李曉宇 趙剛 劉鵬林 尤雯麗

［摘要］ 目的 探討白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)復(fù)方地芬諾酯（CDT）誘導(dǎo)的慢傳輸型便秘（STC）模型大鼠的治療作用及對(duì)大鼠腸道菌群的影響。

方法 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組和普蘆卡比利組，每組10只。除正常對(duì)照組外，其余3組均以CDT懸濁液連續(xù)灌胃3周，制備STC大鼠模型。造模成功后，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組和普蘆卡比利組分別應(yīng)用白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、普蘆卡比利治療3周。檢測(cè)大鼠的糞便含水率、腸道炭末推進(jìn)率；采用16S rRNA測(cè)序法分析大鼠腸道菌群變化；采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法檢測(cè)大鼠腸道內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量。

結(jié)果 與模型組相比較，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組大鼠糞便含水率和腸道炭末推進(jìn)率增加（F=38.144、34.676，P<0.01）。與模型組相比較，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組大鼠腸道菌群Simpson指數(shù)降低（F=12.112，P<0.01），物種組成中門分類水平下厚壁菌門豐度降低（H=12.347，P<0.05），屬分類水平下普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬、副擬桿菌屬等豐度增加（H=8.280～9.663，P<0.05）。與模型組相比較，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組大鼠腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸中乙酸、丙酸含量顯著上升（F=35.216、35.897，P<0.01）。

結(jié)論 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以增加大鼠糞便含水量、加快腸道蠕動(dòng)，改善大鼠便秘癥狀。其作用機(jī)制可能是通過改善腸道菌群紊亂，增加腸道菌群代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸含量。

［關(guān)鍵詞］ 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；便秘；胃腸道微生物組；脂肪酸類，揮發(fā)性；大鼠

［中圖分類號(hào)］ R574.62;R285

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

［文章編號(hào)］ 2096－5532（2023）02－0216－05

doi：10.11712/jms.2096－5532.2023.59.036

［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）］

慢傳輸型便秘（STC）是由于腸道推進(jìn)力不足導(dǎo)致的功能性便秘。其主要臨床表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難、糞便干硬等。STC具體發(fā)病原因尚不明確，有研究表明，腸道菌群失衡與STC有著密不可分的關(guān)系，厚壁菌門等菌群比例改變可導(dǎo)致便秘的發(fā)生。腸道是細(xì)菌代謝的溫床，其主要產(chǎn)物是短鏈脂肪酸，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等。大量研究報(bào)道，中草藥生白術(shù)能有效改善便秘癥狀。而白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ是白術(shù)的主要成分之一，關(guān)于其通便功能的研究較少，具體機(jī)制未知。本實(shí)驗(yàn)旨在探討白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)STC模型大鼠便秘癥狀及腸道菌群的作用，進(jìn)一步明確白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ治療STC的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠40只，6～7周齡，體質(zhì)量（180±20）g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（魯）2019－0003；青島大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)號(hào)：AHQU20200625。

1.1.2 主要藥物 造模藥物復(fù)方地芬諾酯（CDT），由常州康普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)H32022716），臨用時(shí)以蒸餾水制成15 mg/kg懸濁液；治療藥物白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，由大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)MB6520），臨用時(shí)以蒸餾水配制成10 mg/kg懸濁液；對(duì)照藥物普蘆卡比利，由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)（批號(hào)H20171241），規(guī)格為每片2 mg，臨用時(shí)以蒸餾水配制成0.18 mg/kg懸濁液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與處理 大鼠每籠5只，按照國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》要求飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境需保持充分通風(fēng)，并定時(shí)更換敷料，飼養(yǎng)期間大鼠可自由進(jìn)食、飲水。按隨機(jī)化原則將40只大鼠分為正常對(duì)照組（N組）、模型組（M組）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ組（A組）和普蘆卡比利組（P組），每組10只。后3組參考李根林等的研究以CDT懸濁液連續(xù)灌胃3周（每天15 mg/kg），制備STC大鼠模型；N組則以等量蒸餾水連續(xù)灌胃3周。造模結(jié)束后，每組隨機(jī)取4只大鼠檢驗(yàn)造模效果。造模成功后，N、M組大鼠予以蒸餾水0.1 mL/kg灌胃，A組大鼠給予10 mg/kg白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ懸濁液灌胃，P組給予0.18 mg/kg普蘆卡必利懸濁液灌胃，均連續(xù)灌胃3周。

1.2.2 糞便含水率的測(cè)定 分別于造模結(jié)束后、治療藥物干預(yù)后收集各組大鼠當(dāng)日糞便，稱濕質(zhì)量。將糞便放入烤箱，以150 ℃烘烤15 min后稱其干質(zhì)量。糞便干濕質(zhì)量差值與糞便濕質(zhì)量比值為糞便含水率。

1.2.3 炭末推進(jìn)率測(cè)定 造模結(jié)束后每組隨機(jī)取4只大鼠進(jìn)行測(cè)定，治療藥物干預(yù)后對(duì)各組剩余6只大鼠進(jìn)行測(cè)定。方法如下：禁食24 h（不禁水），每只大鼠灌服100 g/L活性炭懸液2 mL；置于籠中自由活動(dòng)30 min后采用烏拉坦腹腔注射法麻醉大鼠；麻醉成功后迅速剖開腹腔，摘除全部小腸，在無張力狀態(tài)下測(cè)量小腸全長(zhǎng)和幽門至炭末推進(jìn)最前端的距離。炭末推進(jìn)最前端到幽門的距離與全小腸長(zhǎng)度的比值為炭末推進(jìn)率。

1.2.4 腸道菌群測(cè)定 藥物干預(yù)結(jié)束后，收集大鼠新鮮糞便，置于－80 ℃保存?；诙鷾y(cè)序平臺(tái)，采用16S rRNA測(cè)序法，對(duì)高變區(qū)段PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，分析大鼠腸道菌群變化。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行Alpha多樣性分析，通過Simpson指數(shù)反映菌群多樣性。

1.2.5 氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用（GC－MS）法檢測(cè)短鏈脂肪酸含量 藥物干預(yù)結(jié)束后，收集大鼠盲腸內(nèi)容物，置于－80 ℃保存。GC條件：HP FFAP毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口的溫度為260 ℃；進(jìn)樣量為1 μL，分流進(jìn)樣，分流比10∶1；柱溫起始溫度設(shè)置為80 ℃，維持1 min，以40 ℃/min速度升溫至120 ℃，然后以10 ℃/min速度升溫至200 ℃；載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min。MS條件：電子轟擊離子源（EI離子源）；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；傳輸線溫度230 ℃；電子轟擊能量70 eV；選擇離子掃描模式（SIM）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s形式表示，糞便含水率、炭末推進(jìn)率、短鏈脂肪酸含量、Simpson指數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD（Least Significant Difference）法。各組腸道菌群結(jié)構(gòu)組成比較采用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Wilcoxon檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模效果

CDT干預(yù)3周后，4組大鼠糞便含水率和炭末推進(jìn)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=38.144、34.676，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示，M、P、A組大鼠糞便含水率和炭末推進(jìn)率較N組均顯著下降（P<0.01）。說明造模各組大鼠糞便在腸道內(nèi)滯留時(shí)間增長(zhǎng)，腸蠕動(dòng)受到影響，致使出現(xiàn)便秘癥狀，提示造模成功。見表1。

2.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)STC模型大鼠糞便含水率影響

治療藥物干預(yù)3周后，4組大鼠糞便含水率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.242，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示：與N組比較，M組大鼠糞便含水率顯著下降（P<0.01）；與M組比較，P、A組大鼠糞便含水率均顯著上升（P<0.05）。提示經(jīng)治療藥物干預(yù)后，STC模型大鼠便秘癥狀得到改善。見表2。

2.3 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)STC模型大鼠炭末推進(jìn)率影響

治療藥物干預(yù)3周后，4組大鼠腸道炭末推進(jìn)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.669，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示：與N組相比，M組大鼠炭末推進(jìn)率顯著下降（P<0.01）；與M組相比，P、A組大鼠炭末推進(jìn)率均顯著升高（P<0.01）。提示經(jīng)治療藥物干預(yù)后，STC模型大鼠腸動(dòng)力得到恢復(fù)。見表2。

兩指標(biāo)組間比較，F(xiàn)=38.144、34.676，P<0.01。與N組相比較，**P<0.01。

兩指標(biāo)組間比較，F(xiàn)=7.242、33.669，P<0.01。與N組相比較，*P<0.05，**P<0.01；與M組相比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)大鼠腸道菌群的影響

2.4.1 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)大鼠腸道菌群多樣性的影響

4組大鼠Simpson指數(shù)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.112，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示：與N組相比，M組大鼠Simpson指數(shù)顯著增加（P<0.01）；與M組相比，P組和A組大鼠Simpson指數(shù)顯著降低（P<0.05）。說明CDT干預(yù)后大鼠腸道菌群多樣性遭到破壞，而白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ干預(yù)可改善腸道菌群多樣性。見表3。

2.4.2 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成的影響 在門分類水平上，各組大鼠腸道菌群主要為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteriota）、擬桿菌門（Bacteroidota）和螺旋菌門（Spirochaetota）等。4組大鼠厚壁菌門豐度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=12.347，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示：與N組相比較，M組大鼠腸道厚壁菌門豐度顯著增加（P<0.01）；而經(jīng)治療藥物干預(yù)后，與M組相比，P組和A組厚壁菌門豐度顯著降低（P<0.05）。見圖1。在屬分類水平上，4組大鼠柯林斯菌屬（Collinsella）、普雷沃菌科_UCG－003（Prevotellaceae_UCG－003）、擬桿菌屬（Bacteroides）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=8.280～9.663，P<0.05）。兩兩比較結(jié)果顯示，與M組相比較，P組大鼠腸道柯林斯菌屬豐度顯著增加（P<0.01），A組大鼠腸道普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬、副擬桿菌屬豐度顯著增加（P<0.05）。見圖2。

2.5 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ對(duì)大鼠腸道內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響

短鏈脂肪酸含量變化主要以乙酸、丙酸、丁酸變化為主。4組大鼠乙酸、丙酸、丁酸含量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.656～35.897，P<0.01）。兩兩比較結(jié)果顯示：與N組相比，M組大鼠腸道內(nèi)容物乙酸、丙酸和丁酸含量顯著降低（P<0.01）；治療藥物干預(yù)后，與M組相比，P組和A組大鼠腸道內(nèi)容物乙酸和丙酸含量均顯著增加（P<0.01），而丁酸含量無顯著變化（P＞0.05）。說明白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可增加腸道中乙酸、丙酸的釋放，但對(duì)丁酸含量無明顯影響。見表3。

3 討論

STC是功能性便秘中最為常見的一種，主要表現(xiàn)為腸道內(nèi)容物通過時(shí)間延長(zhǎng)，在世界各地廣泛發(fā)病。越來越多的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，基于腦－腸－菌群軸，腸道菌群和STC密切相關(guān)。腸道菌群結(jié)構(gòu)改變可影響胃腸動(dòng)力，例如菌群比例失調(diào)或單純有益菌群的匱乏均會(huì)減弱胃腸蠕動(dòng)，從而促使便秘的發(fā)生。為闡明腸道菌群如何影響腸動(dòng)力，研究者們對(duì)腸道微生物組成結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物做了一系列研究。健康成年人腸道菌群門類以厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。而便秘病人腸道菌群的改變主要體現(xiàn)為厚壁菌門和擬桿菌門比值的改變。例如ZHU等研究發(fā)現(xiàn)，便秘病人腸道中厚壁菌門和擬桿菌門比值高于健康人，且普雷沃菌數(shù)量顯著減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能下調(diào)大鼠腸道菌群中厚壁菌門豐度，與有關(guān)研究結(jié)果一致。在菌群相關(guān)的治療方案中，可以通過糞菌移植、應(yīng)用益生菌類藥物等方法改變病人腸道菌群結(jié)構(gòu)，以達(dá)到治療便秘的目的。

短鏈脂肪酸是腸道細(xì)菌主要的代謝產(chǎn)物，其含量的多少顯著影響腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。有研究結(jié)果顯示，便秘病人腸道中不產(chǎn)生丁酸的普雷沃菌顯著減少，產(chǎn)生丁酸的羅氏菌屬顯著增加，提示丁酸產(chǎn)量的增加可能會(huì)導(dǎo)致便秘。另有研究結(jié)果顯示，乙酸產(chǎn)生菌與小腸傳輸率和糞便含水量呈正相關(guān)，表明乙酸對(duì)緩解便秘也有一定的作用。乙酸含量增高可以促進(jìn)腸道激素5－羥色胺等的分泌，從而改變腸壁通透性，加速胃腸蠕動(dòng)以及黏液分泌。WANG等研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腸道內(nèi)益生菌可通過提高丙酸的含量，降低腸道內(nèi)pH值，縮短腸內(nèi)容物排出體外的時(shí)間。有研究指出，擬桿菌是腸道菌群中多糖降解酶的主要生產(chǎn)者之一。而各種難以消化的多糖降解后的主要產(chǎn)物有短鏈脂肪酸、CO2、H2等，與宿主的健康密切相關(guān)。短鏈脂肪酸中丙酸的生成有兩種途徑，一是通過擬桿菌的琥珀酸途徑產(chǎn)生；二是通過厚壁菌的乳酸途徑，經(jīng)丙烯酸酯代謝產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可增加腸道中丙酸含量，同時(shí)上調(diào)擬桿菌屬豐度，推測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可能是通過影響琥珀酸途徑造成丙酸含量變化。

綜上所述，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ很有可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群，增加其代謝產(chǎn)物乙酸、丙酸含量，緩解大鼠便秘癥狀。但本研究針對(duì)菌群差異只分析到門、屬水平，對(duì)差異菌種等更多分類水平未做研究，下一步將對(duì)普雷沃菌科_UCG－003、擬桿菌屬等對(duì)腸動(dòng)力的影響作進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 馬偉平）