劉慧婷，劉學(xué)靜，宋成祺，陳晶，張帆，高珊，佟春玉，馬金柱，崔玉東，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

奶牛乳腺炎是一種主要由病原菌感染引起的、以乳房紅、腫、熱、痛為主要臨床癥狀的急性或慢性乳腺炎癥，不僅嚴(yán)重危害奶牛健康，也給奶業(yè)帶來巨經(jīng)濟(jì)大損失[1-2]。引起奶牛乳腺炎的病原種類很多，但以革蘭氏陽性的鏈球菌和葡萄球菌為主，包括無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）、乳房鏈球菌（Streptococcus uberis）以及金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）[3-4]。奶牛乳腺炎防治一直以抗生素治療為主，但由于抗生素的廣泛持續(xù)使用，導(dǎo)致了病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)和抗生素療效果不佳甚至無效。因此，新型疫苗研發(fā)已成為奶牛乳腺炎防治工作重點(diǎn)[5-8]。但由于引起奶牛乳腺炎的病原菌種類繁多，進(jìn)而可選擇作為疫苗的抗原更加繁多，不僅給疫苗研制和使用帶來不便，而且研制的疫苗也不具有免疫預(yù)防的廣譜性。所以尋找奶牛乳腺炎主要病原菌的共同抗原來研制新型疫苗是非常值得探索的課題。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種廣泛存在于原核生物和真核生物的參與糖酵解的關(guān)鍵酶[9-12]。甘油醛-3-磷酸脫氫酶C （也常被縮寫成GapC）是GAPDH 的一個(gè)亞單位，具有高度的保守性，且具有甘油醛-3-磷酸脫氫酶活性、轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合活性、纖維蛋白溶酶活性等[13-16]。以往研究顯示，包括S.agalactiae和S.aureus的多種病原菌GapC 都具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)作用[15，17-19]。進(jìn)一步研究證明，引起奶牛乳腺炎的三種鏈球菌GapC 具有交叉免疫原性，且能夠誘導(dǎo)良好的交叉免疫保護(hù)作用[20-21]。但引起奶牛乳腺炎的鏈球菌和葡萄球菌的GapC 之間是否存在交叉免疫原性尚缺乏研究。為此，研究對S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC 之間理化特性、同源性、免疫原性及抗原表位進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究其誘導(dǎo)的交叉免疫原性和交叉免疫保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

所用GapC 氨基酸序列均來自NCBI 上發(fā)布菌株的序列（表1）。

表1 GenBank 上選取相關(guān)GapC 氨基酸序列登錄號Table 1 Login numbers of relevant GapC amino acid sequences selected from GenBank

1.2 方法

1.2.1 GapC 氨基酸同源性分析及序列比對

選用DNAstar 和NCBI 在線分析網(wǎng)站中的BLAST 功能對各菌株GapC 的氨基酸序列同源性進(jìn)行分析；同時(shí)使用Geneious Prime 軟件（網(wǎng)址：https：//www.geneious.com/）中Pairwise/Multiple Align 功能對各菌株GapC 的氨基酸序列進(jìn)行比對。

1.2.2 GapC 二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

GapC 的二級結(jié)構(gòu)通過在線軟件Protein Structure Prediction Server（PSIPRED）數(shù)據(jù)庫（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）進(jìn)行預(yù)測；采用Swiss-Model 數(shù)據(jù)庫（http：/swissmodel.expasy.org/）同源性模型進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析。

1.2.3 GapC 基本理化性質(zhì)分析

使用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）分析各菌株GapC 的理化性質(zhì)；使用蛋白質(zhì)在線分析軟件ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析不同菌株GapC 蛋白的親水性。

1.2.4 GapC 的T 細(xì)胞和B 細(xì)胞線性表位預(yù)測分析

使用IEDB 抗原表位數(shù)據(jù)庫（http：//www.iedb.org/）；其中線性B 細(xì)胞表位選擇Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 預(yù)測方法，閾值設(shè)置為0.500，選取閾值大于0.500 的線性B 細(xì)胞表位，GapC 的CD4+T 細(xì)胞表位選擇MHC Ⅱ類分子結(jié)合方式、CD8+T 細(xì)胞表位擇MHC I 類分子結(jié)合方式，選取IC50 值小于50 nM的T 細(xì)胞表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 GapC 的基本理化性質(zhì)及抗原性分析結(jié)果

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC 均由336 個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為35 kDa 左右；等電點(diǎn)分別為5.22、5.34、5.25、4.89、4.83；不穩(wěn)定系數(shù)分別為21.60、17.84、21.80、30.09、25.85，均屬于理化性質(zhì)穩(wěn)定蛋白，S.dysgalactiae 的GapC 更加穩(wěn)定；平均親水性數(shù)值分別為-0.088、-0.092、-0.251、-0.125、-0.218、-0.203，均存在大量的親水基團(tuán)，屬于親水性蛋白；對抗原性預(yù)測分析結(jié)果顯示，在GapC 中存在多處具有可以形成抗原表位的序列，結(jié)果詳見圖1。以上分析表明5 種病原菌GapC 具有良好的抗原性。

圖1 GapC 蛋白抗原性預(yù)測結(jié)果Fig.1 Prediction of antigenicity of GapC protein

2.2 GapC 蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC 分別含有11、12、11、12、13 個(gè)α-螺旋區(qū)和16、18、15、17、18 個(gè)β-折疊區(qū)；α-螺旋分別占32.44%、27.68%、33.63%、30.06%、30.36%，β-折疊分別占22.62% 、25.89% 、19.94% 、22.92% 、22.92%；無規(guī)則卷曲分別占44.94%、46.43%、46.43%、47.02%、46.73%，通過對GapC 的二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)各菌株中無規(guī)則卷曲占比較多，形成T 細(xì)胞或B 細(xì)胞表位可能性較大；分別對S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，與在線網(wǎng)站中的模板相比，其一致性分別為95.24%、99.70%、93.15%、100%、92.26%，可見五種的GapC 的一致性較高，各GapC 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖2 所示，說明，5 種細(xì)菌的GapC 的三級結(jié)構(gòu)比較相似。

圖2 GapC 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Tertiary structure prediction of GapC protein

2.3 GapC 的氨基酸序列同源性分析結(jié)果

對S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC 的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析結(jié)果顯示，氨基酸序列同源性為66.9%～100.0%，其中三種鏈球菌的GapC 氨基酸序列同源性可達(dá)到90.5%～94.0%，金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌的GapC 氨基酸序列同源性達(dá)到92.0%～92.3%；而上述2 種葡萄球菌和3 種鏈球菌之間的GapC 氨基酸序列同源性67.8%～69.9%之間，結(jié)果見表2；并發(fā)現(xiàn)GapC 突變較多的位置為：70～81、100～110、163～172、186～194、247～258、300～306，結(jié)果見圖3。

圖3 GapC 蛋白氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence alignment of GapC protein

表2 GapC 氨基酸序列同源性分析（%）Table 2 Homology analysis of amino acid sequence of GapC from the pathogens（%）

2.4 GapC 的線性B 細(xì)胞表位和T 細(xì)胞表位預(yù)測分析結(jié)果

對S.agalactiae、S.dysgalactiae、S.uberis、S.aureus、S.epidermidis的GapC 的氨基酸序列進(jìn)行線性B 細(xì)胞表位預(yù)測，結(jié)果顯示存在共同B 細(xì)胞表位有4 個(gè)，詳見表3。CD4+T 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果顯示，它存在共同CD4+T 細(xì)胞表位9 個(gè)，詳見表4。CD8+T 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果顯示，共同CD8+T 細(xì)胞表位9 個(gè)，結(jié)果詳見表5。其中，有4 個(gè)CD4+T 細(xì)胞表位與CD8+T 細(xì)胞表位氨基酸序列存在重疊。

表3 GapC 的線性B 細(xì)胞表位預(yù)測結(jié)果Table 3 Prediction results of linear B-cell epitopes on GapC

表4 GapC 的CD4+T 細(xì)胞表位核心序列預(yù)測結(jié)果Table 4 Prediction results of the core sequence of CD4+T cell epitope in GapC

表5 GapC 的CD8+T 細(xì)胞核心表位預(yù)測結(jié)果Table 5 Prediction results of the core sequence of CD8+T cell epitope in GapC

3 討論

奶牛乳腺炎是嚴(yán)重危害奶牛健康和影響奶業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。引起奶牛乳腺炎的病原菌種類繁多，但以鏈球菌（S.agalactiae，S.dysgalactiae，S.uberis）和葡萄球菌（S.aureus，S.epidermidis）感染為主。當(dāng)病原菌侵入機(jī)體后，抗原提呈細(xì)胞對病原菌進(jìn)行吞噬處理，通過MHC 將抗原決定簇即抗原表位呈遞給CD4+T 細(xì)胞，進(jìn)而使CD4+T 細(xì)胞活化、增值，分化成輔助性T（Th）細(xì)胞和記憶性T 細(xì)胞。Th 細(xì)胞調(diào)節(jié)B細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞活化，并能調(diào)控和增強(qiáng)巨噬細(xì)胞等功能活性，從而發(fā)揮Th 細(xì)胞對固有免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)作用。在這一過程中，真正發(fā)動(dòng)抗感染免疫應(yīng)答的有效抗原部分是抗原表位，即B 細(xì)胞表位、CD4+T 細(xì)胞表位和CD8+T 細(xì)胞表位[22-23]。不同抗原是否存在共同表位能夠反映抗原間的交叉免疫原性。在金黃色葡萄球菌和鏈球菌抗感染免疫過程中，B 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和T 細(xì)胞特別是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答發(fā)揮著重要作用[25]。因此，研究在對葡萄球菌和鏈球菌GapC 交叉免疫原性分析時(shí)，著重分析了這些抗原表位。如果葡萄球菌和鏈球菌GapC 之間存在共同抗原表位，就說明存在著交叉免疫原性和交叉免疫保護(hù)作用。

通過研究分析，上述5 種細(xì)菌的GapC 均由336個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為35 kDa 左右，是具有親水性的非經(jīng)典分泌蛋白，且無規(guī)則卷曲占比較高，說明具有良好的抗原性。3 種鏈球菌GapC 非常保守，氨基酸序列同源性90.5%～94.0%，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的GapC 也非常保守，氨基酸序列同源性92.0%～92.3%；而3 種鏈球菌與2 種葡萄球菌之間GapC 的氨基酸序列同源性67.8%～69.9%。5 種細(xì)菌共存在4 個(gè)共同線性B 細(xì)胞表位。3 種鏈球菌的4 個(gè)線性B 細(xì)胞表位高度保守，其中表位1 完全一致；表位3 的187 位V 突變?yōu)镮，而I 與V 的性質(zhì)十分相似、分子量相相差較小，可能不會(huì)影響表位的性質(zhì)和功能；表位4 的271 位Y 變異為F，而Y 與F同屬芳香族氨基酸，也是性質(zhì)十分相似、分子量相差較小，可能對表位的性質(zhì)和功能影響不大；表位2 的102 位S 突變?yōu)镵、104 位A 突變?yōu)镋，如果這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸是表位關(guān)鍵氨基酸，可能會(huì)影響表位之間的交叉免疫原性和交叉反應(yīng)。此外，有研究證實(shí)這3 種鏈球菌間還存在鏈球菌特有的其他共同表位[26]，即3 種鏈球菌GapC 之間肯定存在明顯的體液交叉免疫原性和交叉反應(yīng)性。2 種葡萄球菌的4 個(gè)表位也高度保守，表位1、表位3 氨基酸序列完全一致；表位2 的104 位D 突變?yōu)镋，二者均為酸性氨基酸，性質(zhì)相近，E 僅比D 多出一個(gè)-CH2-，可能不會(huì)影響表位的性質(zhì)和功能；表位4 的268 位D（天冬氨酸）突變?yōu)镹（天冬酰胺），而二者分子量相近，僅一個(gè)化學(xué)基團(tuán)差別，可能二者的性質(zhì)和功能差別也不大，所以2 種葡萄球菌GapC 之間肯定存在明顯的體液交叉免疫原性和交叉反應(yīng)性。在上述葡萄球菌和鏈球菌的4個(gè)表位之間，表位1 存在50 位T 與M 的突變，已有研究證明該表位T 是關(guān)鍵氨基酸，其突變就導(dǎo)致了不再出現(xiàn)交叉反應(yīng)[26]；而其他3 個(gè)表位都存在多個(gè)氨基酸變異，很可能會(huì)影響鏈球菌與葡萄球菌GapC 之間的體液交叉免疫原性和交叉反應(yīng)性。但該判斷有待于實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。據(jù)報(bào)道[27]，在抗原B 細(xì)胞表位中，構(gòu)象性B 細(xì)胞表位具有更重要的價(jià)值，但研究未對構(gòu)象B 細(xì)胞表位進(jìn)行分析。

對CD4+T 細(xì)胞表位分析顯示，5 種菌存在著9個(gè)共同CD4+T 細(xì)胞表位，而且表位都相當(dāng)保守，菌株間的表位很少存在變異，即便存在變異如N 變異為E 或D、V 變異為L 或I、Q 變異為K 或E 等，它們突變氨基酸之間的分子量、性質(zhì)等相近，對CD4+T細(xì)胞表位的識(shí)別和應(yīng)答可能不會(huì)有明顯影響，進(jìn)而不會(huì)明顯影響CD4+T 細(xì)胞交叉免疫原性，由此認(rèn)為CD4+T 細(xì)胞表位的交叉免疫原性較強(qiáng)。而有關(guān)CD8+T細(xì)胞活化對奶牛乳腺炎鏈球菌和葡萄球菌的抗感染免疫作用未見明確報(bào)道，所以對CD8+T 細(xì)胞表位分析結(jié)果在此不進(jìn)行深入討論。

通過生物信息學(xué)分析表明，上述5 種病原菌的GapC 同源性較高，且免疫原性良好，3 種鏈球菌與2種葡萄球菌GapC 間存在一定的交叉免疫原性，為進(jìn)一步研究GapC 作為潛在的預(yù)防鏈球菌、葡萄球菌感染的基因工程亞單位疫苗抗原提供參考。