劉大威,夏添明,武會斌,王云帥,孫生安,李朝輝

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化道疾病中常見不良惡性腫瘤中的一種,近年來結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐漸上升[1]。因此,積極開展結(jié)直腸腫瘤的相關(guān)分子機制研究,尋找最新的特異性腫瘤分子標志物及治療靶標,對患者進行早篩查、早干預(yù)以及改善預(yù)后具有重要的臨床意義和社會價值。既往研究[2-3]顯示,癌細胞釋放的外泌體微小RNA-25(microRNA-25,miR-25)通過調(diào)控鹽誘導(dǎo)激酶1(salt inducible kinase 1,SIK1)能夠促進肝細胞癌的發(fā)生;miR-130b-3p能夠通過靶向SIK1抑制髓母細胞瘤的發(fā)展。已有文獻[4]報道m(xù)iR-17通過下調(diào)SIK1促進人結(jié)直腸癌細胞增殖和遷移,miR-1273g-3p與FER1L4相互作用可抑制結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移[5]。本課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p能促進結(jié)直腸癌細胞的進展,但其與SIK1的關(guān)系仍未見報道。本研究旨在通過檢測SIK1與miR-1273g-3p在結(jié)直腸癌細胞中的表達情況,分析其與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后關(guān)系,為CRC的發(fā)病機制及預(yù)后影響因素提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2017年10月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院接受手術(shù)治療的CRC患者64例為研究對象,64例手術(shù)切除的結(jié)直腸癌患者的癌組織及對應(yīng)癌旁組織作為標本。其中男性33例,女性31例;年齡35～84(61.66±10.68)歲。入選標準:(1)術(shù)前未接受放療、化療、免疫、靶向等抗腫瘤治療的Ⅰ～Ⅳ期患者;(2)均首次診斷CRC并進行CRC手術(shù),術(shù)后病理學(xué)證實為結(jié)直腸腺癌并資料完整;(3)年齡≦85歲;(4)未合并其他腫瘤或癌前病變,無直系親屬家族遺傳史;(5)臨床數(shù)據(jù)完整,并知情同意本次研究。排除標準:(1)多源性腫瘤患者;(2)術(shù)前或術(shù)后并發(fā)嚴重感染等影響預(yù)后者;(3)隨訪失訪者。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑 人結(jié)直腸癌細胞株SW480、人結(jié)腸上皮細胞NCM460(卓越創(chuàng)新中心);miR-1273g-3p抑制劑及抑制對照組試劑(上海吉瑪);兔抗人SIK1單克隆抗體購于武漢華美生物;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、超靈敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、RIPA強效裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、PVDF膜、BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白分子量標準(碧云天);DAB顯色試劑盒購于中國上海市長島診斷試劑有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Sigma);LipofectamineTM 2000 Transfection Reagent、Opti-MEMTM(Invitrogen);Trizol總RNA提取試劑盒、miR-1273g-3p引物和U6內(nèi)參引物、聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將NCM460和SW480細胞復(fù)蘇后在含10% FBS的DMEM中于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞進行實驗,取生長良好的SW480細胞用于轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM 2000說明書,將miR-1273g-3p抑制劑及陰性對照瞬時轉(zhuǎn)染SW480細胞,在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。獲得miR-1273g-3p低表達的結(jié)直腸癌細胞(抑制劑組)及相應(yīng)對照(抑制劑對照組)。

1.4 qRT-PCR檢測NCM460細胞株及轉(zhuǎn)染前后SW480細胞株中miR-1273g-3p的表達水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后2組細胞,根據(jù)TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA,根據(jù)miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒,FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑說明書分別逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒、SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑說明書用PCR儀進行擴增,檢測各組miR-1273g-3p基因的表達水平并計算mRNA相對表達量。PCR反應(yīng)均以U6為內(nèi)參。引物序列見表1。實驗結(jié)果采用 2-△△Ct法分析。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測蛋白表達情況 Western blot檢測SIK1及轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p抑制劑后表達情況。以細胞裂解液裂解提取各組細胞總蛋白,用BCA法測定蛋白含量,將蛋白質(zhì)經(jīng)30%聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)膜1.5 h,用5%脫脂牛奶密封2 h,加入一抗(兔抗人SIK1單克隆抗體,稀釋比1∶1000),4 ℃過夜,TBST漂洗,加二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG,稀釋比1:1000)室溫孵育80 min,TBST漂洗,滴加發(fā)光試劑暗室曝光,顯示條帶。通過ImageJ軟件對免疫反應(yīng)條帶進行量化分析。

1.6 免疫組織化學(xué)法(IHC)

1.6.1 檢測SIK1蛋白表達水平 取手術(shù)切除結(jié)直腸癌組織及配對的癌旁正常組織標本(距癌組織邊緣>5 cm),甲醛固定和石蠟包埋后,3 μm厚切片進行免疫組化。滴加SIK1一抗或一抗工作液(1∶500),冰箱4 ℃孵育過夜。PBS沖洗15 min,滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗(1%BSA-PBS稀釋),SABC試劑覆蓋切片,37 ℃下封閉20 min,PBS沖洗10 min;滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素,37 ℃孵育20 min。新鮮DAB適度染色,蘇木精復(fù)染30 min,梯度乙醇脫水,中性樹膠封片。以已有的陽性表達片作為對照組,以PBS代替一抗作陰性對照組。

1.6.2 免疫組化結(jié)果判讀 每張切片在光鏡200倍鏡下隨機觀察,3個具有代表性的視野拍攝照片。采用半定量計分法評價免疫組化染色結(jié)果。染色程度:無染色為0分,淺黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性范圍:<5%為0分,5%～24%為1分,25%～50%為2分,51%～74%為3分,≥75%為4分。將上述2項評分相加作為最終評分結(jié)果:<6分為陰性,≥6分為陽性。

1.7 隨訪 通過電話和復(fù)診病歷進行隨訪,隨訪時間為3～72個月,中位隨訪時間為36個月,隨訪時間截至2021年1月31日。總生存期(overall survival,OS)定義為從手術(shù)次日開始,至任何原因死亡或隨訪結(jié)束的時間間隔。連續(xù)2次無法聯(lián)系定義為失訪,失訪率為6.3%。

2 結(jié)果

2.1 miR-1273g-3p在NCM460和SW480細胞中的表達 qRT-PCR結(jié)果分析顯示, miR-1273g-3p在SW480細胞中的表達水平高于NCM460細胞(P<0.01)(圖1A)。轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p抑制劑后,在抑制劑對照組的相對表達量均值為0.93,而在抑制劑組的均值為0.08,miR-1273g-3p在SW480細胞中的表達水平低于對照組(圖1B),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

1A miR-1273g-3p在NCM460和SW480細胞中的表達1B 轉(zhuǎn)染后miR-1273g-3p在SW480細胞中的表達 圖1 qRT-PCR檢測miR-1273g-3p在不同細胞中的表達水平

2.2 SIK1在NCM460和SW480細胞中表達 由免疫印跡條帶圖可知,SIK1在SW480細胞中的表達水平低于NCM460細胞(圖2A)。SIK1在NCM460細胞中的相對表達量均值為0.61,而在SW480細胞中的均值為0.27(圖2B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

2A SIK1在NCM460和SW480細胞中的表達 2B NCM460和SW480細胞中SIK1的相對表達量比較圖2 Western blot檢測SIK1在不同細胞中的表達水平

2.3 結(jié)直腸癌細胞中 SIK1與miR-1273g-3p表達相關(guān)性 免疫印跡條帶顯示,SW480細胞中抑制miR-1273g-3p的表達后,SIK1表達升高,呈負相關(guān)性(圖3A)。SIK1在抑制劑對照組的相對表達量均值為0.34,而在抑制劑組的表達均值為0.82(圖3B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.0001)。

3A 抑制miR-1273g-3p表達后SIK1表達情況 3B 3組細胞中SIK1的相對表達量比較圖3 Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-1273g-3p抑制劑的SW480細胞中SIK1的表達水平

2.4 SIK1在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的表達 SIK1在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達率為65.6%(42/64),低于癌旁組織的82.8%(53/64),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.940,P<0.026)。見圖4。

4A 結(jié)直腸癌組織 4B 結(jié)直腸癌旁組織圖4 免疫組化檢測SIK1在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中的表達(SP×200)

2.5 SIK1表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征間的關(guān)系 SIK1的表達與腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而與性別、年齡大小、腫瘤生長部位、浸潤深度、組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 SIK1表達與CRC患者臨床病理特征間關(guān)系

2.6 SIK1表達與患者生存期之間關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線顯示,SIK1陽性表達組5年生存率為53.7%,高于陰性表達組的33.1%(圖5),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.367,P=0.021)。

圖5 SIK1表達與患者生存期之間關(guān)系

2.7 預(yù)后影響因素分析 采用COX單因素回歸分析各變量對CRC患者OS的影響,結(jié)果顯示,SIK1表達情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期與CRC患者的OS存在相關(guān)性,而性別、年齡大小、腫瘤生長部位、浸潤深度、組織分化程度與患者的OS無關(guān)。將單因素分析中有意義的指標納入Cox回歸模型進行多因素分析顯示,SIK1的低表達和TNM高分期是影響OS的獨立危險因素。見表3,表4。

表3 影響CRC患者OS的單因素分析

表4 影響CRC患者OS的Cox回歸分析

3 討論

CRC是全球第三大常見癌癥死亡原因,每年有超過885萬病例死亡,在新診斷的結(jié)直腸癌中,20%的患者合并有轉(zhuǎn)移,另外25%表現(xiàn)為局部疾病的患者后來會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病[7]。因此,在分子基因水平上開展CRC的研究有助于提高CRC患者的診治水平。

miRNA是一種由18～24個核苷酸所組成的小分子非編碼RNA,不含開放閱讀框,也不經(jīng)由翻譯途徑生成蛋白質(zhì),但是有調(diào)控蛋白編碼基因活性的功能[4]。miR-1273g-3p編碼在位于1號染色體上的SCP2基因內(nèi)含子中,共有1330個結(jié)合位點[8]。研究[9]表明,miR-1273g-3p在乳腺癌組織和細胞中呈高表達,能夠作為早期乳腺導(dǎo)管癌診斷的新的生物標志物。在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的過程中,小核仁RNA宿主基因3(small nucleolar RNA host gene 3,SNHG3)通過外泌體miR-1273g-3p正向調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白3(bone morphogenetic protein 3,BMP3)的表達[10]。在胰腺癌中,miR-1273g-3p和miR-6126明顯過表達,與CA 19-9水平變化趨勢一致,與單獨檢測CA 19-9相比,miR-1273g-3p聯(lián)合CA 19-9的血漿水平在區(qū)分胰腺癌患者與健康受試者方面表現(xiàn)出更強的能力,敏感性和陰性預(yù)測值都有所提高[11]。另有研究[12]顯示,miR-1273g-3p能夠通過調(diào)控受體蛋白酪氨酸激酶erbB-4(ErbB2 receptor tyrosine kinase 4,ERBB4)/磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基γ(phosphoinositide3kinase regulatory subunit 3,PIK3R3)/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)/核糖體蛋白S6激酶2(S6 kinase 2,S6K2)信號通路促進結(jié)直腸癌的進展。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-1273g-3p在結(jié)直腸癌細胞中高表達,轉(zhuǎn)染抑制劑后其表達低于對照組,與既往研究結(jié)果一致。進一步通過免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn),在抑制了miR-1273g-3p表達的結(jié)直腸癌細胞中,SIK1的表達升高,提示miR-1273g-3p與SIK1在結(jié)直腸癌細胞中呈負相關(guān),二者可能共同參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展,為后期詳細的機制研究奠定了基礎(chǔ)。

SIK1是SIK家族成員之一,在消化道癌癥的產(chǎn)生和進程中發(fā)揮了關(guān)鍵性作用[13]。Hartono等[14]研究表明,沉默SIK1導(dǎo)致促纖維增生性小圓細胞瘤(desmoplastic small round cell tumor,DSRCT)細胞DNA復(fù)制的停止和體內(nèi)腫瘤生長的抑制。Wang等[15]在骨肉瘤細胞中的研究顯示,SIK1能抑制骨肉瘤細胞的增殖和遷移。在宮頸鱗狀細胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)中,長鏈非編碼RNA核受體亞家族2F組成員1-反義RNA 1(LncRNA NR2F1-AS1,NR2F1-AS1)通過調(diào)控miR-17/SIK1軸抑制了CSCC細胞的侵襲和遷移[16]。而在胃、甲狀腺、乳腺癌等腫瘤中同樣起著重要作用[17-20]。在本研究中,SIK1在結(jié)直腸癌細胞中低表達,進一步通過免疫組化檢測64例結(jié)直腸癌組織樣本中SIK1的表達情況發(fā)現(xiàn),其陽性表達率為65.6%,低于癌旁組織的82.8%,說明SIK1可能在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出抑癌的作用。通過分析臨床病理特征發(fā)現(xiàn),SIK1表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)。此外,對結(jié)直腸癌患者5年生存期的影響分析顯示,陽性表達SIK1組患者的5年生存期明顯高于陰性組,表明SIK1的高表達抑制了腫瘤細胞的增殖、分化,從而抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等,表現(xiàn)出較好的預(yù)后。在單因素分析中,SIK1表達情況、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期與CRC患者的OS有關(guān),把單因素分析中有重要統(tǒng)計學(xué)價值的變量納入Cox多因素回歸模型進行風(fēng)險因素分析,結(jié)果顯示SIK1的低表達和TNM的高分期是影響OS的獨立危險因素。進一步驗證了SIK1在結(jié)直腸癌診治中的地位,突出了其重要性。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)SIK1與miR-1273g-3p在結(jié)直腸癌細胞中表達呈負相關(guān)性。SIK1在結(jié)直腸癌患者中的表達較低,并且與患者的生存期、腫塊大小、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、TNM分期具有相關(guān)性,是影響結(jié)直腸癌患者OS的危險因素。這一結(jié)論提示miR-1273g-3p可能通過調(diào)控SIK1的表達來促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,二者有望成為新的癌癥治療靶點。但其具體調(diào)節(jié)機制,仍需進一步探索。