何向明 鄒德宏 張永芳 趙帥 顧金蘋

根據(jù)美國癌癥協(xié)會的估計，在女性癌癥患者中，乳腺癌是2022 年美國新侵襲性癌癥病例中發(fā)病率最高的腫瘤（約占全部新發(fā)腫瘤的31%）；此外，乳腺癌的死亡人數(shù)位居第二，在新發(fā)癌癥死亡病例中占15%[1]。三陰性乳 腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）占所有乳腺癌的10%～20%[2]，由于缺乏雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progenstogen receptor，PR）和人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）的表達，化療是TNBC 患者主要的治療方法之一[3]?；煱ㄐg(shù)前新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NAC）、術(shù)后輔助化療以及晚期的解救化療等，NAC 是中晚期TNBC 的標準治療方案之一，通過NAC，可以篩選不同化療敏感性的TNBC[4]，對于化療不敏感者，可給予強化治療，以提高治療效果[5]。早期預測NAC 敏感性，對于提高患者治療效果、減少不必要的治療反應具有重要的意義。如何早期預測NAC 療效，從腫瘤及其周圍環(huán)境入手是主要的研究重點[6-8]，但這些研究均不能很好覆蓋TNBC 異質(zhì)性的特點，預測效率不高。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，是腫瘤自身和周圍環(huán)境聯(lián)合作用的結(jié)果，因此從代謝入手，可能可以更好地說明腫瘤的生物學特點，從而預測化療敏感性[9]。

代謝組學技術(shù)提供了從整體探討TNBC 特征的工具。代謝組學是繼基因組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白組學后另一重要的組學技術(shù)，可從整體上提供腫瘤的代謝特點[10]。代謝組學是用于分析機體在受到影響或擾動過程中代謝小分子變化的技術(shù)，它是系統(tǒng)生物學的一部分，是其他組學的下游信息。研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC 上，與正常細胞相比，TNBC 顯示出較低水平的谷胱甘肽[11]；與Luminal 型乳腺癌比，TNBC 表達的氨基酸、核苷酸和核苷酸糖水平以及與增殖相關的代謝物（如膽堿）水平較高[12-13]。TNBC 有其自身的代謝特點，因此，可利用代謝組學技術(shù)來探索TNBC 不同化療敏感性的代謝差異。

因此，基于臨床上TNBC NAC 不同的化療敏感性結(jié)局，以及腫瘤存在于宿主中的代謝特征的背景，本研究擬建立基于磁共振波譜（nuclear magnetic resonance,NMR）代謝組學技術(shù)，分析不同化療敏感性TNBC 患者尿液的代謝表型，探討可區(qū)別不同化療敏感性TNBC 患者的尿液代謝生物標志物，為早期預測NAC敏感性提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2019 年5 月至2020 年12 月在浙江省腫瘤醫(yī)院接受NAC 的的女性TNBC 患者52 例，均為接受EC-T（P）方案化療患者，具體為：3 周方案[表阿霉素（E）90 mg/m2、環(huán)磷酰胺（C）500～600 mg/m2、多西他賽（T）100 mg/m2]或2 周方案[表阿霉素（E）90 mg/m2、環(huán)磷酰胺（C）500～600 mg/m2、紫杉醇（P）175 mg/m2]。納入標準：（1）病理學檢查確診為原發(fā)TNBC；（2）符合NAC 指征并執(zhí)行NAC；（3）年齡20～70 歲；（4）體力狀況（performance status，PS）評 分0～1 分；（5）18 kg/m2≤BMI≤30 kg/m2；（6）無糖尿病、甲狀腺功能異常等代謝性疾?。唬?）同意入組本研究并簽署知情同意書。排除標準：（1）非原發(fā)TNBC；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）非NAC 患者；（4）合并血液系統(tǒng)疾病或腎臟疾??；（5）BMI＞30 kg/m2或＜18 kg/m2；（6）年 齡＞70 歲 或＜20歲；（7）不能耐受化療及手術(shù)者或PS 評分＞1 分者。本研究經(jīng)浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準[批件號：IRB-2023-137 號（科）]，留取患者第1 次化療前晨起第1 次尿液的中段尿[14-15]，保存于醫(yī)院標本庫中。為了減少飲食對患者尿液代謝物的影響，在采集前1 天，患者避免高鹽高脂及刺激性飲食，采集前晚20：00 后禁食[16]?；颊呓?jīng)NAC 及手術(shù)后，參照《RECIST 1.1 版》對NAC 療效進行評價，病理完全緩解（pathological complete response，pCR）患者8 例（pCR 組），病理部分緩解（pathological partial response，pPR）患者28 例（pPR組），病理穩(wěn)定（pathological stable disease，pSD）者16 例（pSD 組）。3 組患者年齡、BMI、Ki-67、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分期比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 3 組患者年齡、BMI、Ki-67、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤分期比較

1.2 代謝組學檢測 將52 例患者尿液解凍，各移取500 μl 與50 μl 重 水 配 制 的PBS 混 合（1.5 mol/L，K2HPO4/NaH2PO4，pH 7.40，含TMSP），以穩(wěn)定尿液pH，減少因pH 改變引起的化學位移變化差異。混合后將尿液樣品離心（12 000 g，10 min，4 ℃），然后取500 μl上清液到5 mm NMR 核磁管中，其中TMSP 用于化學位移的定標。所有尿液標本的NMR 譜均在BRUKER 600 MHz 核磁共振譜儀（德國BRUKER 公司）中采集，使用的是BRUKER 三共振反向探頭（TXI 探頭），質(zhì)子共振頻率600.13 MHz，實驗溫度設定在300 K。實驗采用一維NOESY 脈沖序列，具體參數(shù)如下：混合時間100 ms，譜寬8 403 Hz，弛豫延遲2 s，采樣時間3.999 s，數(shù)據(jù)采集點數(shù)64 K，累加128 次，加0.3 Hz 窗函數(shù)進行Fourier 變換。

1.3 尿液代謝物指認 根據(jù)Bekzod Khakimov 等編輯的基于NMR 的代謝組學軟件Signature Mapping（Sig-Ma）對尿液中的代謝物進行指認[17]，并進行相對濃度的計算。根據(jù)HMDB 數(shù)據(jù)庫（https://hmdb.ca/）、Chenomx NMR Suit 軟件和相關文獻，指認尿液中的代謝物[18]。

1.4 統(tǒng)計學處理 根據(jù)NMR 的譜峰相對積分計算尿液代謝物的相對濃度，對尿液代謝物進行主成分分析（principal component analysis，PCA），分析不同化療敏感性患者的代謝表型差異；隨后利用K-近鄰算法（Knearest neighbor，KNN），并利用二階蚱蜢優(yōu)化算法（binary grasshopper optimization algorithm，GOA）[19]和情緒分析算法（Sentiment analysis，SA）[20]對分組貢獻的特征代謝物進行優(yōu)化選擇，尋找差異性代謝物，利用ROC曲線判斷差異性代謝物作為化療敏感性標志物的潛力，以AUC 值作為評價指標。

2 結(jié)果

2.1 患者尿液代謝物指認結(jié)果 在尿液樣本中共指認出94 種代謝物，見表2。

表2 3 組患者患者尿液樣本中94 種代謝物相對濃度比較

2.2 不同患者的尿液代謝表型分析 PCA 得分圖結(jié)果顯示pCR 組、pPR 組和pSD 組患者的尿液樣本是基本可以區(qū)分的，見圖1A；3 組兩兩比較，每組樣本是可以區(qū)分的，見圖1B-D。

圖1 3 組患者尿液代謝物相對濃度的主成分分析得分圖（A：3 組比較；B：pSD 組與pPR 組比較；C：pSD 組與pCR 組比較；D：pPR組與pCR 組比較）

對尿液樣本中94 種代謝物進行Kruskal-WallisH檢驗，并對其結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，pSD 組與pPR 組患者共有57 種代謝物相對濃度比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中15 種代謝物在pSD 組中的相對濃度升高，42 種代謝物在pSD 組中的相對濃度降低；pSD 組與pCR 組患者共有34 個代謝物相對濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中12 種代謝物在pSD 組中的相對濃度升高，22 種代謝物在pSD 組中的相對濃度降低。pPR 組與pCR 組患者共有51 種差異性代謝物相對濃度比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），其中30 種代謝物在pPR 組中的相對濃度升高，21 個代謝物在pPR 組中的相對濃度下降。見表2。

2.3 基于KNN 的差異性代謝物尋找結(jié)果 利用KNN分類進行樣本的歸屬分類，對患者樣本數(shù)量進行70%的訓練和30%的驗證，優(yōu)化選擇后的差異性代謝物可用于提高不同患者歸屬的區(qū)分度。

根據(jù)GOA 和SA 算法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)17 種代謝物對3組患者尿液的分類都有一定的作用。對這17 種代謝物進行ROC 曲線分析，并計算其AUC 值，見表3。根據(jù)AUC 值（AUC＞0.8）[21]，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸可以作為不同TNBC 化療敏感性的潛在生物標志物。

表3 尿液代謝物的ROC 曲線分析結(jié)果

3 討論

TNBC 是一種異質(zhì)性很強的乳腺惡性腫瘤[22]，較其他分子類型的乳腺癌，缺乏特定的靶標，容易復發(fā)轉(zhuǎn)移、預后差，化療是其主要治療手段之一，尤其是NAC，現(xiàn)有的指南推薦根據(jù)NAC 療效采取不同的強化治療手段，如何早期預測腫瘤對化療的反應，以給予個體化的治療是目前研究的熱點，也是難點。鑒于此，本研究基于NMR 代謝組學尿液代謝特征，探討能預測TNBC NAC 敏感性的代謝標志物。本研究中，3 組患者在臨床病理學指標上差異均無統(tǒng)計學意義，這說明僅僅利用臨床病理學指標不能很好地區(qū)分不同TNBC 患者的化療敏感性。本研究通過對52 例不同化療敏感性的TNBC 患者尿液進行基于NMR 的代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)3 組患者的尿液表型是可以區(qū)分的，約20%的代謝物對分類有貢獻。隨后本研究根據(jù)KNN 分類，進行差異性代謝物的分析，分別利用兩種算法（GOA和SA），發(fā)現(xiàn)了16 種潛在的生物標志物（代謝物）用于區(qū)分pPR 組和pSD 組患者，14 種潛在生物標志物（代謝物）用于區(qū)分pPR 組和pCR 組患者，13 種潛在生物標志物（代謝物）用于區(qū)分pSD 組和pCR 組患者。最后根據(jù)ROC 曲線的AUC 值進行3 組患者尿液樣本的綜合判斷，發(fā)現(xiàn)蛋氨酸是潛在的生物標志物，可用于不同化療敏感性的判斷。

蛋氨酸參與體內(nèi)蛋氨酸轉(zhuǎn)硫途徑，在生物過程中發(fā)揮著重要作用，如氧化還原和甲基化反應[23]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)甲基化異常在血清代謝研究中也有發(fā)現(xiàn)[24]。在血清代謝研究中，筆者團隊發(fā)現(xiàn)血清中的N,N-二甲基甘氨酸是潛在的生物標志物，N,N-二甲基甘氨酸是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝通路中的產(chǎn)物，是N,N-二甲基甘氨酸是甘氨酸甲基化的產(chǎn)物，甲基化程度會影響N,N-二甲基甘氨酸的產(chǎn)生，甲基化反應可以介導甲基轉(zhuǎn)移并調(diào)節(jié)生命活動，不同區(qū)域的甲基化程度與乳腺癌的預后相關[25]。另一方面，蛋氨酸是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路的重要代謝物，該代謝通路是腫瘤細胞增殖過程中的關鍵代謝通路[26]。因此，蛋氨酸可以成為TNBC 不同化療敏感性患者的潛在生物標志物，具有較高的臨床應用價值。

采用尿液標本進行代謝組學檢測，取材方便是其優(yōu)勢之一。Lo 等[27]通過對60 例乳腺癌患者NAC 前的尿液進行代謝組學分析，發(fā)現(xiàn)化療效果好的患者尿液中的乙?；贰喚?、去甲腎上腺素和多巴胺的水平顯著高于化療無反應者組，將這些代謝物與臨床因素結(jié)合以識別NAC 應答者，預測模型顯示AUC 為0.949。但使用該標本受到的影響較多，基質(zhì)效應是生物樣品中目標分析物定量的主要挑戰(zhàn)之一，不同個體的尿液濃度差異很大，因為它可能受到飲食、攝水量和采樣時間的影響，研究觀察到不同尿液樣本中基質(zhì)效應會導致的信號大幅波動[28]，盡管可以對標本進行校準，但仍會影響數(shù)據(jù)的準確性。而且尿液需要經(jīng)過腎小球濾過，可能很多有意義的代謝產(chǎn)物被過濾，導致不能檢測出有意義的結(jié)果。在本研究中，尿液標本均采用化療前、晨起第1 次尿液，并排除了存在自身代謝性疾病患者的入組，以控制對尿液代謝產(chǎn)物的影響因素。盡管本研究的結(jié)論可以通過尿液模型及差異性代謝產(chǎn)物來預測NAC 敏感性，是否可以推廣，尚需要進一步論證。

本項目存在一些局限性。首先，本研究基于NMR代謝組學研究不同化療敏感性的尿液代謝物的相對濃度，沒有計算其在尿液中的絕對值，在后續(xù)臨床研究推廣的數(shù)據(jù)統(tǒng)一性具有一定挑戰(zhàn)；另外，本項目收集的臨床患者樣本量偏少，后續(xù)需要更多的臨床患者尿液樣本。

綜上，基于NMR 代謝組學特征提示不同化療敏感性的TNBC 患者尿液具有不同的代謝表型，蛋氨酸可以作為區(qū)別不同代謝表型的潛在生物標志物。這可為早期預測TNBC 患者的化療敏感性提供參考。