劉子琦,鄒素蘭,錢卿,凌靜,蔣艷,胡楠

他克莫司(FK506)屬于大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑,通過選擇性抑制鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白磷酸酶,抑制T細(xì)胞的正常功能,進(jìn)而抑制一些細(xì)胞因子(如白介素)的形成,是目前臨床上用于預(yù)防和治療器官移植患者免疫排斥反應(yīng)的一線治療藥物。一方面FK506治療窗窄,僅在5～20 ng/mL范圍內(nèi),血藥濃度過高會(huì)引起肝、腎毒性,濃度過低則導(dǎo)致排斥反應(yīng)[1];另一方面,患者的生理狀態(tài)、體重、年齡、種族及合并用藥情況等方面存在個(gè)體差異[2-3],從而影響機(jī)體對(duì)藥物的處置過程,為了患者用藥安全則必須進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)。隨著遺傳藥理學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性是影響FK506血藥濃度的重要因素。FK506經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450代謝,主要包括CYP3A4和CYP3A5,其中研究最多的單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)屬CYP3A5*3。本課題組前期研究[4]已經(jīng)證實(shí)了CYP3A5*3、ABCB1C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多態(tài)性對(duì)腎移植初期患者FK506濃度劑量有影響,且ABCB1 C3435T基因多態(tài)性對(duì)腎移植患者初期的腎功能有影響。但CYP3A5、ABCB1和POR的基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量以及對(duì)腎移植受者腎功能長(zhǎng)期影響的研究相對(duì)較少,研究結(jié)果[5-6]尚不統(tǒng)一。因此,本文通過對(duì)我院腎移植術(shù)后長(zhǎng)期隨診的患者進(jìn)行基因分型,探究CYP3A5、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR基因多態(tài)性對(duì)FK506血藥濃度、劑量、濃度劑量比及腎功能(以eGFR評(píng)估)的長(zhǎng)期影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意,選取2003年1月21日—2020年4月22日我院接受同種異體腎移植手術(shù)且行長(zhǎng)期門診隨訪的腎移植受者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥18歲;(2)腎移植術(shù)后使用以FK506為基礎(chǔ)免疫抑制藥的三聯(lián)抗排異方案;(3)未聯(lián)合使用CYP3A酶抑制劑(如氟康唑、西咪替丁等)或誘導(dǎo)劑(如苯巴比妥、卡馬西平等)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)行腎移植術(shù)≥2次的患者;(2)三聯(lián)抗排異方案中從環(huán)孢素改用FK506的患者;(3)術(shù)后使用CYP3A4抑制劑(如質(zhì)子泵抑制劑、他汀類藥物、五味子制劑等)升高FK506血藥濃度的患者[7]。本研究共納入患者320例,其中男223例,女97例;平均年齡(39.03±10.14)歲,腎移植術(shù)后中位時(shí)間為34(3,209)個(gè)月。所有腎移植受者術(shù)后均采用FK506、霉酚酸類聯(lián)合腎上腺糖皮質(zhì)激素的三聯(lián)免疫抑制方案,均知悉研究?jī)?nèi)容并簽署知情同意書。相關(guān)病案信息從我院電子病例系統(tǒng)中收集,FK506濃度與劑量數(shù)據(jù)從我科自主研發(fā)的TDM數(shù)據(jù)庫(kù)中收集。

1.2 標(biāo)本采集 患者服用FK506達(dá)穩(wěn)態(tài)后,于早晨服藥前半小時(shí)靜脈采血2～3 mL,用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管收集血樣標(biāo)本。取一部分血樣用于血藥濃度測(cè)定,剩余標(biāo)本保存于-80 ℃冰箱用于基因測(cè)序。

1.3 FK506血藥濃度測(cè)定及eGFR計(jì)算 采用酶免疫放大法[8]測(cè)定FK506血藥濃度。從西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司購(gòu)入實(shí)驗(yàn)所需藥物濃度分析儀(Viva-E)、Emit 2000他克莫司檢測(cè)試劑盒、標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控試劑盒。腎小球?yàn)V過率根據(jù)CKD-EPI公式[9]計(jì)算得出。

1.4 基因型分析 首先采用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)納入的研究對(duì)象DNA進(jìn)行擴(kuò)增。詳細(xì)的DNA提取步驟、PCR引物設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件見前期研究[7-8]。其次,使用日本HitachiHigh-Technologies公司 DNA 測(cè)序儀對(duì)上一步的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序;得到四組(CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T、POR*28)基因分型。

2 結(jié)果

2.1 等位基因及基因型頻率分布 CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因突變頻率分別為69.84%、63.44%、37.81%和35.00%。基因型及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),研究資料具有群體代表性。見表1。

表1 CYP3A5、ABCB1、POR基因型和等位基因頻率

2.2 CYP3A5 基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響 CYP3A5 非表達(dá)者的血藥濃度在移植后1、4年高于CYP3A5表達(dá)者(P=0.0067,P=0.0004),CYP3A5表達(dá)者的FK506劑量在移植后8年間均高于非表達(dá)者(P=0.0004),CYP3A5表達(dá)者濃度劑量比在移植后8年間均低于非表達(dá)者(P=0.0060),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1A CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度的影響 1B CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)FK506劑量的影響1C CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度劑量比的影響圖1 CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響

2.3 ABCB1基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量和濃度劑量比的影響 本研究在CYP3A5分型的基礎(chǔ)上,研究ABCB1 C3435T和C1236T基因型對(duì)FK506濃度、劑量和濃度劑量比的影響。在CYP3A5表達(dá)者(n=157)中,ABCB1 3435 CC型患者共51例(占32.48%),CT型共81例(占51.59%),TT型共25例(占15.92%)。ABCB1 1236 CC型患者共22例(占14.01%),CT型共71例(占45.22%),TT型共64例(占40.76%)。在CYP3A5非表達(dá)者(n=163)中,ABCB1 3435 CC型患者共72例(占44.17%),CT型共71例(占43.56%),TT型共20例(占12.27%)。ABCB1 1236 CC型患者共19例(占11.66%),CT型共81例(占49.69%),TT型共63例(占38.65%)。ABCB1 3435基因多態(tài)性對(duì)2組不同CYP3A5表型患者的FK506的濃度、劑量及濃度劑量比均無影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3040)。見表2。ABCB1 3435和1236基因多態(tài)性對(duì)2組不同CYP3A5表型患者的FK506的濃度、劑量及濃度劑量比均無影響,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.3040,0.1190)。見圖2、圖3。

2A ABCB1 3435對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度的影響 2B ABCB 13435對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506劑量的影響2C ABCB1 3435對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響 2D ABCB1 3435對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度的影響2E ABCB1 3435對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506劑量的影響 2F ABCB1 3435對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響圖2 ABCB1 3435對(duì)CYP3A5表達(dá)者和非表達(dá)者FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響

3A ABCB1 1236對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度的影響 3B ABCB1 1236對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506劑量的影響3C ABCB1 1236對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響 3D ABCB1 1236對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度的影響3E ABCB1 1236對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506劑量的影響 3F ABCB1 1236對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響圖3 ABCB1 1236對(duì)CYP3A5表達(dá)者和非表達(dá)者FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響

表2 CYP3A5分型后ABCB1 C3435T、C1236T和POR*28基因分型情況

2.4 POR*28基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響 根據(jù)CYP3A5*3分型后,分別統(tǒng)計(jì)POR*28基因多態(tài)性對(duì)CYP3A5表達(dá)者和非表達(dá)者FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響。根據(jù)CYP3A5*3分型后,分別統(tǒng)計(jì)POR*28基因多態(tài)性對(duì)CYP3A5表達(dá)者和非表達(dá)者FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響。在CYP3A5表達(dá)者(n=157)中,POR*28 CC型患者共58例(占36.94%),CT型共78例(占49.68%),TT型共21例(占13.38%)。在CYP3A5非表達(dá)者(n=163)中,POR*28 CC型患者共73例(占44.79%),CT型共76例(占46.63%),TT型共14例(占8.59%)。見表2。POR*28基因多態(tài)性對(duì)2組不同CYP3A5表型患者的FK506濃度、劑量及濃度劑量比無影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)。POR*28基因多態(tài)性對(duì)2組不同CYP3A5表型患者的FK506濃度、劑量及濃度劑量比無影響,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.345)。見圖4。

4A POR*28對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度的影響 4B POR*28對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506劑量的影響4C POR*28對(duì)CYP3A5表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響 4D POR*28對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度的影響4E POR*28對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506劑量的影響 4F POR*28對(duì)CYP3A5非表達(dá)者FK506濃度劑量比的影響圖4 POR*28對(duì)CYP3A5表達(dá)者和非表達(dá)者FK506濃度、劑量及濃度劑量比的影響

圖5 CYP3A5基因型對(duì)腎移植受者eGFR水平的影響

2.5 CYP3A5基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者eGFR水平的影響 CYP3A5非表達(dá)者的eGFR水平在移植3個(gè)月(P=0.0240)、6個(gè)月(P=0.0187)和2年(P=0.0309)后高于CYP3A5表達(dá)者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在移植1年后2組eGFR水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.1130)。

3 討論

本課題組前期研究[7-8]已經(jīng)證實(shí)CYP3A5*3、ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多態(tài)性均對(duì)FK506濃度和劑量產(chǎn)生影響,并且ABCB1 C3435T基因多態(tài)性影響移植初期腎功能(以肌酐和胱抑素C為評(píng)價(jià)指標(biāo))。由于FK506治療窗窄、個(gè)體差異大,所以長(zhǎng)期門診隨訪進(jìn)行治療藥物和腎功能的監(jiān)測(cè)對(duì)于提升腎移植受者的生存率意義重大[10]。我院臨床藥學(xué)研究室開展FK506 TDM已有多年,搭載腎移植平臺(tái),為輔助臨床精準(zhǔn)用藥,累計(jì)記錄近10年隨訪的腎移植受者FK506相關(guān)數(shù)據(jù)。本研究在前期研究基礎(chǔ)上擴(kuò)大樣本量,選取320例腎移植患者CYP3A5、ABCB1和POR基因多態(tài)性對(duì)FK506濃度、劑量和腎功能長(zhǎng)期影響進(jìn)行分析和探討。

FK506經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450代謝,主要包括CYP3A4和CYP3A5,其中研究最多的單核苷酸基因多態(tài)性(SNP)屬CYP3A5*3[11]。由于第3內(nèi)含子6986位點(diǎn)A>G突變,導(dǎo)致CYP3A5酶活性降低,CYP3A5*3*3基因攜帶者(非表達(dá)者)的酶活性低于CYP3A5*3*1和CYP3A5*1*1(表達(dá)者)[12-14],使得CYP3A5非表達(dá)者C/D更高,需要的FK506劑量更少,本研究結(jié)果與之統(tǒng)一。CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者FK506的劑量、濃度和濃度劑量比有影響,在移植后1、4年CYP3A5表達(dá)者FK506的血藥濃度顯著低于CYP3A5非表達(dá)者,同時(shí)CYP3A5表達(dá)者濃度劑量比在移植后3個(gè)月到8年間多個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯著低于非表達(dá)者,而ABCB1 C1236T、ABCB1 C3435T和POR*28基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者長(zhǎng)期FK506的濃度、劑量沒有顯著性影響。一項(xiàng)對(duì)南非患者的研究[15]認(rèn)為CYP3A5基因多態(tài)性影響FK506劑量需求。Yildirim等[16]研究也一致認(rèn)為CYP3A5基因多態(tài)性而不是ABCB1基因多態(tài)性影響FK506藥動(dòng)學(xué)特征和腎移植受者的劑量需求。

根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究,關(guān)于CYP3A5*3和ABCB1基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者腎功能的影響尚未得出統(tǒng)一結(jié)論。馬多玲等[6]研究結(jié)果顯示ABCB1 G2677T/A和C3435T基因多態(tài)性對(duì)術(shù)后12個(gè)月以上的腎移植受者腎功能有影響。Genvigir等[17]研究發(fā)現(xiàn)CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)腎移植術(shù)后第90天的eGFR有影響,但缺少對(duì)移植術(shù)90天后CYP3A5*3基因多態(tài)性與eGFR的相關(guān)研究。與之相反的是,Flahault等[18]研究則表明CYP3A5*3基因多態(tài)性并不影響腎移植受者術(shù)后3個(gè)月、1、2年甚至更長(zhǎng)時(shí)間的eGFR。Cheung等[19]研究發(fā)現(xiàn)腎移植術(shù)后1個(gè)月,CYP3A5表達(dá)組和非表達(dá)組的eGFR相當(dāng),移植后6個(gè)月、1、5年至10年都沒有顯著差異。本文通過對(duì)我院320例腎移植受者的研究發(fā)現(xiàn),CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)腎移植受者3、6個(gè)月和2年的eGFR有相關(guān)性,與上述研究結(jié)論部分一致,而ABCB1 C3435T基因多態(tài)性對(duì)CYP3A5表達(dá)者的長(zhǎng)期腎功能無顯著影響。影響移植腎功能的因素較多,且難以通過單一指標(biāo)評(píng)價(jià),而本研究?jī)H計(jì)算eGFR,缺乏其他指標(biāo)(如肌酐清除率、胱抑素C等)[20]對(duì)CYP3A5*3和ABCB1基因多態(tài)性與腎功能的關(guān)系進(jìn)行綜合評(píng)估,相關(guān)研究仍待進(jìn)一步完善。

綜上所述,CYP3A5*3基因多態(tài)性對(duì)我院腎移植受者長(zhǎng)期的FK506濃度、劑量及濃度劑量比有顯著性影響,CYP3A5非表達(dá)者FK506的血藥濃度更高,所需的日劑量更低,且CYP3A5*3基因多態(tài)性與患者eGFR水平有相關(guān)性。通過對(duì)患者進(jìn)行CYP3A5、ABCB1和POR基因檢測(cè),并結(jié)合TDM結(jié)果,共同優(yōu)化腎移植術(shù)后長(zhǎng)期的個(gè)體化抗排異方案,監(jiān)護(hù)患者用藥安全。