王文思，安曉慧，方興，王艷

遼寧省疾病預防控制中心，遼寧 沈陽 110005

風疹病毒屬于新建立的馬氏病毒科（Matonaviridae）風疹病毒屬（Rubivirus），為單股正鏈RNA 病毒，通常引起以發(fā)熱、出疹等為主要臨床特征的急性呼吸道傳染病，多數(shù)患者感染后臨床癥狀輕微，如皮疹、淋巴結腫大，偶伴關節(jié)痛、血小板減少癥和腦?。?-3］。風疹病毒感染引起的最嚴重后果是先天性風疹綜合征（congenital rubella syndrome，CRS）［4］，風疹病毒可穿過胎盤并導致胎兒感染，妊娠早期感染會導致流產(chǎn)、胎兒死亡或嚴重的先天缺陷，全球每年約10 萬名兒童出生時患有CRS［3，5-6］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在2005年提出，基于包膜蛋白E1基因的739個核苷酸（nt 8 731 ～9 469）將風疹病毒劃分為13 個基因型（1a、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C），其中1E 基因型病毒具有廣泛的地理分布，近年來在全球頻繁發(fā)現(xiàn)［2，5］。為能夠準確地進行風疹病毒溯源研究，RIVAILLER等［7］提出將1E 基因型進一步劃分為5 個基因亞型（1E-L0、1E-L1、1E-L2、1E-L3、1E-L4），其中1E-L0 基因亞型為已消失的病毒，目前全球未再檢測到；1EL1基因亞型主要在中國和俄羅斯等國家流行；1E-L2基因亞型主要流行于中國臺灣、日本、馬來西亞等東亞國家；1E-L3 基因亞型流行于突尼斯、印度和中國香港等；1E-L4 基因亞型則分布于也門、蘇丹等東亞和西亞國家［7-9］。

風疹病毒感染是重要的公共衛(wèi)生問題，風疹病毒的分子特征分析對于世界各地的流行特征描述、追蹤新輸入毒株及監(jiān)測消除風疹具有重要意義。本研究對2019 年遼寧省風疹流行病學特征及風疹病毒基因型、基因亞型及氨基酸變異位點進行分析，為遼寧省風疹防控策略的制定和消除提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 流行病學數(shù)據(jù) 2019 年遼寧省風疹發(fā)病率、發(fā)病地區(qū)及病例年齡構成等流行病學數(shù)據(jù)來源于中國疾病預防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）法定傳染病報告系統(tǒng)。

1.2 主要試劑 核酸提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit 和QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 購 自 德 國QIAGEN公司。

1.3 樣本采集及病毒分離 遼寧省各區(qū)、縣級疾病預防控制中心采集2019 年疑似風疹暴發(fā)和散發(fā)病例的咽拭子樣本，于48 h 內(nèi)冷藏運送至地市級CDC麻疹／風疹實驗室，采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應進行病原學鑒定，檢測為陽性的咽拭子樣本冷藏運送至省級CDC 麻疹／風疹實驗室，使用WHO 推薦的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人淋巴信號激活因子的非洲綠猴腎細胞系（Vero／SLAM），于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，盲傳3代進行病毒分離。

1.4 病毒核酸提取、靶基因擴增及序列測定 使用核酸提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit 從第3 代病毒培養(yǎng)物中提取病毒RNA，使用QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 擴增陽性病毒分離株E1基因兩個部分重疊的基因片段，即F1-480 bp（nt 8 633 ～9 112）和F2-633 bp（nt 8 945 ～9 577）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，為保證序列的準確性，所有PCR產(chǎn)物均進行雙向測序。

1.5 基因序列比對分析 利用Sequencher 軟件（Version 5.4.5）將獲得的兩段風疹病毒基因序列（499和633 bp）拼接成E1-739 bp（nt 8 731 ～9 469）的基因片段，用于基因分型。利用BioEdit Sequence Alignment Editor software（Version 7.0.9）軟件進行多序列比對和同源性分析；利用Mega軟件（Version 7.0.20），應用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)生樹（Kimura-2parameter核酸替代模型），通過bootstrap進行評估，抽樣次數(shù)為1 000，并進行親緣性關系及遺傳距離分析［10］。

2 結果

2.1 2019年遼寧省風疹流行病學概況 2019年遼寧省風疹報告病例數(shù)為404 例，發(fā)病率為0.927／10萬，總體發(fā)病情況在2017 — 2018 年風疹流行大幅下降后又出現(xiàn)回升。2019 年全年均有病例發(fā)生，呈明顯季節(jié)性分布特征，以5 — 6 月份報告病例數(shù)最高，發(fā)病率分別為0.390／10 萬和0.264／10 萬，之后呈明顯下降趨勢，而11 月份有一個較小的反彈。2019 年遼寧省14 個城市均有風疹病例報告，報告病例主要集中在沈陽市（3.547／10 萬）。見圖1。1 ～2、3 ～4、5 ～6、7 ～14、15 ～19、≥20 歲年齡組病例發(fā)病率分別為0.957／10 萬、0.397／10 萬、0.370／10萬、1.527／10 萬、11.281／10 萬和0.464／10 萬，其中15 ～19歲年齡組為風疹發(fā)病的主要人群，見圖2。

圖1 2019年遼寧省不同城市風疹發(fā)病率Fig.1 Incidence of rubella in different cities of Liaoning Province in 2019

圖2 2019年遼寧省不同年齡風疹發(fā)病率Fig.2 Incidence of rubella of different ages in Liaoning Province in 2019

2.2 2019年遼寧省風疹病毒分離株基因型別鑒定及親緣性分析 2019 年遼寧省從7 個地市級共獲得55株風疹病毒分離株（沈陽市26株、大連市20株、鞍山市1株、撫順市1株、本溪市2株、丹東市1株、營口市4 株），與WHO 推薦的13 個基因型的32 株參考株構建系統(tǒng)進化樹，55株風疹病毒分離株均屬于1E 基因型，且這些分離株與來自馬來西亞的參考株（RVi／Kuala Lumpur.MYS／0.01［1E］）親緣性關系最為接近。毒株間核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.051%～99.864%和98.780%～100%。遼寧省不同地區(qū)風疹病毒分離株交織在一起，無明顯的地區(qū)差別。本文刪除了序列完全一致的風疹病毒分離株，最終選取17 株構建基因分型系統(tǒng)發(fā)生樹，用于基因分型分析，見圖3。

圖3 2019年遼寧省風疹病毒分離株與WHO 各基因型參考株基于E1基因構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and WHO reference strains of various genotypes based on E1 gene

2.3 2019年遼寧省風疹病毒分離株基因亞型鑒定及親緣性分析 將2019 年遼寧省1E 基因型風疹病毒代表株（17株）與5個1E基因亞型（1E-L0、1E-L1、1EL2、1E-L3、1E-L4）的35條參考株序列基于E1-739 bp序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，2019 年遼寧省風疹病毒分離株均屬于1E-L2 基因亞型，與2018 —2019 年間中國湖南、香港、吉林、浙江及日本流行的5 株1E-L2 基因亞型風疹病毒參考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）屬同一分支，同源性最高（平均核苷酸遺傳距離p-distance 為0.004）；而與2018 年以前國內(nèi)外流行的1E 基因型風疹病毒株親緣性關系較遠。見圖4。

圖4 2019 年遼寧省風疹病毒分離株與1E 基因亞型參考株基于E1-739 bp序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and 1E gene subtype reference strains based on E1-739 bp sequence

2.4 2019年遼寧省風疹病毒分離株氨基酸變異位點分析 基于風疹病毒E1基因的739 bp基因片段推導的246 個氨基酸序列（aa159 ～aa404）與中國風疹BRD-Ⅱ疫苗株對比分析顯示，2019 年遼寧省風疹病毒分離株共出現(xiàn)6 個變異位點，分別位于aa181（1株）、aa202（1 株）、aa241（1 株）、aa283（1 株）、aa333（17 株）、aa398（1 株）位點。所有風疹病毒分離株aa333 位點均出現(xiàn)丙氨酸→蘇氨酸（A→T）變異；僅1株風疹病毒分離株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283 位點出現(xiàn)谷氨酰胺→賴氨酸（Q→K）變異，此位點為E1 蛋白的抗原表位；其他毒株在N-型糖基化位點、血凝抑制位點和中和位點等重要抗原位點均未發(fā)生變異。見圖5。

續(xù)圖5 2019年遼寧省風疹病毒分離株與BRD-Ⅱ疫苗株相比氨基酸變異位點分析Fig.5（Continued）Analysis of amino acid variation sites of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province compared with BRD-Ⅱvaccine strains

3 討論

遼寧省自2010 年起將風疹疫苗納入擴大免疫規(guī)劃，實行8 ～12月齡接種第1劑次和18 ～24月齡種第2劑次的免疫策略，全面實施2劑次風疹疫苗常規(guī)免疫后，疫苗免疫覆蓋率一直維持在95%以上的高水平。隨著含風疹類疫苗的有效接種，近10 年遼寧省風疹發(fā)病率呈逐年下降趨勢，從2011年的24.756／10萬下降至2017年的歷史最低水平（0.023／10萬）。但由于風疹易感人群的積累和輸入性病毒的持續(xù)傳播，導致2019 年發(fā)病率回升（0.927／10 萬）［11］，國內(nèi)外如中國北京、廣州和日本等地均報道2019 年風疹發(fā)病率有所增加［12-15］。風疹發(fā)病呈明顯季節(jié)分布特征，5 — 6 月發(fā)病率最高，之后呈明顯下降趨勢，符合呼吸道傳染病的流行特點。2019 年，遼寧省14個城市均有風疹病例報告，其中沈陽市由于人口密度大和流動性高等原因風疹發(fā)病率最高達3.547／10 萬。15 ～19 歲青少年是目前遼寧省風疹發(fā)病的主要人群，這與青海省、浙江省、山東省等多省份報道的流行形勢基本一致［3，16-18］，大大增加了CRS 的潛在風險。

據(jù)ZHU 等［19］報道，我國流行風疹病毒共發(fā)生3次基因型間的更替，2001— 2002 年風疹流行期間，由1E-L1 基因亞型取代1F 基因型成為2002 年后我國風疹流行的優(yōu)勢基因亞型；隨著2B-L1 基因亞型自2011 年輸入并在我國持續(xù)流行，1E-L1 在我國的檢出比例逐年降低，2015—2016 年間被2B-L1 基因亞型取代，同時我國風疹發(fā)病率在2017 年也達到歷史最低水平；2018 — 2019 年間，2B-L1 基因亞型轉(zhuǎn)換為1E-L2和2B-L2c基因亞型，又完成了1次基因亞型間的更替［8-9］。本研究于2019 年從遼寧省7 個地市暴發(fā)和散發(fā)病例中共分離到55 株風疹病毒株，系統(tǒng)進化分析表明，全部風疹病毒分離株均屬于1E-L2基因亞型，與2018—2019 年間中國（湖南、香港、吉林、浙江）及日本流行的5 株1E-L2 基因亞型風疹病毒參考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）核苷酸序列聚集成簇，核苷酸序列同源性為99.051% ～99.864%，氨基酸序列同源性為98.780% ～100%。1E-L2 基因亞型風疹病毒主要在馬來西亞和日本等國家流行，于2018 年1 月在中國廣西壯族自治區(qū)首次被監(jiān)測到，為境外輸入性病毒，在中國很多省份也發(fā)生傳播流行，是導致2018 年后中國風疹疫情回升的重要原因［8，19-20］。2019 年遼寧省風疹病毒分離株與中國風疹BRD-Ⅱ疫苗株對比分析顯示，共出現(xiàn)6個變異位點，所有風疹分離株aa333 位點均出現(xiàn)A→T 變異，與江蘇省2019 年報道的結果一致［9］。僅1 株風疹病毒分離株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283位點出現(xiàn)Q→K 變異，此位點為E1蛋白的抗原表位。其他毒株E1 蛋白（aa159 ～404）上已知重要功能區(qū)N-型糖基化位點（aa209）、抗原表位位點（aa245 ～284）、血凝抑制和中和抗原表位位點（aa208 ～239）等重要抗原位點均未發(fā)生變化。吉林省、上海市等多省市報道2017 年之前1E 基因型風疹病毒株在aa338 位點發(fā)生相同突變亮氨酸→苯丙氨酸（L→F）［21-22］，遼寧省也報道過2007—2012年間發(fā)現(xiàn)全部1E 基因型分離株均于此位點發(fā)生相同突變［23］，而2019 年遼寧省風疹病毒1E 基因型分離株此位點未發(fā)現(xiàn)突變。遼寧省流行的1E 基因型風疹病毒的氨基酸序列相對高度保守，病毒抗原性穩(wěn)定，現(xiàn)行風疹疫苗仍是控制風疹疫情的首選措施。

WHO宣布，至2030年，所有六大區(qū)域（包括非洲、美洲、東南亞、歐洲、東地中海以及西太平洋地區(qū)）“實現(xiàn)并維持消除風疹的目標”［3］。分子流行病學和系統(tǒng)進化分析被納入WHO 風疹流行病學監(jiān)測方案，作為消除階段的相關指標，并作為追蹤病毒傳播鏈、確定感染源和確認疫苗相關病例的重要工具［2，24］。2019年遼寧省的404例風疹病例中，385例（95.297%）未接種過風疹疫苗或免疫史不詳，多為兒童期未接受常規(guī)風疹疫苗接種。遼寧省需進一步加強風疹流行病學和病毒學監(jiān)測，為了解病毒基因特征變化規(guī)律，及時比對風疹病毒疫苗株，了解抗原位點變異等提供依據(jù)，同時應根據(jù)現(xiàn)狀制定更加切實有效的風疹疫苗免疫策略，特別是針對15 ～19 歲年齡組人群采取有效的補充免疫措施［25］，以減少青少年和成年人易感人群，降低育齡女性患CRS的風險，維持人群中風疹疫苗高免疫覆蓋率，最終達到控制和消除風疹的目標。