朱鶴然,趙國洪,趙碧,王帥,4,趙津*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南 昆明 650224; 2.玉溪農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,云南 玉溪 653106;3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,云南 昆明 650205; 4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南 昆明 650201)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)感染引起的,一種以各日齡豬的水樣腹瀉、嘔吐、脫水、厭食、體重減輕甚至死亡為主要臨床癥狀的高度接觸性腸道傳染病,該病病程短、發(fā)病迅速,對哺乳仔豬極易造成高死亡率,給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大損失[1]。1977年P(guān)ED最早在英國報(bào)道,之后在世界各地廣泛傳播[2]。經(jīng)過長期的流行,PEDV進(jìn)化出具有更強(qiáng)毒力、傳染性和致病性的變異毒株。從2010年下半年開始,我國的華南地區(qū)開始出現(xiàn)新型高致病性PED暴發(fā),并很快傳播到全國各地[3,4]。云南省近年來PEDV流行變異程度上有增強(qiáng)的趨勢,調(diào)查表明,2021年引起云南曲靖某豬場PED的PEDV與AJ1102和CV777 疫苗株遺傳序列存在差異[5];云南分離的PEDV YNDH-2017株與近年來國內(nèi)流行的PEDV毒株親緣關(guān)系較近,而與CV777疫苗株分處在不同的兩大分支上,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[6];云南省2017—2022年分離的PEDV和疫苗株間存在較遠(yuǎn)的遺傳和親緣關(guān)系,流行毒株存在一定的基因多樣性[7]。

PEDV屬于冠狀病毒科α冠狀病毒屬,基因組約30Kb的單股正鏈RNA有囊膜病毒,具有7個(gè)開放閱讀框編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白:M蛋白(膜蛋白)、S蛋白(刺突蛋白)、N蛋白(核衣殼蛋白)和E蛋白(包膜蛋白)。M蛋白是病毒包膜的組成成分,其編碼基因全長約681bp,高度保守[4],M蛋白參與病毒顆粒的組裝和釋放,刺激機(jī)體產(chǎn)生α干擾素以及特異性保護(hù)抗體[8],M基因是PEDV分群的重要依據(jù)[9,10]。

為調(diào)查云南PEDV分子流行病學(xué)與遺傳進(jìn)化情況,建立RT-qPCR方法,對2020—2022年從玉溪市4個(gè)養(yǎng)豬場采集的臨床腹瀉樣品進(jìn)行檢測,調(diào)查PEDV的流行情況。對陽性樣品,進(jìn)一步采用RT-PCR方法擴(kuò)增樣品的M基因序列,比較分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系,旨在從分子水平了解玉溪市流行毒株的遺傳變異規(guī)律,為玉溪市PED防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品來源

2020—2022年采自玉溪市4個(gè)豬場的腹瀉糞便和腸組織臨床樣品。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank收錄的PEDV毒株M基因序列,對不同基因型PEDV的M基因進(jìn)行多序列比對,自行設(shè)計(jì)檢測PEDV的引物PEDV-M-F/PEDV-M-R和擴(kuò)增M基因全長的引物PEDV-AL-M-F/PEDV-AL-M-R。引物序列見表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PEDV RT-qPCR檢測引物和M基因全長擴(kuò)增引物

1.3 病毒RNA提取和cDNA合成

將33份小腸組織剪碎,取30mg樣品加入500μL滅菌生理鹽水,充分研磨后將混合液吸入1.5mL潔凈EP管中,并加入1mL Trizol (Takara公司),充分混勻。4℃條件下8000r/min離心3min,取1mL上清提取病毒總RNA后,用50μL DEPC水溶解RNA,最后用FastKing RT Kit(With gDNase)試劑盒(TIANGEN公司)合成病毒cDNA。

1.4 PEDV qPCR檢測

以上述合成的cDNA為模板,采用本實(shí)驗(yàn)室建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測PEDV,引物對為PEDV-M-F/PEDV-M-R。反應(yīng)體系:qPCR Super Mix 10μL(全式金公司),cDNA 1μL,ddH2O 7μL,以及上、下游引物各1μL,PCR總體系為20μL。反應(yīng)程序:95℃ 5min;95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 30s,40個(gè)循環(huán);72℃ 10min。

1.5 PEDV遺傳進(jìn)化分析

以RT-qPCR檢測為陽性的cDNA樣品為模板,用引物PEDV-AL-M-F/PEDV-AL-M-R擴(kuò)增PEDV M基因,反應(yīng)體系為20μL,其中PCR Mix 10μL(生工生物公司),cDNA 1μL,ddH2O 7μL,上、下游引物各1μL。反應(yīng)程序:95℃ 5min;95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s,40個(gè)循環(huán);72℃ 10min。4℃保存。取20μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照觀察記錄結(jié)果,目標(biāo)條帶膠回收送測序。將目標(biāo)條帶連接在pMD18-T載體,作為PEDV檢測的陽性對照。測序結(jié)果利用DNA star軟件進(jìn)行分析、關(guān)鍵變異位點(diǎn)比對,利用MEGA 7.0構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。20株來源于GenBank的參考毒株信息見表2。

表2 PEDV參考毒株信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV RT-qPCR檢測結(jié)果

對采集的33份疑似豬腹瀉的樣品進(jìn)行RT-qPCR檢測,當(dāng)Ct值≤35時(shí),擴(kuò)增曲線呈典型的S型,熔解曲線為單一峰,且陽性對照和陰性對照均成立,判定為PEDV陽性。結(jié)果顯示,檢出PEDV陽性病料13份,PEDV陽性檢出率為39.39%(13/33),檢測結(jié)果見圖1。

A:樣品擴(kuò)增曲線;B:熔解曲線。

2.2 PEDV M基因擴(kuò)增

以RT-qPCR方法檢測結(jié)果為陽性的PEDV 樣品cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增全長M基因,獲得721bp與預(yù)計(jì)目標(biāo)片段大小一致的條帶(圖2),檢出的13份PEDV陽性病料的M基因序列結(jié)果一致,將其命名為PEDV/YX-2021。

M:250 bp DNA Ladder;1:PEDV樣本PCR產(chǎn)物;2:陽性對照;3:陰性對照。

2.3 PEDV M基因遺傳進(jìn)化分析

基于PEDV/YX-2021 M基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹,分析表明,PEDV/YX-2021與國內(nèi)流行的變異株AH2012、AJ1102和LW/L疫苗株、美國分離的高致病性毒株USA/Colorado/2013等親緣關(guān)系較近,處于同一進(jìn)化分支上,而與大部分屬于G1型的代表性毒株如CV777、SD-M、Attenuated DR13親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。表明PEDV/YX-2021屬于G2型流行變異株,與PEDV 疫苗毒株CV777等早期毒株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn),與近年P(guān)EDV流行株遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

圖3 基于PEDV M基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹

2.4 PEDV M基因氨基酸同源性分析

比較PEDV/YX-2021株與其他不同地區(qū)、不同基因型的參考毒株氨基酸序列,結(jié)果表明,PEDV/YX-2021與參考毒株同源性為96.48%～99.56%,其中G1基因型來源的經(jīng)典株CV777氨基酸同源性為98.24%,與LZC序列同源性最低為96.48%;與G2型來源的AH2012、JS-HZ2012、E16-39、PEDV-FJ-Fuzhou、USA/Colorado/2013的同源性最高為99.56%。PEDV/YX-2021與經(jīng)典株CV777相比,氨基酸有4個(gè)變異位點(diǎn)(13:E→Q;42:V→A;129:V→I;214:A→S)。其中第129位氨基酸變異位點(diǎn)(V→I)為PEDV/YX-2021株所特有;第13(E→Q)、42(V→A)氨基酸變異位點(diǎn)主要存在于變異株與PEDV/YX-2021株;第214位氨基酸變異位點(diǎn)(A→S)主要存在于經(jīng)典株、變異株與PEDV/YX-2021株。這些氨基酸變異位點(diǎn)為后期研究PEDV/YX-2021株的致病性提供了關(guān)鍵信息。見表3。

表3 PEDV/YX-2021與參考毒株M蛋白氨基酸變異位點(diǎn)分析

3 討論

PEDV是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)最主要的病原之一,幾乎在所有省份都有流行[11]。楊啟堯等人對2019—2021年云南省的豬血清進(jìn)行PED的抗體檢測,云南省文山、紅河、玉溪、昆明、曲靖、大理、麗江、西雙版納8個(gè)州(市)PEDV 3年平均感染率為28.46%,2021年感染率最高為37.43%。其中,玉溪市PEDV 3年平均感染率為19.76%,2019年P(guān)EDV感染率為11.54%,2020年P(guān)EDV感染率為20.54%,2021年P(guān)EDV感染率為29.31%,玉溪市PEDV感染率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[12]。本研究調(diào)查了2020—2022年玉溪市PEDV流行情況,PEDV陽性檢出率為39.39%,說明目前玉溪市PEDV流行程度高,應(yīng)引起高度重視。

玉溪市PEDV/YX-2021 屬于G2型流行變異株,與G1型經(jīng)典株CV777相比,存在4個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(13:E→Q;42:V→A;129:V→I;214:A→S);其中第13(E→Q)、42(V→A)氨基酸變異主要存在于PEDV/YX-2021株與G2型流行株,其中,第13位變異屬于酸性氨基酸變?yōu)橹行园被?第214氨基酸變異(A→S)主要存在于2010年以后出現(xiàn)的流行株,屬于疏水性氨基酸變?yōu)橛H水性氨基酸。這些氨基酸位點(diǎn)變異改變了氨基酸的親疏水性和帶電情況,提示PEDV G1基因型與G2基因型的M基因之間存在不一致的氨基酸位點(diǎn)且可能存在基因型內(nèi)部一致性的突變規(guī)律,為后期研究PEDV/YX-2021株的致病性提供了關(guān)鍵信息,但具體生物學(xué)意義還有待進(jìn)一步研究。

PEDV屬于RNA病毒,其分子演化與變異的概率高,導(dǎo)致近年來PEDV變異毒株不斷出現(xiàn)[13]。云南省2017—2022年P(guān)EDV的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)曲靖、宣威、蒙自等地區(qū)同時(shí)流行G1基因型和G2基因型兩種基因型毒株,但以G2b為優(yōu)勢流行基因亞型[7]。本文在玉溪市沒有檢測到G1基因型PEDV,可能與收集的樣品時(shí)間段和樣品數(shù)量少有關(guān)。PEDV G2型是玉溪市的優(yōu)勢流行株,明顯與PEDV 疫苗毒株CV777等早期毒株存在特征性的氨基酸變異,可能存在抗原性差異。因此,防控PED,需要關(guān)注當(dāng)前PEDV G2型流行株的流行上升趨勢,在做好豬場飼養(yǎng)管理和生物安全的同時(shí),篩選配型和免疫原性好的G2型毒株疫苗進(jìn)行PED免疫防控。