亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        三種貝母的核基因(ITS)序列分析

        2023-06-28 16:24:58敬雨潔黃嬌張瑩丹帥雨瑤譚紫君
        南方農(nóng)業(yè)·上旬 2023年4期
        關(guān)鍵詞:川貝母基因

        敬雨潔 黃嬌 張瑩丹 帥雨瑤 譚紫君

        摘 要 對野外采集和GenBank數(shù)據(jù)庫下載的川貝母、華西貝母、峨眉貝母的ITS序列進行比較分析,對三個種進行分類鑒定。對采集樣本的nrITS序列片段進行PCR擴增并雙向測序,所得序列經(jīng)Seqman軟件拼接后,上傳GenBank獲得序列號,利用MEGA6.0軟件分析序列特征,結(jié)合從GenBank下載的共21條ITS序列進行分析比對,采用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所采集的川貝母與GenBank上釋放的川貝母的ITS序列間存在較多的變異位點,而華西貝母與川貝母之間的變異位點較少;川貝母并不聚為一支,華西貝母嵌套進川貝母種間;峨眉貝母能有效鑒別。表明川貝母種內(nèi)遺傳變異較大,華西貝母與川貝母具有非常近的親緣關(guān)系,利用ITS序列能夠有效區(qū)分峨眉貝母。

        關(guān)鍵詞 川貝母;華西貝母;峨眉貝母;基因;ITS序列

        中圖分類號:S567.23+1 文獻標志碼:A DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.07.001

        貝母屬(Fritillaria L.)為百合科百合亞科百合族的重要類群,中國貝母屬植物共有24種2變種[1],主要分布在西南部的青藏高原及橫斷山區(qū),新疆地區(qū),長江中下游地區(qū)及東北地區(qū),其中14種2變種為我國特有種。分布于青藏高原及橫斷山區(qū)的貝母植物是川貝母及其近緣種,它們在分子系統(tǒng)樹上聚為了一支,共囊括了9種和1變種,被稱為“川貝母復合群”[2-3]。川貝母為我國重要的中藥資源,是道地藥材,其鱗莖具有鎮(zhèn)咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用。川貝母近緣種在外形上與川貝母常?;煜?,尤其是川貝母與華西貝母,野外形態(tài)特征鑒定極為相似,要從形態(tài)特征上準確識別川貝母與華西貝母常有一定困難。

        在野外采樣中,我們在四川西嶺雪山和峨眉山分別采得了三種貝母,從形態(tài)學上鑒定為川貝母、華西貝母和峨眉貝母。為了準確識別這三種貝母植物,我們分別測序了三種貝母的nrITS序列,比較三者的核基因序列的差異,同時從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了三種貝母所有的nrITS序列,與采集所得貝母的nrITS序列進行綜合比較分析,在此基礎上,通過分子系統(tǒng)發(fā)育樹探討了三種貝母的系統(tǒng)位置和分類鑒定。目前尚未見對峨眉貝母的nrITS序列的研究報道,本研究旨在為川貝母及其近緣類群的分子分類鑒定提供相應的依據(jù)。

        1? 材料與方法

        1.1? 樣品和試劑

        川貝母1號、華西貝母1號從西嶺雪山采集獲得,峨眉貝母1號、2號從峨眉山采集獲得,由樂山師范學院黃嬌副教授鑒定,所有采集的樣品都是來自經(jīng)硅膠快速干燥的新鮮葉子,其余的序列在GenBank中下載(見表1)。

        植物DNA提取試劑盒、瓊脂粉、Gold View?、Marker DL 2000 plus、2×Taq Master Mix購自康為世紀生物科技有限公司;ITS序列擴增引物購自上海生物工程技術(shù)服務有限公司。所用各種試劑均為分析純。

        1.2? 實驗方法

        1.2.1? 樣品總DNA提取

        根據(jù)康為世紀植物DNA提取試劑盒所述步驟進行操作,提取樣品中的DNA。

        1.2.2? PCR擴增及測序

        通過文獻查找,確定擴增ITS序列的引物為通用引物序列(見表2)。在PCR管內(nèi)配置30 μL的反應體系,如表3所示?;靹蚝?,用封口膜封口。PCR儀循環(huán)程序設置94 ℃預變性2 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃復性1 min,72 ℃延伸10 min,共計35個循環(huán)[3]。PCR擴增完成后,用1%的瓊脂糖凝膠對2 μL PCR產(chǎn)物進行電泳分離,觀察膠上是否有預計的條帶,用Gene Genius & Gene Gnome凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照,將有條帶的PCR產(chǎn)物片段送去成都生工生物科技有限公司進行雙向測序。

        1.2.3? 數(shù)據(jù)處理

        獲得測序結(jié)果后,利用Seqman軟件進行序列的拼接,把低質(zhì)量序列和引物部分去除,再將序列提交GenBank,申請序列登錄號。利用MEGA 6.0軟件分析序列特征,結(jié)合GenBank上下載的其余川貝母、華西貝母序列進行分析對比,以及變異位點分析,并建立NJ系統(tǒng)發(fā)育樹,設置bootstrap為1 000次重復[4]。

        2? 結(jié)果與分析

        2.1? PCR擴增產(chǎn)物的檢測結(jié)果

        所有樣品均得到ITS片段擴增產(chǎn)物,片段大小約在750 bp,PCR產(chǎn)物用凝膠電泳檢測有單一清晰條帶,無拖尾現(xiàn)象(見圖1)。由于3、7兩個川貝母樣品和4、6兩個華西貝母樣品,以及2、5兩個峨眉貝母2號樣品的ITS序列堿基完全一致,故以下分別只對1個序列結(jié)果進行分析。

        2.2? 三種貝母ITS堿基序列及片段的特征結(jié)果

        經(jīng)過序列比對,峨眉貝母1號與峨眉貝母2號的ITS序列堿基非完全匹配,前者的ITS序列總長度為707 bp,后者為724 bp,18S rDNA長度峨眉貝母1號為46 bp,峨眉貝母2號為55 bp,ITS1、5.8S rDNA和ITS2二者均為212 bp、161 bp和238 bp,28S rDNA長度峨眉貝母1號為50 bp,峨眉貝母2號為58 bp(見圖2)。川貝母的ITS序列總長度為723 bp,18S rDNA長度為55 bp,ITS1長度為212 bp,5.8S rDNA長度為161 bp,ITS2的長度為237 bp,28S rDNA長度為58 bp;華西貝母的ITS序列總長度為715 bp,18S rDNA長度為56 bp,ITS1長度為212 bp,5.8S rDNA長度為161 bp,ITS2的長度為238 bp,28S rDNA長度為48 bp。堿基序列詳見圖3、圖4。

        2.3? 不同貝母樣品的ITS序列比較

        將三種貝母的ITS序列與GenBank中下載的共21條ITS序列進行比較(見表4)。由表可知,所有序列總長度在612~730 bp,序列長度變化幅度不大。其中以華西貝母2號、新疆貝母的序列長度最短。在核苷酸組成含量上,A含量為17.7%~20.1%,T含量為16.6%~18.2%,G含量為32.8%~34.2%,C含量為29.2%~31.1%,各種貝母樣品的A、T、G、C含量差別不大,GC含量為62.4%~65.3%,遠高于AT含量。

        經(jīng)比對后,對5′端和3′端進行裁剪,中間序列長度為630 bp,通過Mega6.0軟件序列比對分析,21條ITS序列檢測到變異位點39個,其中簡約信息位點14個,單一突變位點25個,分別占變異位點總數(shù)的35.89%和64.11%。所有供試樣品的ITS1為212 bp,含有變異位點19個;5.8S為161 bp,含有變異位點2個;ITS2為237~238 bp,含有變異位點18個。14個簡約信息位點分別在第16、29、66、78、96、118、122、217、420、430、501、546、556、586位點;單一突變位點分別在第5、9、63、90、91、97、 98、120、121、127、195、204、224、417、418、426、451、458、465、559、564、572、588、594、620位點(見表5)。

        2.4? 不同貝母樣品ITS序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

        由圖5可知,不同貝母樣品主要分為兩大枝,其中川貝母1、2、3、5、7、8、10號,華西貝母1、2、3號聚為一簇(支持值為76),峨眉貝母1、2號聚為一簇(支持值93),這兩簇和川貝母4、6、9、11、12、13、14號聚為一大簇(支持值95),最后與新疆貝母、浙貝母聚為一簇,外類群郁金香和輪葉貝母在根部,說明由ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹能將“川貝母復合群”與浙貝母、新疆貝母有效分離鑒定。在“川貝母復合群”中,本研究中樣本川貝母1號(Fritillaria cirrhosa 1)與華西貝母1號(Fritillaria sichuanica 1)聚為1簇,表示二者親緣關(guān)系較近,較難區(qū)分;用ITS序列能將峨眉貝母有效分離鑒定。

        3? 結(jié)論與討論

        中國貝母屬植物大部分以鱗莖入藥,具有很高的藥用價值,是著名中藥材,盡管《中國藥典》對貝母藥材所使用的物種有明確規(guī)定,但是在民間同一地區(qū)的貝母在使用時并不區(qū)分,以川貝母為例,在青藏高原及其毗鄰的橫斷山脈地區(qū),該區(qū)域內(nèi)的十余種貝母植物經(jīng)常是不加區(qū)分地進行采集并使用,這對臨床用藥的有效性和安全性會造成很大的隱患。目前對于“川貝母復合群”的物種鑒別,形態(tài)學鑒定是最基本的鑒定方法,但此方法在對親緣關(guān)系較近、形態(tài)特征差異不明顯的不同種貝母植物中難以實現(xiàn)有效的鑒別[5-6]。

        近年來隨著分子系統(tǒng)學的發(fā)展,核糖體ITS片段常用于物種分類鑒定研究,因其進化速率快,在植物屬間和種間有較多的變異位點和信息位點,對于用來探討植物的種內(nèi)、種間,以及近緣種間變異是有效的分子手段之一[7-8]。本研究對野外采集的三種貝母的ITS序列進行PCR擴增和測序,對其序列特征進行分析,并結(jié)合GenBank上下載的19條序列分析其原始序列特征及變異位點,并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,包含了目前GenBank上釋放的所有川貝母和華西貝母ITS樣本。結(jié)果表明,本研究中所采集的川貝母與GenBank上釋放的川貝母的ITS序列間存在較多的變異位點,而華西貝母與川貝母之間的變異位點較少。在NJ系統(tǒng)樹上表現(xiàn)為,川貝母并不聚為一支,華西貝母嵌套進川貝母種間,造成此種現(xiàn)象的原因可能為:1)GenBank上釋放的部分川貝母和華西貝母鑒定有誤;2)華西貝母還未分化完全,物種形成尚在進行之中,推測華西貝母與川貝母有非常近的親緣關(guān)系;3)川貝母種內(nèi)遺傳變異較大,其遺傳變異受到地理分布、種間雜交、基因漸滲等的影響[3,9]。本研究首次報道了峨眉貝母的ITS序列,峨眉貝母兩個樣品間有1個變異位點,可能是提取時操作誤差引發(fā)的錯誤堿基序列;通過NJ系統(tǒng)樹分析,峨眉貝母與川貝母及華西貝母能有效分離(支持值>70),說明ITS序列可以用于“川貝母復合群”中種間的鑒定,但是對于親緣關(guān)系較近、分化時間較短、快速進化的種間還需要加入其他類型的DNA條形碼或基因組學手段來共同探討。本文可為川貝母及其近緣種的種間鑒定研究提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

        參考文獻:

        [1]? LIANG S Y, TAMURA M. Flora of China (24)[M]. Beijing: Science Press; St. Louis: Missouri Botanical Garden Press, 2000: 133-150.

        [2]? 羅毅波,陳心啟.中國橫斷山區(qū)及其鄰近地區(qū)貝母屬的研究(一)——川貝母及其近緣種的初步研究[J].植物分類學報,1996,34(3):304-312.

        [3]? HUANG J, YANG L Q, YU Y, et al. Molecular phylogenetics and historical biogeography of the tribe Lilieae (Liliaceae): bi-directional dispersal between biodiversity hotspots in Eurasia[J]. Annals of Botany, 2018, 122: 1245-1262.

        [4]? 鄭輝,鄧楷煜,陳安琪,等.基于DNA條形碼的川貝母及其近緣種的分子鑒定與親緣關(guān)系研究[J].藥學學報,2019,54(12):2326-2334.

        [5]? 陳虞超,郭生虎,關(guān)雅靜,等.貝母屬藥用植物研究進展[J].分子植物育種,2019,17(18):6198-6206.

        [6]? 梁孝祺,陳金金,俞超,等.貝母屬植物的分類鑒定方法研究進展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2014,7(4):308-312.

        [7]? 陸彭城,張文春,陳建芳,等.錦香草及其近緣種的親緣關(guān)系ITS序列分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2021,33(8):1436-1444.

        [8]? 代培紅,邱東,姚正培,等.基于ITS和rbcL基因序列探討廣義棒果芥屬植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[J].分子植物育種,2020,18(22):7506-7511.

        [9]? DAY PD, BERGER M, HILL L, et al. Evolutionary relationships in the medicinally important genus Fritillaria L. (Liliaceae)[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2014, 80: 11-19.

        (責任編輯:丁志祥)

        猜你喜歡
        川貝母基因
        川貝母止咳化痰良藥
        Frog whisperer
        中藥止咳有川貝母
        川貝母的量效關(guān)系及其臨床應用探討
        紅的基因 綠的本色
        中華詩詞(2020年8期)2020-02-06 09:26:54
        修改基因吉兇未卜
        奧秘(2019年8期)2019-08-28 01:47:05
        一株川貝母內(nèi)生真菌的分離鑒定及其產(chǎn)貝母類生物堿分析
        電子舌技術(shù)鑒別川貝母粉及其摻偽品
        中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:58
        創(chuàng)新基因讓招行贏在未來
        商周刊(2017年7期)2017-08-22 03:36:21
        止咳化痰藥膳
        飲食科學(2017年3期)2017-04-12 22:31:57
        人妻少妇av无码一区二区| 国产经典免费视频在线观看| 国产精品入口蜜桃人妻| 亚洲av毛片一区二区久久| 亚洲高清三区二区一区| 丰满少妇人妻无码| 久久久国产乱子伦精品| 国产亚洲一本大道中文在线| 中文字幕一区在线观看视频| 免费观看国产精品| 亚洲ⅤA中文字幕无码| 久久精品国产亚洲av一| 亚洲中文字幕舔尻av网站| 亚洲国产精品第一区二区| 正在播放国产对白孕妇作爱| 久久精品国产99久久丝袜| 一级一片内射在线播放| 国产一区二区视频免费在| 亚洲av无码国产精品色午夜字幕 | 久久久大少妇免费高潮特黄| 国产乱人伦偷精品视频还看的| 国产freesexvideos中国麻豆 | 亚洲成年网站在线777| 三级全黄的视频在线观看| 精品人妻av中文字幕乱| 精品国偷自产在线视频九色| 国产av国片精品| 视频一区精品自拍| 久久精品国产亚洲av热九九热 | 国产精品久久久久久久专区| 久久av一区二区三区黑人| 国产内射一级一片内射视频| 亚洲小说区图片区另类春色| 久久精品免视看国产盗摄| 久久精品人妻中文av| 亚洲中文字幕无码天然素人在线| 国产无遮挡无码视频免费软件| 亚洲成a人片在线| 亚洲一区二区三区av色婷婷| 亚洲乱码一区二区三区在线观看| 丰满少妇被粗大的猛烈进出视频 |