王文思，安曉慧，方興，王艷

遼寧省疾病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110005

風(fēng)疹病毒屬于新建立的馬氏病毒科（Matonaviridae）風(fēng)疹病毒屬（Rubivirus），為單股正鏈RNA 病毒，通常引起以發(fā)熱、出疹等為主要臨床特征的急性呼吸道傳染病，多數(shù)患者感染后臨床癥狀輕微，如皮疹、淋巴結(jié)腫大，偶伴關(guān)節(jié)痛、血小板減少癥和腦?。?-3］。風(fēng)疹病毒感染引起的最嚴(yán)重后果是先天性風(fēng)疹綜合征（congenital rubella syndrome，CRS）［4］，風(fēng)疹病毒可穿過(guò)胎盤(pán)并導(dǎo)致胎兒感染，妊娠早期感染會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、胎兒死亡或嚴(yán)重的先天缺陷，全球每年約10 萬(wàn)名兒童出生時(shí)患有CRS［3，5-6］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）在2005年提出，基于包膜蛋白E1基因的739個(gè)核苷酸（nt 8 731 ～9 469）將風(fēng)疹病毒劃分為13 個(gè)基因型（1a、1B、1C、1D、1E、1F、1G、1H、1I、1J、2A、2B、2C），其中1E 基因型病毒具有廣泛的地理分布，近年來(lái)在全球頻繁發(fā)現(xiàn)［2，5］。為能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行風(fēng)疹病毒溯源研究，RIVAILLER等［7］提出將1E 基因型進(jìn)一步劃分為5 個(gè)基因亞型（1E-L0、1E-L1、1E-L2、1E-L3、1E-L4），其中1E-L0 基因亞型為已消失的病毒，目前全球未再檢測(cè)到；1EL1基因亞型主要在中國(guó)和俄羅斯等國(guó)家流行；1E-L2基因亞型主要流行于中國(guó)臺(tái)灣、日本、馬來(lái)西亞等東亞國(guó)家；1E-L3 基因亞型流行于突尼斯、印度和中國(guó)香港等；1E-L4 基因亞型則分布于也門(mén)、蘇丹等東亞和西亞國(guó)家［7-9］。

風(fēng)疹病毒感染是重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，風(fēng)疹病毒的分子特征分析對(duì)于世界各地的流行特征描述、追蹤新輸入毒株及監(jiān)測(cè)消除風(fēng)疹具有重要意義。本研究對(duì)2019 年遼寧省風(fēng)疹流行病學(xué)特征及風(fēng)疹病毒基因型、基因亞型及氨基酸變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，為遼寧省風(fēng)疹防控策略的制定和消除提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 流行病學(xué)數(shù)據(jù) 2019 年遼寧省風(fēng)疹發(fā)病率、發(fā)病地區(qū)及病例年齡構(gòu)成等流行病學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心（Center for Disease Control and Prevention，CDC）法定傳染病報(bào)告系統(tǒng)。

1.2 主要試劑 核酸提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit 和QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 購(gòu) 自 德 國(guó)QIAGEN公司。

1.3 樣本采集及病毒分離 遼寧省各區(qū)、縣級(jí)疾病預(yù)防控制中心采集2019 年疑似風(fēng)疹暴發(fā)和散發(fā)病例的咽拭子樣本，于48 h 內(nèi)冷藏運(yùn)送至地市級(jí)CDC麻疹／風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行病原學(xué)鑒定，檢測(cè)為陽(yáng)性的咽拭子樣本冷藏運(yùn)送至省級(jí)CDC 麻疹／風(fēng)疹實(shí)驗(yàn)室，使用WHO 推薦的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了人淋巴信號(hào)激活因子的非洲綠猴腎細(xì)胞系（Vero／SLAM），于35 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，盲傳3代進(jìn)行病毒分離。

1.4 病毒核酸提取、靶基因擴(kuò)增及序列測(cè)定 使用核酸提取試劑QIAamp Viral RNA Mini Kit 從第3 代病毒培養(yǎng)物中提取病毒RNA，使用QIAGEN One-Step RT-PCR Kit 擴(kuò)增陽(yáng)性病毒分離株E1基因兩個(gè)部分重疊的基因片段，即F1-480 bp（nt 8 633 ～9 112）和F2-633 bp（nt 8 945 ～9 577）。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽(yáng)性產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，為保證序列的準(zhǔn)確性，所有PCR產(chǎn)物均進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 基因序列比對(duì)分析 利用Sequencher 軟件（Version 5.4.5）將獲得的兩段風(fēng)疹病毒基因序列（499和633 bp）拼接成E1-739 bp（nt 8 731 ～9 469）的基因片段，用于基因分型。利用BioEdit Sequence Alignment Editor software（Version 7.0.9）軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析；利用Mega軟件（Version 7.0.20），應(yīng)用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)（Kimura-2parameter核酸替代模型），通過(guò)bootstrap進(jìn)行評(píng)估，抽樣次數(shù)為1 000，并進(jìn)行親緣性關(guān)系及遺傳距離分析［10］。

2 結(jié)果

2.1 2019年遼寧省風(fēng)疹流行病學(xué)概況 2019年遼寧省風(fēng)疹報(bào)告病例數(shù)為404 例，發(fā)病率為0.927／10萬(wàn)，總體發(fā)病情況在2017 — 2018 年風(fēng)疹流行大幅下降后又出現(xiàn)回升。2019 年全年均有病例發(fā)生，呈明顯季節(jié)性分布特征，以5 — 6 月份報(bào)告病例數(shù)最高，發(fā)病率分別為0.390／10 萬(wàn)和0.264／10 萬(wàn)，之后呈明顯下降趨勢(shì)，而11 月份有一個(gè)較小的反彈。2019 年遼寧省14 個(gè)城市均有風(fēng)疹病例報(bào)告，報(bào)告病例主要集中在沈陽(yáng)市（3.547／10 萬(wàn)）。見(jiàn)圖1。1 ～2、3 ～4、5 ～6、7 ～14、15 ～19、≥20 歲年齡組病例發(fā)病率分別為0.957／10 萬(wàn)、0.397／10 萬(wàn)、0.370／10萬(wàn)、1.527／10 萬(wàn)、11.281／10 萬(wàn)和0.464／10 萬(wàn)，其中15 ～19歲年齡組為風(fēng)疹發(fā)病的主要人群，見(jiàn)圖2。

圖1 2019年遼寧省不同城市風(fēng)疹發(fā)病率Fig.1 Incidence of rubella in different cities of Liaoning Province in 2019

圖2 2019年遼寧省不同年齡風(fēng)疹發(fā)病率Fig.2 Incidence of rubella of different ages in Liaoning Province in 2019

2.2 2019年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株基因型別鑒定及親緣性分析 2019 年遼寧省從7 個(gè)地市級(jí)共獲得55株風(fēng)疹病毒分離株（沈陽(yáng)市26株、大連市20株、鞍山市1株、撫順市1株、本溪市2株、丹東市1株、營(yíng)口市4 株），與WHO 推薦的13 個(gè)基因型的32 株參考株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，55株風(fēng)疹病毒分離株均屬于1E 基因型，且這些分離株與來(lái)自馬來(lái)西亞的參考株（RVi／Kuala Lumpur.MYS／0.01［1E］）親緣性關(guān)系最為接近。毒株間核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.051%～99.864%和98.780%～100%。遼寧省不同地區(qū)風(fēng)疹病毒分離株交織在一起，無(wú)明顯的地區(qū)差別。本文刪除了序列完全一致的風(fēng)疹病毒分離株，最終選取17 株構(gòu)建基因分型系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，用于基因分型分析，見(jiàn)圖3。

圖3 2019年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株與WHO 各基因型參考株基于E1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and WHO reference strains of various genotypes based on E1 gene

2.3 2019年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株基因亞型鑒定及親緣性分析 將2019 年遼寧省1E 基因型風(fēng)疹病毒代表株（17株）與5個(gè)1E基因亞型（1E-L0、1E-L1、1EL2、1E-L3、1E-L4）的35條參考株序列基于E1-739 bp序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，2019 年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株均屬于1E-L2 基因亞型，與2018 —2019 年間中國(guó)湖南、香港、吉林、浙江及日本流行的5 株1E-L2 基因亞型風(fēng)疹病毒參考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）屬同一分支，同源性最高（平均核苷酸遺傳距離p-distance 為0.004）；而與2018 年以前國(guó)內(nèi)外流行的1E 基因型風(fēng)疹病毒株親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 2019 年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株與1E 基因亞型參考株基于E1-739 bp序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province and 1E gene subtype reference strains based on E1-739 bp sequence

2.4 2019年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株氨基酸變異位點(diǎn)分析 基于風(fēng)疹病毒E1基因的739 bp基因片段推導(dǎo)的246 個(gè)氨基酸序列（aa159 ～aa404）與中國(guó)風(fēng)疹BRD-Ⅱ疫苗株對(duì)比分析顯示，2019 年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株共出現(xiàn)6 個(gè)變異位點(diǎn)，分別位于aa181（1株）、aa202（1 株）、aa241（1 株）、aa283（1 株）、aa333（17 株）、aa398（1 株）位點(diǎn)。所有風(fēng)疹病毒分離株aa333 位點(diǎn)均出現(xiàn)丙氨酸→蘇氨酸（A→T）變異；僅1株風(fēng)疹病毒分離株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283 位點(diǎn)出現(xiàn)谷氨酰胺→賴氨酸（Q→K）變異，此位點(diǎn)為E1 蛋白的抗原表位；其他毒株在N-型糖基化位點(diǎn)、血凝抑制位點(diǎn)和中和位點(diǎn)等重要抗原位點(diǎn)均未發(fā)生變異。見(jiàn)圖5。

續(xù)圖5 2019年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株與BRD-Ⅱ疫苗株相比氨基酸變異位點(diǎn)分析Fig.5（Continued）Analysis of amino acid variation sites of 2019 rubella virus isolates in Liaoning Province compared with BRD-Ⅱvaccine strains

3 討論

遼寧省自2010 年起將風(fēng)疹疫苗納入擴(kuò)大免疫規(guī)劃，實(shí)行8 ～12月齡接種第1劑次和18 ～24月齡種第2劑次的免疫策略，全面實(shí)施2劑次風(fēng)疹疫苗常規(guī)免疫后，疫苗免疫覆蓋率一直維持在95%以上的高水平。隨著含風(fēng)疹類(lèi)疫苗的有效接種，近10 年遼寧省風(fēng)疹發(fā)病率呈逐年下降趨勢(shì)，從2011年的24.756／10萬(wàn)下降至2017年的歷史最低水平（0.023／10萬(wàn)）。但由于風(fēng)疹易感人群的積累和輸入性病毒的持續(xù)傳播，導(dǎo)致2019 年發(fā)病率回升（0.927／10 萬(wàn)）［11］，國(guó)內(nèi)外如中國(guó)北京、廣州和日本等地均報(bào)道2019 年風(fēng)疹發(fā)病率有所增加［12-15］。風(fēng)疹發(fā)病呈明顯季節(jié)分布特征，5 — 6 月發(fā)病率最高，之后呈明顯下降趨勢(shì)，符合呼吸道傳染病的流行特點(diǎn)。2019 年，遼寧省14個(gè)城市均有風(fēng)疹病例報(bào)告，其中沈陽(yáng)市由于人口密度大和流動(dòng)性高等原因風(fēng)疹發(fā)病率最高達(dá)3.547／10 萬(wàn)。15 ～19 歲青少年是目前遼寧省風(fēng)疹發(fā)病的主要人群，這與青海省、浙江省、山東省等多省份報(bào)道的流行形勢(shì)基本一致［3，16-18］，大大增加了CRS 的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

據(jù)ZHU 等［19］報(bào)道，我國(guó)流行風(fēng)疹病毒共發(fā)生3次基因型間的更替，2001— 2002 年風(fēng)疹流行期間，由1E-L1 基因亞型取代1F 基因型成為2002 年后我國(guó)風(fēng)疹流行的優(yōu)勢(shì)基因亞型；隨著2B-L1 基因亞型自2011 年輸入并在我國(guó)持續(xù)流行，1E-L1 在我國(guó)的檢出比例逐年降低，2015—2016 年間被2B-L1 基因亞型取代，同時(shí)我國(guó)風(fēng)疹發(fā)病率在2017 年也達(dá)到歷史最低水平；2018 — 2019 年間，2B-L1 基因亞型轉(zhuǎn)換為1E-L2和2B-L2c基因亞型，又完成了1次基因亞型間的更替［8-9］。本研究于2019 年從遼寧省7 個(gè)地市暴發(fā)和散發(fā)病例中共分離到55 株風(fēng)疹病毒株，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，全部風(fēng)疹病毒分離株均屬于1E-L2基因亞型，與2018—2019 年間中國(guó)（湖南、香港、吉林、浙江）及日本流行的5 株1E-L2 基因亞型風(fēng)疹病毒參考株（RVs／Changsha.CHN／51.18／1［1E-L2］、RVs／HongKong.CHN／25.19［1E-L2］、RVi／Jilin.CHN／13.19／2［1E-L2］、RVs／Yokohama.JPN／42.18／2［1E-L2］、RVi／Zhejiang.CHN／38.19／1［1E-L2］）核苷酸序列聚集成簇，核苷酸序列同源性為99.051% ～99.864%，氨基酸序列同源性為98.780% ～100%。1E-L2 基因亞型風(fēng)疹病毒主要在馬來(lái)西亞和日本等國(guó)家流行，于2018 年1 月在中國(guó)廣西壯族自治區(qū)首次被監(jiān)測(cè)到，為境外輸入性病毒，在中國(guó)很多省份也發(fā)生傳播流行，是導(dǎo)致2018 年后中國(guó)風(fēng)疹疫情回升的重要原因［8，19-20］。2019 年遼寧省風(fēng)疹病毒分離株與中國(guó)風(fēng)疹BRD-Ⅱ疫苗株對(duì)比分析顯示，共出現(xiàn)6個(gè)變異位點(diǎn)，所有風(fēng)疹分離株aa333 位點(diǎn)均出現(xiàn)A→T 變異，與江蘇省2019 年報(bào)道的結(jié)果一致［9］。僅1 株風(fēng)疹病毒分離株（RVi／Liaoning.CHN／4.19／1［1E］）于aa283位點(diǎn)出現(xiàn)Q→K 變異，此位點(diǎn)為E1蛋白的抗原表位。其他毒株E1 蛋白（aa159 ～404）上已知重要功能區(qū)N-型糖基化位點(diǎn)（aa209）、抗原表位位點(diǎn)（aa245 ～284）、血凝抑制和中和抗原表位位點(diǎn)（aa208 ～239）等重要抗原位點(diǎn)均未發(fā)生變化。吉林省、上海市等多省市報(bào)道2017 年之前1E 基因型風(fēng)疹病毒株在aa338 位點(diǎn)發(fā)生相同突變亮氨酸→苯丙氨酸（L→F）［21-22］，遼寧省也報(bào)道過(guò)2007—2012年間發(fā)現(xiàn)全部1E 基因型分離株均于此位點(diǎn)發(fā)生相同突變［23］，而2019 年遼寧省風(fēng)疹病毒1E 基因型分離株此位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)突變。遼寧省流行的1E 基因型風(fēng)疹病毒的氨基酸序列相對(duì)高度保守，病毒抗原性穩(wěn)定，現(xiàn)行風(fēng)疹疫苗仍是控制風(fēng)疹疫情的首選措施。

WHO宣布，至2030年，所有六大區(qū)域（包括非洲、美洲、東南亞、歐洲、東地中海以及西太平洋地區(qū)）“實(shí)現(xiàn)并維持消除風(fēng)疹的目標(biāo)”［3］。分子流行病學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化分析被納入WHO 風(fēng)疹流行病學(xué)監(jiān)測(cè)方案，作為消除階段的相關(guān)指標(biāo)，并作為追蹤病毒傳播鏈、確定感染源和確認(rèn)疫苗相關(guān)病例的重要工具［2，24］。2019年遼寧省的404例風(fēng)疹病例中，385例（95.297%）未接種過(guò)風(fēng)疹疫苗或免疫史不詳，多為兒童期未接受常規(guī)風(fēng)疹疫苗接種。遼寧省需進(jìn)一步加強(qiáng)風(fēng)疹流行病學(xué)和病毒學(xué)監(jiān)測(cè)，為了解病毒基因特征變化規(guī)律，及時(shí)比對(duì)風(fēng)疹病毒疫苗株，了解抗原位點(diǎn)變異等提供依據(jù)，同時(shí)應(yīng)根據(jù)現(xiàn)狀制定更加切實(shí)有效的風(fēng)疹疫苗免疫策略，特別是針對(duì)15 ～19 歲年齡組人群采取有效的補(bǔ)充免疫措施［25］，以減少青少年和成年人易感人群，降低育齡女性患CRS的風(fēng)險(xiǎn)，維持人群中風(fēng)疹疫苗高免疫覆蓋率，最終達(dá)到控制和消除風(fēng)疹的目標(biāo)。