姜山，孫陽(yáng)，崔兆磊，吳巧鈴，夏紅梅

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤臨床醫(yī)學(xué)院/福建省腫瘤醫(yī)院婦科，福建 福州 350014；3.福建醫(yī)科大學(xué)腫瘤臨床醫(yī)學(xué)院/福建省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州 350014）

宮頸癌（cervical cancer）是全球女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全世界每年有超過(guò)50 萬(wàn)女性被診斷為宮頸癌，死亡人數(shù)超過(guò)30 萬(wàn)，患有轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性疾病的宮頸癌患者總體預(yù)后較差[1]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素。目前治療宮頸癌的主要方法是手術(shù)、放療、化療，但發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移后，患者的5 年生存率將低于50%，總體預(yù)后仍然較差[2]。因此，對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的分子生物學(xué)研究可能為晚期宮頸癌患者提供更好的治療策略與改善患者預(yù)后提供潛在的新方向。Serpin 家族B 成員4（SERPINB4）是一種蛋白質(zhì)編碼基因。該基因編碼的蛋白質(zhì)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員[3，4]。大多數(shù)SERPINS 是細(xì)胞外（血漿）分子，調(diào)節(jié)參與血液凝固、炎癥、組織重塑和免疫反應(yīng)的蛋白酶。這些SERPINS 通常屬于SERPINB，作用于細(xì)胞質(zhì)間中，因此參與機(jī)體生理功能[5]。腫瘤細(xì)胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達(dá)可以幫助腫瘤細(xì)胞逃離顆粒酶介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑，并降低細(xì)胞免疫治療的療效[6]。在正常條件下，細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞釋放含有絲氨酸蛋白酶（顆粒酶）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以減少病毒感染和腫瘤細(xì)胞[7，8]。SERPINB 在多種惡性腫瘤中也有異常表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及侵襲[9]，但在宮頸癌中未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究擬探索SERPINB4 在宮頸癌中的診斷和預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源 從腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和基因表達(dá)量關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://gtexportal.org/home，GTEx）下載306 例宮頸癌和13 例鄰近宮頸組織SERPINB4 mRNA 數(shù)據(jù)，并下載了的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)文件，包括腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)分期、生存時(shí)間和生存狀態(tài)。

1.2 SERPINB4 基因表達(dá)和臨床特征的關(guān)系 采用R4.1.3 軟件“Limma”包將宮頸癌組織與正常樣本組織進(jìn)行對(duì)比，分析SERPINB4 基因在兩樣本表達(dá)的差異。通過(guò)TIMER 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://timer.cistrome.org/）分析SERPINB4 在泛癌中轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá)。運(yùn)用“survival”包分析腫瘤浸潤(rùn)深度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)分期、生存時(shí)間和生存狀態(tài)與SERPINB4 的相關(guān)性并繪制生存曲線和ROC 曲線，再通過(guò)Kaplan-Meier plotter 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://kmplot.com/）予以驗(yàn)證。從HPA 數(shù)據(jù)庫(kù)中（http://www.proteinatlas.org/）獲取SERPINB4 免疫組化數(shù)據(jù)，SERPINB4 的蛋白陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)本來(lái)源于一位70 歲患有宮頸鱗狀細(xì)胞癌的患者，陰性表達(dá)的標(biāo)本來(lái)源于一位37 歲女性的正常宮頸組織。

1.3 SERPINB4 共表達(dá)基因富集分析 運(yùn)用R4.1.3軟件對(duì)SERPINB4 基因進(jìn)行共表達(dá)分析，得到顯著相關(guān)的基因。為了確定SERPINB4 的生物學(xué)功能和潛在信號(hào)通路，使用R 軟件中的“clusterProfiler”包和“org.Hs.eg.db”包，將篩選的相關(guān)基因進(jìn)行GO 的生物過(guò)程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細(xì)胞成分（cellular component，CC）富集分析和KEGG 通路富集分析，按照P＜0.005進(jìn)行篩選，探索其生物學(xué)功能和信號(hào)通路。

1.4 SERPINB4 表達(dá)與免疫浸潤(rùn)及治療的關(guān)系 通過(guò)“ESTIMATE”包比較SERPINB4 高低表達(dá)組間免疫浸潤(rùn)評(píng)分、基質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分和綜合評(píng)分差異，綜合評(píng)分即是基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分和免疫細(xì)胞評(píng)分的綜合。使用R 軟件中的“CIBERSORT”包獲取每個(gè)宮頸癌樣本中免疫細(xì)胞的含量，對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行差異分析，得到免疫細(xì)胞在SERPINB4 基因高、低表達(dá)組之間的差異，將免疫檢查點(diǎn)相關(guān)性與差異性的結(jié)果進(jìn)行可視化。采用“pRRophetic”包計(jì)算SERPINB4 高低表達(dá)組間的藥敏差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用R 軟件（版本4.1.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過(guò)Kaplan-Meier 分析高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的總生存期（OS）與對(duì)數(shù)等級(jí)，采用Mann-Whitney 比較不同組之間免疫細(xì)胞的ssGSEA 評(píng)分。雙尾P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SERPINB4 在泛癌中的表達(dá) SERPINB4 在乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、食道癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、直腸癌、皮膚黑色素癌、胃癌、甲狀腺癌和子宮內(nèi)膜癌均有表達(dá)，且與癌旁組織比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中在乳腺癌、結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肝癌、肺鱗狀細(xì)胞癌和皮膚黑色素癌中高表達(dá)（P＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 SERPINB4 在泛癌中的表達(dá)

2.2 SERPINB4 的表達(dá)與宮頸癌臨床特征的關(guān)系 與正常組織比較，SERPINB4 在宮頸癌組織中的表達(dá)升高（P＜0.001），且與腫瘤轉(zhuǎn)移（P=0.0092）呈負(fù)相關(guān)，SERPINB4 表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)分期無(wú)關(guān)；SERPINB4 在宮頸癌鱗狀細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，呈現(xiàn)棕黃色染色顆粒。在宮頸癌組織中，陽(yáng)性細(xì)胞分布均勻，染色深淺不一，SERPINB4表達(dá)高達(dá)75%以上；在正常宮頸組織中抗體染色未檢出SERPINB4，見(jiàn)圖2。

圖2 SERPINB4 的表達(dá)與宮頸癌臨床特征的關(guān)系

2.3 SERPINB4 表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系 SERPINB4 高表達(dá)組生存時(shí)間較差（P=0.035），通過(guò)Kaplan-Meier plotter 網(wǎng)站的GEO 數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，其總生存期（OS 曲線）結(jié)果與來(lái)源TCGA 數(shù)據(jù)相符（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 SERPINB4 表達(dá)與宮頸癌預(yù)后的關(guān)系

2.4 SERPINB4 及共表達(dá)基因的功能富集 首先獲取SERPINB4 的共表達(dá)基因；GO 分析顯示，SERPINB4及共表達(dá)基因的生物過(guò)程主要集中在角化細(xì)胞形成中，細(xì)胞成分集中在細(xì)胞質(zhì)中，分子功能集中作為蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)宿主對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。KEGG 通路富集分析顯示，SERPINB4 及共表達(dá)基因參與了細(xì)胞的神經(jīng)活性配體-受體的相互作用、鈣信號(hào)通路和cAMP 信號(hào)通路等生物學(xué)功能正向調(diào)控，見(jiàn)圖4。

圖4 GO 和KEGG 富集分析

2.5 SERPINB4 表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系 6 個(gè)TICs（激活CD4 記憶T 細(xì)胞、γδT 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞、靜息樹(shù)突狀細(xì)胞、激活樹(shù)突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）與SERPINB4 表達(dá)呈正相關(guān)，3 個(gè)TICs（幼稚B 細(xì)胞、漿細(xì)胞和調(diào)節(jié)T 細(xì)胞）與SERPINB4 表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；SERPINB4 高表達(dá)組的免疫細(xì)胞評(píng)分和綜合評(píng)分高于低表達(dá)組（P＜0.05）；SERPINB4 表達(dá)與常見(jiàn)免疫檢查點(diǎn)，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑（TNFSF15）、腫瘤壞死因子受體超家族成員18（TNFRSF18）、腺苷A2a 受體（ADORA2A）、程序性死亡配體1（CD274）和T 細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白受體3（HAVCR2）均有關(guān)，見(jiàn)圖5。

圖5 SERPINB4 表達(dá)與免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.6 SERPINB4 表達(dá)對(duì)宮頸癌患者靶向藥物治療敏感性的影響 SERPINB4 高表達(dá)組紫杉醇、塞卡替尼、拉帕替尼、厄洛替尼、環(huán)巴胺、伊斯平斯、HIF-PH抑制劑的IC50中位值高于低表達(dá)組（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖6 SERPINB4 表達(dá)對(duì)宮頸癌患者靶向藥物治療敏感性的影響

3 討論

宮頸癌是一種常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，雖然現(xiàn)有的治療策略改善了患者的臨床結(jié)局，但晚期患者預(yù)后仍然較差[10]。因此，尋找與宮頸癌預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)因素，針對(duì)致癌機(jī)制開(kāi)辟一種新的治療策略是很有必要的。

SERPINB4 在許多類(lèi)型的惡性腫瘤均有表達(dá)并可能影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。SERPIN 家族最初被發(fā)現(xiàn)作為腫瘤特異性抗原，并用作各種鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志。SERPINB4 已被發(fā)現(xiàn)可影響多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展[11-14]。研究證明[15]，致癌Ras 通過(guò)ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子PEA3 誘導(dǎo)宮頸癌組織中SERPINB3/4激活。宮頸癌組織中SERPINB4 的高表達(dá)的患者總體生存率較差，是患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，在腫瘤T4和N2病理階段表達(dá)更高。總之，SERPINB4 可能是具有潛在臨床價(jià)值的宮頸癌預(yù)后因素，其高表達(dá)預(yù)示較差的生存及預(yù)后。

腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成腫瘤組織的關(guān)鍵因素，研究表明其在預(yù)測(cè)腫瘤患者的生存狀態(tài)和治療效果方面具有重要意義[16，17]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。為了揭示SERPINB4 的ICI 治療效果相關(guān)的潛在機(jī)制，本研究分析了SERPINB4 與腫瘤免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系，包括CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等。SERPINB4 與免疫浸潤(rùn)顯著相關(guān)，在SERPINB4 的高表達(dá)組中CD4 記憶T 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞等在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用[18]。這表明具有SERPINB4 高表達(dá)宮頸癌患者可歸類(lèi)為主動(dòng)免疫亞型。同時(shí)，SERPINB4 高表達(dá)組免疫檢查點(diǎn)基因的表達(dá)升高，包括FSF15、TNFRSF18、ADORA2A、CD274 和HAVCR2。這為SERPINB4 作為ICI 治療預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物提供了重要證據(jù)。其中，在SERPINB4 高表達(dá)組中CD4 記憶T 細(xì)胞、M1 巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞等在腫瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。

本研究顯示，SERPINB4 及其共表達(dá)基因的分子功能集在作為蛋白酶抑制劑調(diào)節(jié)宿主對(duì)機(jī)體的免疫機(jī)制，KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)SERPINB4 可能調(diào)控了cAMP 信號(hào)通路。cAMP 分子是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的主要次級(jí)信使，它通過(guò)腺苷酸環(huán)化酶從三磷酸腺苷衍生而來(lái)，并調(diào)節(jié)許多生物過(guò)程[19]。在之前許多研究中報(bào)道cAMP 信號(hào)可能具有腫瘤促進(jìn)作用。cAMP可以調(diào)節(jié)多種靶基因的轉(zhuǎn)錄，主要通過(guò)蛋白激酶A及其下游效應(yīng)子如cAMP 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白[20]。因此，SERPINB4 可能通過(guò)影響cAMP 信號(hào)通路傳導(dǎo)，從而逃避免疫監(jiān)視促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。此外，本研究發(fā)現(xiàn)SERPINB4 高表達(dá)組較低表達(dá)組對(duì)化療藥物的敏感性低，說(shuō)明SERPINB4 高表達(dá)患者可能對(duì)常規(guī)化療藥物耐藥，如紫杉醇、厄洛替尼、拉帕替尼等。這表明患者可以通過(guò)靶向療法從免疫治療和化療聯(lián)合治療中獲益，可能有助于宮頸癌患者的精準(zhǔn)、個(gè)體化治療。

綜上所述，SERPINB4 可以作為免疫微環(huán)境狀態(tài)重塑的指標(biāo)，也可以作為一個(gè)具有前景的臨床結(jié)果預(yù)測(cè)因子，如宮頸癌的生存率、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和對(duì)免疫治療反應(yīng)。然而，通過(guò)這種生物信息學(xué)分析僅揭示了SERPINB4 與宮頸癌的預(yù)后和免疫浸潤(rùn)相關(guān)性。后期將在體內(nèi)和體外進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從分子、細(xì)胞、組織及動(dòng)物水平進(jìn)一步探索SERPINB4 對(duì)宮頸癌的影響機(jī)制。