娜迪熱·艾爾肯,彭軍,3,范芳芳,李茜

(1.新疆醫(yī)科大學第四臨床醫(yī)學院,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆中藥炮制研究重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆理化技術研究所干旱區(qū)植物資源與化學重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830000)

支氣管哮喘(哮喘)是一種常見的慢性炎癥性呼吸道疾病,影響著超過3.3億兒童和成人,預計到2025年受影響的人口將增加到4億[1]。隨哮喘患病率的升高,已成為我國的一項重大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)。驅動蛋白家族 3A 基因(Kif3a)是哮喘的易感性位點之一,在Kif3a敲除的哮喘小鼠模型中小鼠氣道反應明顯增高[2]。Hedgehog(HH)基因家族共包括3個成員Sonic hedgehog(SHH)、Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH),SHH信號通路的上調誘導過敏性哮喘[3-4]。Kif3a的敲除或者突變會阻斷Hedgehog信號的傳導[5]。因此,Kif3a可通過調控SHH信號通路改善哮喘氣道炎癥,有效緩解哮喘癥狀。目前臨床治療中,常用藥物是抗炎糖皮質激素及支氣管擴張劑等,但長期使用引起不良反應[6]。近年來,中藥在減輕哮喘癥狀、控制哮喘發(fā)作、防止哮喘復發(fā)等方面具有治療優(yōu)勢[7]。

洋甘菊又名母菊,拉丁名MatricarlachamomillaL.,《中華本草》中記載其具有散氣消炎、軟堅消腫、祛風止痛等功效。現(xiàn)代研究表明,洋甘菊具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗抑郁、抗癌、保肝、抗糖尿病等多種藥理活性[8]。洋甘菊作為新疆地區(qū)習用藥材,是新疆傳統(tǒng)名方祖卡木顆粒的主要藥材之一,治療呼吸系統(tǒng)疾病歷史悠久[9]。洋甘菊醇提取物通過調節(jié)Th1/Th2的平衡對Balb/c小鼠巨噬細胞和淋巴細胞產生影響,發(fā)揮抗炎作用[10]。在一項關于短期服用傳統(tǒng)草藥的臨床試驗中,發(fā)現(xiàn)洋甘菊可以顯著改善兒童普通感冒的哮喘癥狀[11]。然而,洋甘菊在改善和緩解哮喘癥狀的作用機制仍不清楚。前期,我們已通過工藝優(yōu)化獲得洋甘菊的活性組分,總黃酮含量為30.55 mg·g-1,其主要活性成分為黃酮(芹菜素、木犀草素)或類黃酮醇衍生物(槲皮素)[12]。本實驗將進一步研究洋甘菊活性組分改善脂多糖(LPS)誘導人支氣管上皮細胞(16HBE)的損傷,并探討其保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株 16HBE購自上海雅吉生物。

1.2 儀器與試劑 Smart Cell HF-90CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力康儀器有限公司);TDL-60B臺式低速離心機(上海安亭儀器廠);LSRFortessa流式細胞儀(BD);MyCycler Thermal Cycler PCR儀(Bio-Rad);7500 Fast Real Time PCR instrument(ABI);Mini-PROTEAN Tetra system蛋白轉膜儀(Bio-Rad);xMarkTM酶標儀(Bio-Rad)。

角質細胞培養(yǎng)基 KM(Sciencell,批號：2101);青霉素-鏈霉素雙抗(10 000 U)(Gibco,批號：15070-063);PBS磷酸鹽緩沖液粉劑(北京中杉金橋生物,批號：ZLI-9062);CCK-8細胞增殖/毒性檢測試劑盒(全式金生物,批號：FC101-03);脂多糖(Sigma,批號：L2630);乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成,批號：A020-2-2);地塞米松(Sigma,批號：D4902);Annexin V-PE/7AAD Kit(BD,批號：559763)。一抗：beta-Actin (批號：100166-MM10)購自義翹神州;SHH (C9C5)抗體(批號：#2207)和KIF3A (D7G3)抗體(批號：#8507)購自美國CST公司;Anti-Gli1抗體(批號：ab273018)購自Abcam公司;Ptch1 抗體(批號：PA5-87508)購自賽默飛。二抗：山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶(批號：ab205718)和山羊抗小鼠IgG辣根過氧化物酶(批號：ab205719)購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 洋甘菊活性組分的制備 洋甘菊活性組分的制備工藝參數[12]：70%乙醇,料液比1∶10(W/V),回流提取1次,時間1 h。

1.3.2 16HBE的培養(yǎng)與炎癥模型細胞建立 16HBE采用角質細胞培養(yǎng)基 KM(含1%雙抗)于37 ℃、飽和濕度、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞密度超80%,即可進行傳代培養(yǎng),進入對數生長期后用于實驗。LPS(2.5 μg·mL-1)干預16HBE 16 h,建立炎癥細胞模型。

1.3.3 洋甘菊活性組分藥物干預濃度及時間摸索 收集16HBE,用完全培養(yǎng)基制備成5×104mL-1單細胞懸液,接種至96孔板中(100 μL/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h貼壁后,加入不同濃度洋甘菊活性組分(0、1、10、100、200、400 μg·mL-1),分別干預24 h和48 h。

1.3.4 實驗分組 將處于對數生長期的細胞分成以下4組：空白對照組、LPS模型組、陽性藥物組(1 μmol·L-1地塞米松干預2 h)、洋甘菊活性組分組(200 μg·mL-1,48 h)。

1.3.5 CCK-8檢測細胞增殖 將16HBE接種至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后,分別按照“1.3.2”和“1.3.3”項下方法進行干預。加入100 μL配制好的10% CCK-8溶液,繼續(xù)孵育1 h后用酶標儀測定450 nm處的OD值。

1.3.6 LDH水平檢測 將16HBE接種至96孔板中(5×103/孔),37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h貼壁后,按照“1.3.2”項下方法干預后,收集上清,在室溫下以1 000 r·min-1離心10 min,用酶標儀測定上清中LDH活性。

1.3.7 流式檢測細胞凋亡 收集16HBE,用完全培養(yǎng)基制備成5×104mL-1單細胞懸液,接種至6孔板中;按實驗分組處理后,將每組細胞瓶內的培養(yǎng)液與細胞一并吸至離心管內(內含已經懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞),1 000 r·min-1離心5 min,棄上清。用預冷的PBS洗滌2遍,棄干凈上清。加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細胞,過200目篩網,制成單細胞懸液。每管加入5 μL Annexin V-PE和10 μL 7-AAD,輕輕混勻,4 ℃避光放置5 min。在30 min內進行流式細胞儀檢測。

1.3.8 實時熒光定量檢測基因表達 用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA,使用cDNA反轉試劑盒將所有RNA逆轉錄為cDNA,采用實時熒光定量PCR方法定量分析kif3a、SHH、Ptch1、Glil mRNA的表達情況。引物采用 Primer Premier 5.0 設計,由生工生物技術公司合成。引物序列見表1。熱循環(huán)程序包括在94 ℃下保持2 min, 30個循環(huán),如下：94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s。內參為GAPDH。采用2-ΔΔCt法計算相對mRNA表達量。

表1 熒光定量mRNA檢測引物信息表

1.3.9 Western blot分析 用RIPA裂解后,從細胞中提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度后,對蛋白進行SDS-PAGE電泳和PVDF膜轉移,隨后5%的脫脂牛奶封閉1 h。PVDF膜在4 ℃下孵育一抗過夜,抗體稀釋倍數為1∶1 000。室溫下孵育二抗1 h。使用ECL檢測試劑盒檢測免疫標記條帶(蛋白質條帶)的化學發(fā)光信號。

2 結果

2.1 LPS誘導炎癥模型 結果顯示,通過2.5 μmol·L-1LPS干預16HBE 16 h建立炎癥細胞模型。LPS干預后,細胞增殖能力降低(n=5,與空白對照組比較,P<0.05),LDH釋放增加(n=5,與空白對照組比較,P<0.05),見圖1。

圖1 LPS干預對細胞增殖及釋放LDH的影響

2.2 洋甘菊活性組分對細胞增殖的影響 結果顯示,通過加入0、1、10、100、200、400 μg·mL-1的洋甘菊活性組分,分別干預24 h和48 h,發(fā)現(xiàn)洋甘菊活性組分干預濃度200 μg·mL-1,時間48 h后細胞活性被有效逆轉,見圖2(n=5)。LPS干預后顯著抑制了細胞的增殖,而干預濃度200 μg·mL-1的洋甘菊活性組分可以有效逆轉LPS對細胞的損傷,促進16HBE增殖,見圖3(n=5,與空白對照組比較,P<0.05;與模型組比較,P<0.05)。因此,采用濃度200 μg·mL-1的洋甘菊活性組分進行后續(xù)研究。

圖2 洋甘菊活性組分濃度摸索

圖3 洋甘菊活性組分對LPS干預后細胞增殖及凋亡的影響

2.3 洋甘菊活性組分對細胞凋亡的影響 結果顯示,2.5 μmol·L-1LPS干預后顯著誘導16HBE的凋亡。200 μg·mL-1洋甘菊活性組分干預48 h后,逆轉了LPS誘導的細胞凋亡見圖3和圖4(n=5,與空白對照組比較,P<0.01;與模型組比較,P<0.01)。

A.空白對照組;B.LPS模型組;C.LPS模型+地塞米松組;D.LPS模型+洋甘菊活性組分組圖4 洋甘菊活性組分對LPS干預后細胞凋亡的影響

2.4 洋甘菊活性組分對Kif3a和SHH信號通路中關鍵指標基因表達的影響 Kif3a是調控微管功能和運輸的異三聚體驅動蛋白2的亞基,其基因位點被多次證明與哮喘相關,通過前期蛋白組學實驗篩選出Kif3a可能調控Sonic Hedgehog(SHH)信號通路。LPS干預后,16HBE中Kif3a基因表達水平降低,SHH信號通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表達升高。洋甘菊活性組分有效逆轉以上指標的變化,促進Kif3a基因表達,抑制SHH信號通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil基因表達降低,見圖5(n=3,與空白對照組比較,P<0.05;與LPS模型組比較,P<0.05)。

A.洋甘菊活性組分對LPS干預后Kif3a基因表達影響;B.洋甘菊活性組分對LPS干預后SHH基因表達影響;C.洋甘菊活性組分對LPS干預后Ptch1基因表達影響;D.洋甘菊活性組分對LPS干預后Glil基因表達影響圖5 洋甘菊活性組分對LPS干預后Kif3a基因及SHH通路的影響

2.5 洋甘菊活性組分對Kif3a和SHH信號通路中關鍵蛋白表達的影響 結果顯示,LPS干預后,16HBE中Kif3a蛋白表達水平降低,SHH信號通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表達升高。洋甘菊活性組分有效逆轉以上指標的變化,上調Kif3a蛋白表達,抑制SHH信號通路激活,其中SHH、Ptch1、Glil蛋白表達降低,見圖6和圖7(n=3,與空白對照組比較,P<0.05;與LPS模型組比較,P<0.05)。

A.洋甘菊活性組分對LPS干預后Kif3a蛋白表達影響;B.洋甘菊活性組分對LPS干預后SHH蛋白表達影響;C.洋甘菊活性組分對LPS干預后Ptch1蛋白表達影響;D.洋甘菊活性組分對LPS干預后Glil蛋白表達影響圖6 洋甘菊活性組分對LPS干預后Kif3a蛋白及SHH通路的影響

圖7 洋甘菊活性組分對LPS干預后Kif3a蛋白及SHH通路的影響

3 討論

哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢,給個人身心健康和家庭生活質量帶來了嚴重影響。其發(fā)病機制十分復雜,主要的發(fā)生由于Th2的過表達,致使Th1/Th2之間失衡,并且Th2細胞分泌的物質與氣道炎癥、分泌物增多及纖維化密切相關[13]。哮喘的病理變化的基礎是氣道炎癥,因此本研究中采用LPS誘導16HBE,建立哮喘炎癥細胞模型。LPS干預后,16HBE受損、活力顯著降低并誘導細胞的凋亡。洋甘菊富含黃酮類活性成分,具有抗氧化、消炎等功效。本研究中發(fā)現(xiàn),洋甘菊活性組分在濃度200 μg·mL-1處理48 h時,可以顯著逆轉LPS對細胞的損傷并促進增殖,減弱LPS誘導的細胞凋亡,對哮喘炎癥16HBE起到保護作用。因此,進一步探討洋甘菊活性組分在治療和改善哮喘炎癥16HBE的作用機制。

近年來,Kif3a基因已被發(fā)現(xiàn)在哮喘患者中異常表達,并且哮喘氣道炎癥中發(fā)揮重要作用的IL-4以及IL-13位于該區(qū)域,因此該靶點是參與哮喘氣道炎癥調控的可能機制,是治療哮喘的新的靶點和方向[2,14]。它可編碼驅動蛋白2(kinesin-2)的運動亞單位,在調節(jié)細胞增殖、凋亡、分化、細胞內運輸等具有重要作用[15]。Kif3a是纖毛運動蛋白馬達的一部分,在肺中活動纖毛可協(xié)助黏液纖毛發(fā)揮清除作用,纖毛細胞通過多種信號通路(如SHH)介導信號傳導,影響細胞形態(tài)發(fā)生、穩(wěn)態(tài)和器官的修復[15-16]。Hedgehog(HH)信號通路中HH蛋白與Ptch結合可解除對Smo的抑制作用,導致下游Gli修飾為轉錄激活因子,進入細胞核內激活Gli1和Ptch1等靶基因轉錄。目前,已有一些研究表明SHH信號通路在支氣管哮喘的發(fā)病過程中起著重要的作用[15,17-18]。本研究中,LPS干預后,16HBE內Kif3a在轉錄水平和蛋白表達水平顯著降低,SHH、Ptch1、Gli1在轉錄水平和蛋白表達水平顯著升高,表明哮喘炎癥細胞中SHH信號通路處于異常激活狀態(tài)。之前研究發(fā)現(xiàn),Kif3a敲除的小鼠對空氣過敏原煙曲霉和室內塵螨提取物高度敏感,導致氣道高反應性和Th2介導的嗜酸性粒細胞炎癥增加[15]。本實驗中,洋甘菊活性組分處理后可顯著逆轉蛋白表達,增加Kif3a轉錄和蛋白表達水平并降低SHH、Ptch1、Gli1轉錄水平和蛋白表達。因此,洋甘菊活性組分可以通過上調Kif3a,并進一步下調SHH信號通路,保護LPS誘導損傷的16HBE。

本研究表明,洋甘菊活性組分可逆轉LPS對16HBE的損傷和凋亡,通過Kif3a調控SHH信號通路,改善哮喘氣道炎癥,在哮喘治療中發(fā)揮作用。