補足至 10 μL。qRT-PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,最適溫度60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s,共35個循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔΔct方法計算基因相對表達量。使用SPSS軟件對基因驗證的定量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和t檢驗,P<0.05表示組間差異顯著,P>0.05表示組間無差異,使用GraphPad Prism軟件作圖。

利用R軟件中的FactoMine和Factoextra包對FGF家族的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點進行主成分分析并繪圖。利用SPSS軟件中的混合線性模型進行關聯(lián)分析,結果以平均值±標準誤表示,不同基因型之間采用成對比較,顯著性用小寫字母表示;單變量檢驗顯著性用P值表示,P<0.01為差異極顯著,P<0.05為差異顯著,P>0.05為無差異。

2 結果與分析

2.1 雞FGF家族系統(tǒng)發(fā)育進化樹

為探討雞FGF家族的進化關系,利用NCBI數(shù)據(jù)庫公布的人、鼠、雞、斑馬魚、非洲爪蟾、火雞和野鴨7個物種FGF家族的氨基酸序列進行親緣進化分析。如圖1所示,不同物種的FGF家族成員聚類為3個分支。其中,FGF3、FGF7、FGF10和FGF22聚在1個分支,FGF15、FGF19、FGF21和FGF23聚在1個分支,其余成員聚在1個分支中。

FGF1～FGF23為FGF家族氨基酸序列;英文為7個不同物種(人、鼠、雞、斑馬魚、非洲爪蟾、火雞和野鴨)。

2.2 雞FGF家族的保守基序分析

利用在線軟件MEME對雞FGF家族成員進行了保守基序預測,如圖2所示。FGF家族有10個保守基序,Motif 1(SVAVGVVAIKGVKSGLYLAMNKKGKLYGS)保守程度最高,為FGF家族成員共有;Motif 2和Motif 3保守程度較高;FGF22基因不存在Motif 2,FGF18基因不存在Motif 3;FGF22和FGF23基因不存在Motif 4;8個成員含有Motif 5,10個成員含有Motif 6,12個成員含有Motif 7。其中,Motif 8僅存在于FGF12、FGF13和FGF14基因中,Motif 9僅存在于FGF7和FGF10基因中,而Motif 10僅存在于FGF9、FGF16和FGF20基因中。

圖2 雞FGF家族保守基序預測

2.3 雞FGF家族蛋白功能結構域分析

利用SMART軟件對FGF家族的氨基酸序列進行蛋白功能結構域預測,進一步探究雞FGF家族潛在的生物學功能,結果如圖3-A所示。FGF家族成員都含有1個相同的核心區(qū)域(FGF),其中FGF6、FGF7和FGF10具有跨膜區(qū)。進一步探究雞2個內(nèi)分泌型成員FGF19和FGF23與人和鼠之間的結構相似性,結果如圖3-B所示。人、鼠和雞的FGF19、FGF23都有共同的結構域,但只有人FGF19有跨膜區(qū)。

A:雞FGF家族功能結構域;B:FGF19和FGF23在人、鼠、雞上的功能結構域分析;數(shù)字表示氨基酸位置。

2.4 雞FGF家族在不同品種間的主成分分析

基于實驗室保存的10個品種雞的基因組重測序數(shù)據(jù)[22],進一步對雞FGF家族各成員的遺傳變異位點進行分析。對雞FGF家族各成員所有SNP位點進行主成分分析,選擇總方差解釋31.89%的前2的2個主成分(PC1、PC2)使用R繪圖。如圖4所示,雞FGF家族成員所有的SNP位點可以明顯將肉雞和蛋雞品種分開。

圖4 FGF家族所有SNP位點的主成分分析

2.5 雞FGF家族基因在不同器官中表達分布

為了分析雞FGF家族成員的表達模式,對其在43周齡固始雞的肝臟、腎臟、卵巢、腹脂和十二指腸中的mRNA表達水平進行分析。如圖5所示,雞FGF家族基因在檢測的各個器官中均有表達。其中,FGF4和FGF23基因在肝臟中表達水平較高;FGF12基因在腎臟表達較高;FGF20基因在卵巢中表達水平較高;FGF1、FGF6、FGF7、FGF9、FGF10、FGF13、FGF14和FGF19基因在十二指腸中表達水平較高;FGF2、FGF3、FGF5、FGF8、FGF12、FGF16、FGF18和FGF22基因在腹脂中表達水平較高。

圖5 雞FGF家族基因在不同器官中的表達分析

2.6 雞FGF家族基因在雞肝臟中的表達模式

使用實驗室前期盧氏雞產(chǎn)蛋前期(20周齡)和產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)肝臟轉錄組數(shù)據(jù),探討雞FGF家族基因在雞肝臟中的表達特性,如表2所示。轉錄組數(shù)據(jù)中有12個FGF家族基因在雞肝臟中表達。其中,FGF19和FGF23基因在30周齡的FPKM值極顯著高于20周齡。利用qRT-PCR進一步在盧氏雞20周齡和30周齡的雞肝臟中對FGF19和FGF23基因表達水平進行驗證,如圖6所示。FGF19基因在30周齡雞肝臟中的相對于GADPH表達量顯著高于20周齡,而FGF23基因在20周齡和30周齡雞肝臟中相對于GADPH表達量無顯著變化,但在30周齡有升高趨勢,這與轉錄組結果一致。

A: FGF19和FGF23基因在轉錄組數(shù)據(jù)中的變化倍數(shù)(20周齡/30周齡);B、C:FGF19和FGF23基因在20周齡和30周齡盧氏雞肝臟中的相對表達水平。誤差線表示標準差,*表示P<0.05,NS表示P>0.05。

表2 雞FGF家族基因在盧氏雞肝臟轉錄組測序數(shù)據(jù)中的FPKM值

2.7 17β-雌二醇對雞FGF家族基因表達的影響

使用實驗室前期雌激素處理個體的肝臟高通量數(shù)據(jù),探討雌激素對雞FGF家族基因的表達特性。在高通量數(shù)據(jù)中查找發(fā)現(xiàn)(圖7-A),雌激素處理組FGF19和FGF23基因的表達豐度顯著高于對照組。為了進一步驗證雌激素對雞FGF家族基因表達的影響,用100 nmol·L-1的17β-雌二醇處理LMH細胞系24 h。qRT-PCR分析結果表明,雌激素可顯著上調(diào)雌激素應答標志基因(ApoVLDLⅡ)的表達,表明外源雌激素發(fā)揮了生物學功能(圖7-B)。與對照組相比,雌激素處理組FGF19基因的表達水平顯著上調(diào),而FGF23基因的表達顯著下調(diào)(圖7-C～D)。

A:FGF19和FGF23基因在雌激素處理個體肝臟高通量數(shù)據(jù)中的變化倍數(shù)(雌激素處理組/對照組);B:雌激素處理LMH對標志基因ApoVLDLII表達的影響;C,D:分別表示雌激素處理LMH對FGF19和FGF23基因表達的影響。誤差線表示標準差,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2.8 雞FGF19基因遺傳變異位點與不同階段產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

使用實驗室保存的900只固始雞重測序數(shù)據(jù)對FGF19基因進行分析,獲得5個SNP位點,分別是rs17814792、rs17816980、rs17814792、rs17814446和rs17811770,除了rs17814792和rs17814792在固始雞群體中有2種基因型外,其余3個SNPs位點均有3種基因型存在(表3)。將這5個位點的不同基因型分別與固始雞不同階段的產(chǎn)蛋數(shù)進行關聯(lián)分析。如表4—表8所示,rs17814792與21～25周齡和21～43周齡產(chǎn)蛋量存在極顯著相關、與26～30周齡產(chǎn)蛋量存在顯著相關,rs17816980與36～43周齡產(chǎn)蛋量存在極顯著相關,rs17817557與21～25周齡和21～43周齡產(chǎn)蛋量存在極顯著相關、與26周齡～30周齡產(chǎn)蛋量存在顯著相關,rs17814446與不同時期的產(chǎn)蛋量不差異,rs17811770與21～25周齡和21～43周齡產(chǎn)蛋量存在顯著差異。

表3 FGF19基因上SNP位點信息

表4 FGF19基因遺傳變異位點(rs17814792)與固始雞產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

表5 FGF19基因遺傳變異位點(rs17816980)與固始雞產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

表6 FGF19基因遺傳變異位點(rs17817557)與固始雞產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

表7 FGF19基因遺傳變異位點(rs17814446)與固始雞產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

表8 FGF19基因遺傳變異位點(rs17811770)與固始雞產(chǎn)蛋量的關聯(lián)分析

3 結論與討論

FGF家族是高度保守的多基因家族,迄今為止已經(jīng)在多個物種中被鑒定,在個體發(fā)育中起著重要作用,可以調(diào)節(jié)動物的發(fā)育和生理過程[25-26]。目前,FGF家族成員在人,小鼠、牛、絨山羊、斑馬魚、擬南芥和人參等多個動植物中已有研究。本研究首次對雞FGF家族的生物學特性及雌激素對該家族成員的表達調(diào)控進行了系統(tǒng)研究。

本研究利用雞基因組數(shù)據(jù)庫中已注釋的19個FGF家族基因進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn),該家族均具有SVAVGVVAIKGVKSGLYLAMNKKGKLYGS的保守序列和1個相似的FGF功能結構域。此外,FGF19在人上有跨膜區(qū),而在雞和小鼠上沒有跨膜區(qū);在系統(tǒng)進化樹分析中,FGF19在人、小鼠和雞不在同一小支。這表明FGF19可能在3個物種中的生物學功能不同。

為更深一步了解FGF家族基因成員,利用10個雞品種的重測序數(shù)據(jù)對該家族基因成員進行主成分聚類分析,19個基因在基因組范圍全部SNP位點可以將蛋雞和肉雞分類,推測該家族可能對雞繁殖或者生長性狀形成有重要的影響。ANDERSON等[27]研究表明,FGF3和FGF4基因在小鼠的發(fā)育過程中起著重要的作用。FGF4基因在肝臟表達量最高,且FGF4基因能夠增強脂肪酸氧化、減少肝細胞凋亡和減輕肝損傷[28],影響肝臟脂代謝。FGF16基因在腹脂中表達量較為豐富。HUANG等[29]研究發(fā)現(xiàn),山羊FGF16基因通過受體FGFR4表達介導脂肪細胞分化,暗示FGF16基因在脂肪形成中發(fā)揮著一定作用。PORTELA等[30]在健康牛閉鎖卵泡的研究中,檢測到黃體細胞FGF18基因高表達,推測FGF18基因可能參與顆粒細胞的凋亡。卵巢發(fā)育相關研究表明,FGF2、FGF7以及FGF10等基因具有促進有絲分裂的作用。PORTELA等[31]證明了FGF18基因能促進細胞凋亡,最終導致卵泡閉鎖。

目前,已經(jīng)報道了FGF家族各成員在多種動物中各有不同的表達特性[32],具有明顯的器官特異性,說明該家族可能參與不同器官的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn),FGF基因在各器官中均有表達,大部分基因在十二指腸中表達量最高;十二指腸是小腸消化吸收的重要部位,推測其在雞生長發(fā)育中具有重要作用。有研究證明,FGF13和FGF14基因與牛的生長相關,FGF4和FGF23基因在肝臟中表達量較高[7-8]。此外,FGF23基因在哺乳動物的骨中表達量顯著高于其他組織[33-35],在肝臟中表達量極低。FGF23基因在雞的各器官中廣泛分布,肝臟表達量最高,在心臟和腎臟等中表達量相對較低[36]。FGF23基因通過AMPK/乙酰輔酶α羧化酶和ERK1/2胞內(nèi)通路作用于骨骼肌細胞和肝細胞,從而影響游離脂肪酸和脂質(zhì)的代謝過程,間接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[37-39]。肝臟是雞脂質(zhì)代謝的中心場所,表明雞FGF23基因在肝臟脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要的作用。

FGF19基因在基因30周齡雞肝臟中的表達水平顯著高于20周齡,而FGF23基因表達量無顯著變化但在30周齡有上升的趨勢。在產(chǎn)蛋高峰期,雞肝臟中FGF19基因表達量顯著高于產(chǎn)蛋前期。FGF19基因是FGF21和FGF23基因亞家族的成員,該家族成員都是營養(yǎng)代謝的重要調(diào)節(jié)器,對肝素的親和力低,這使得其能夠逃離細胞外基質(zhì),作為內(nèi)分泌激素循環(huán)[40-41]。研究發(fā)現(xiàn),FGF19基因作為一種回腸來源的腸因子,能夠控制膽汁酸代謝[42]。陸江等[43]研究表明,膽汁酸可能抑制脂肪酸的從頭合成,促進肝臟脂肪酸β-氧化,從而降低海蘭褐蛋雞血液和肝臟中的甘油三酯含量。KIR等[44]證明了FGF19基因刺激肝臟蛋白和糖原合成,但不誘導脂肪生成,FGF19基因激活了胰島素獨立的內(nèi)分泌通路,調(diào)節(jié)了肝臟蛋白和糖原代謝。BHATNAGAR等[45]利用肥胖小鼠模型證實了FGF19基因抑制胰島素激活肝臟脂肪酸合成,這是控制肝臟、血液和脂肪中的三酰甘油積累的關鍵過程。KIR等[46]還發(fā)現(xiàn),FGF19基因誘導蛋白質(zhì)和糖原合成并抑制肝臟中的糖異生,對肝臟代謝產(chǎn)生有益的作用。這些表明FGF19基因可能參與雞肝臟脂質(zhì)代謝。對于蛋雞來說,脂肪在肝臟中合成以后,轉化為極低密度脂蛋白定向轉運到肝臟外。極低密度脂蛋白作為卵黃前體物質(zhì)運輸?shù)铰殉矁?nèi),形成卵泡,最終形成蛋黃。主成分分析結果顯示,FGF19基因可以將蛋雞和肉雞分類,且FGF19基因上的5個SNP位點(rs17814446除外)均與固始雞產(chǎn)蛋量顯著相關。這表明FGF19基因可能通過調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝從而影響蛋雞的產(chǎn)蛋性能。

雌激素是機體代謝的一種重要調(diào)控因子,不僅可以調(diào)控卵黃前體相關合成基因的表達,還可以調(diào)控脂蛋白分解[46]。產(chǎn)蛋期雌激素可促進雞肝中ApoB及其他卵黃前體物的合成。雌激素可上調(diào)青年雞肝臟FGF19和FGF23基因的表達,在細胞水平上驗證雌激素可調(diào)控FGF19和FGF23基因的表達,但雌激素處理LMH細胞后FGF19基因表達量顯著升高,FGF23基因表達量顯著下降。FGF23基因在細胞水平上的結果與高通量數(shù)據(jù)相反,推測FGF23基因在個體和細胞水平上的作用方式不同,具體的作用機制還需進一步研究。

FGF家族成員在肉雞和蛋雞品種形成中有重要貢獻,各成員在肝臟、腎臟、卵巢、腹脂和十二指腸脂質(zhì)代謝相關器官中均表達。FGF19基因能夠?qū)⒌半u和肉雞進行分類,在雞產(chǎn)蛋高峰期肝臟表達量高于產(chǎn)蛋前期,且與固始雞不同產(chǎn)蛋期產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關,暗示FGF19基因?qū)﹄u產(chǎn)蛋性能有重要的作用。本研究結果為進一步研究FGF19基因及其他成員的生物學功能及作用機制奠定基礎。