郝煜麗,梁文文,侯喜林,王建軍,胡春梅

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室,南京 210095)

不結(jié)球白菜(Brassicacampestrisspp.chinensisMakino),又稱小白菜、油菜,是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種作物,原產(chǎn)中國,具有營養(yǎng)豐富、生長周期短、適應(yīng)性強及產(chǎn)量高的特點,在中國及東南亞地區(qū)廣泛種植,是全球栽培的重要葉菜[1],在蔬菜均衡供應(yīng)中起到重要作用[2-3]?；ㄇ嗨厥歉叩戎参镏兄饕幕ㄉ豙4],屬于水溶性色素,在自然條件下不能穩(wěn)定存在,經(jīng)常與一個或多個糖苷結(jié)合形成花青苷(Anthocyanin)[5]?；ㄇ嗨厥窃醋员奖橥緩降奶烊稽S酮類化合物[6],廣泛分布于植物各組織器官中,可以使植物呈現(xiàn)紅、紫、藍(lán)等顏色,如紫色不結(jié)球白菜因其富含花青素而呈現(xiàn)紫葉性狀,也因其較高的食用品質(zhì)和觀賞價值而受到特別贊賞[7]。

不結(jié)球白菜作為主要的鮮食蔬菜,在評判時主要從外觀品質(zhì)、風(fēng)味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)三方面進(jìn)行考慮。其中,外觀品質(zhì)主要包括質(zhì)量、形狀、大小、色澤、病蟲害情況和耐貯藏運輸性等;風(fēng)味品質(zhì)主要是:芳香物質(zhì)及質(zhì)地特性;營養(yǎng)品質(zhì)則包括維生素、蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖類、胡蘿卜素和花青素含量等[8]。pH因子是植物生長發(fā)育過程中較為重要的因子,它可以從眾多方面對植物的生長發(fā)育以及最終品質(zhì)的形成造成影響,種植環(huán)境中pH水平的變化會對植物體內(nèi)各種生理生化代謝反應(yīng)產(chǎn)生影響,也會對色素的含量、結(jié)構(gòu)和分布造成影響。相關(guān)研究表明,提高花青素的pH會使植物顏色由紅色變?yōu)榉奂t色、紫色、藍(lán)色、綠色和黃色[9],不同 pH 環(huán)境下植物組織提取物的顏色和花青素含量不同[10]。但在不結(jié)球白菜中關(guān)于其品質(zhì)生成和花青素積累與培養(yǎng)液酸堿水平之間的關(guān)系尚不清楚。

本試驗通過對不結(jié)球白菜施用不同pH水平的營養(yǎng)液培養(yǎng),一段時間后測定葉片pH,光合特性、可溶性糖及可溶性蛋白含量、葉色呈現(xiàn)、花青素及葉綠素含量、相對酶含量等指標(biāo),以及定量分析花青素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平,探究施用不同pH營養(yǎng)液對不結(jié)球白菜品質(zhì)和花青素積累的影響,為不結(jié)球白菜的培育以及品質(zhì)改良提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試材料為不結(jié)球白菜,品種為紫色自交系‘紫冠’及其綠色突變體,種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院白菜系統(tǒng)生物學(xué)實驗室提供,22 ℃環(huán)境下催芽3 d,32穴盤育苗,在人工氣候室中生長(光照16 h/24 ℃,黑暗8 h/24 ℃)。待長至4片真葉時移栽至小方盆基質(zhì)栽培,采用1/2倍霍格蘭(Hoagland)營養(yǎng)液定期澆灌。自第14天開始轉(zhuǎn)用不同pH水平的全霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng),用0.1 mol·L-1的NaOH和0.1 mol·L-1的HCl緩沖液調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH,設(shè)置4個pH水平(3.0, 5.0,7.0,9.0)處理,每4 d進(jìn)行基質(zhì)澆灌和葉面噴施,每盆施用200 mL。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 葉片提取液pH的測定 參考叢心黎等[11]的方法,用pH計測其pH。

1.2.2 植株光合特性 植株光合參數(shù)使用便攜式光合作用測量系統(tǒng)(Li-6400)進(jìn)行測定,采用非直角雙曲線模型[12]對不結(jié)球白菜的光響應(yīng)曲線進(jìn)行擬合(光合有效輻射在0～1 500 μmol·m-2·s-1),再根據(jù)所擬合的光響應(yīng)曲線得到各處理不結(jié)球白菜的光合參數(shù)[13]。

1.2.3 可溶性糖、可溶性蛋白含量測定 參考孔祥會等[14]的方法,分別采用蒽酮比色法測可溶性糖,考馬斯亮藍(lán)染色法測定可溶性蛋白。

1.2.4 葉綠素含量測定 參照韋友歡等[15]的方法略有改動,采用乙醇丙酮混合液提取葉綠素,并置于440 nm、645 nm和663 nm波長下測定吸光度。

1.2.5 花青素含量測定 參照董慧杰等[16]的鹽酸甲醇浸提法,配置1%的鹽酸甲醇提取花青素并在530 nm和657 nm波長下測定吸光度。

1.2.6 CHI、PAL酶含量測定 PAL和CHI含量測定采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒(索萊寶提供),具體操作參考試劑盒說明書。

1.2.7 實時熒光定量 PCR 在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)設(shè)計定量引物,引物序列如表1所示。Actin作為內(nèi)參引物,在 7500 實時熒光定量 PCR 儀(Applied Biosystems) 上完成定量分析。生物學(xué)重復(fù)3次,相對定量計算參照 ΔΔCT 法[17]。

表1 試驗用引物序列Table 1 Primer sequence used in this study

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2017、IBM SPSS Statistics 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,統(tǒng)計圖采用Origin 2018 進(jìn)行繪制,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同pH水平對不結(jié)球白菜葉片pH的影響

對不結(jié)球白菜采用不同pH水平營養(yǎng)液培養(yǎng)一段時間,進(jìn)行植株葉片提取液的酸堿度測定。圖1顯示,當(dāng)營養(yǎng)液pH變化時,不結(jié)球白菜葉片提取液的pH也隨之變化,在處理的14～22 d變化幅度相對較大,22 d之后pH趨于平穩(wěn),且葉片終pH的高低順序與培養(yǎng)液pH水平一致。其中pH 7.0的處理組植株葉片pH變化幅度最小,終pH最接近初始值,變化最大的pH 9.0處理組。說明不同pH水平營養(yǎng)液對不結(jié)球白菜葉片pH的影響最小的是pH 7.0,最大的是pH 9.0。

圖1 不同pH水平培養(yǎng)下不結(jié)球白菜的葉片組織液pH Fig.1 Leaf tissue fluid pH of non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.2 不同pH水平對不結(jié)球白菜光合特性的影響

各處理不結(jié)球白菜的光響應(yīng)曲線變化趨勢總體相似(圖2)。具體表現(xiàn)為在較低光合有效輻射(PAR)(0～500 μmol·m-2·s-1)下,凈光合速率(Pn)急劇上升;在PAR大于500 μmol·m-2·s-1后,Pn上升變慢,趨于平緩。綠色突變系(圖2-B)的整體光合作用能力強于‘紫冠’(圖2-A)。紫色品種中,pH 3.0處理組的光響應(yīng)曲線位置最高,而pH 5.0和pH 7.0處理組光合曲線水平相近,pH 9.0水平最低,即Pn在pH 3.0水平最高,其次是pH 5.0和pH 7.0處理組,pH 9.0最低。但在綠色品種中,4條曲線高低明顯,呈現(xiàn)為pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0,Pn也是pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0。說明紫色品種在酸性環(huán)境下(pH 3.0)光合能力最強,而綠色品種在弱酸性環(huán)境中(pH 5.0)光合能力更強,且強于紫色品種。

A.‘紫冠’;B. 綠色突變體

表2 不同pH水平培養(yǎng)下不結(jié)球白菜光響應(yīng)特征參數(shù)Table 2 Light response characteristic parameters of non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

根據(jù)所擬合的光響應(yīng)曲線得到光合參數(shù)(表2),如最大凈光合速率(Pnmax)、光補償點(LCP)、表觀量子效率(AQE)以及暗呼吸速率(Rd)。擬合結(jié)果表明,綠色突變體的AQE高于‘紫冠’,說明綠色品種利用弱光的能力大于紫色品種。兩品種pH 5.0和pH 7.0的AQE大于另外兩處理,即pH 5.0和pH 7.0處理組植株利用弱光的能力高于其他處理。紫色品種在pH 3.0的處理下Pnmax最高,而綠色品種則是pH 5.0時Pnmax最高,且綠色品種的Pnmax都高于同處理水平紫色品種。說明紫色品種在酸性環(huán)境下光合能力更強,而綠色品種弱酸性條件下的光合能力更強且強于紫色品種。紫色品種pH 5.0處理組LCP最小,而綠色品種pH 3.0 的LCP最小,表明各自最耐陰條件為pH 5.0和 pH 3.0。

2.3 不同pH水平對不結(jié)球白菜葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

從表3可見,兩葉色品種的可溶性糖含量都隨pH水平由酸性至堿性變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,且可溶性糖含量增長最多的都是pH 7.0的處理,紫葉植株每毫升提取液的可溶性糖增加了34.33 μg,綠葉品種增加了 60.62 μg;其次是pH 5.0處理組,分別增加了30.65 μg和60.03 μg,與pH 7.0處理組增長量接近,增長量最低的是pH 9.0處理。即在可溶性糖積累方面, pH 7.0>pH 5.0>pH 3.0>pH 9.0?？扇苄缘鞍自鲩L量也是pH 5.0與pH 7.0處理組增長量接近且較高。說明弱酸性和中性條件(pH 5.0～pH 7.0)更有利于不結(jié)球白菜葉片可溶性糖和蛋白的積累。

表3 不同pH水平培養(yǎng)下不結(jié)球白菜可溶性糖和可溶性蛋白含量的變化Table 3 Change of soluble sugar and protein content in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.4 不同pH水平對不結(jié)球白菜葉色呈現(xiàn)的影響

通過觀測圖3中所有處理的不結(jié)球白菜植株生長情況發(fā)現(xiàn),綠色突變體(圖3-B)的整體生長水平優(yōu)于‘紫冠’(圖3-A)。在‘紫冠’的葉色呈現(xiàn)中,pH 5.0和pH 7.0處理組葉片的紫色較深,pH 3.0和pH 9.0處理組紫色顯著淺于其他處理,說明pH 5.0和pH 7.0培養(yǎng)條件更有利于紫色的呈現(xiàn)。而在綠色突變體中,pH 5.0處理的植株葉片綠色最深,pH 3.0次之,pH 7.0和pH 9.0最淺,說明pH 5.0的培養(yǎng)條件更有利于綠色的呈現(xiàn)。

A.‘紫冠’;B. 綠色突變體

‘紫冠’葉綠素含量變化整體小于綠色突變體(表4)。‘紫冠’在pH 5.0和pH 7.0處理下葉綠素含量增長較為明顯,pH 3.0幾乎無增長,pH 9.0的處理葉綠素含量有所下降。綠色突變體中,除pH 9.0外,其他處理組植株葉綠素含量都增加,其中,pH 5.0處理下增長量最多,增加了0.30 mg·mL-1,依次是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0。說明pH 5.0的培養(yǎng)條件更有利于葉綠素積累,與圖3-B葉片綠色呈現(xiàn)規(guī)律一致?！瞎凇ㄇ嗨刈兓空w高于綠色突變體(表4)。pH 5.0和pH 7.0處理組花青素總增長量顯著高于其他處理,pH 5.0處理組花青素總增長量最大,說明pH 5.0的培養(yǎng)條件更有利于葉片花青素的積累,符合圖3-A葉片紫色呈現(xiàn)規(guī)律。綠色突變體花青素變化規(guī)律類似但變化范圍較小,因其花青素含量低于‘紫冠’。

表4 不同pH水平培養(yǎng)下不結(jié)球白菜葉綠素和花青素含量的變化Table 4 Changes of chlorophyll and anthocyanin content in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

2.5 不同pH水平對不結(jié)球白菜葉片花青素合成相關(guān)酶含量的影響

探究不同pH水平處理對紫葉品種的不結(jié)球白菜葉片花青素合成通路中的關(guān)鍵酶含量影響,結(jié)果顯示,查爾酮異構(gòu)酶(CHI)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的含量均存在顯著差異(圖4)。但查爾酮異構(gòu)酶含量在不同pH處理之間的差異比苯丙氨酸解氨酶更加明顯。兩種酶的相對含量都在pH 5.0處理時最高,在pH 9.0時最低。此結(jié)果與“2.4”中‘紫冠’不結(jié)球白菜葉片在不同pH水平下的花青素含量測定結(jié)果一致。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 不同pH水平對不結(jié)球白菜花青素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)水平的影響

以綠色突變體在pH 3.0條件下的基因表達(dá)量為“1”得到花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因及正調(diào)控基因的相對表達(dá)量如表5?；ㄇ嗨睾铣申P(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因BcCHS、BcCHI、BcF3H和BcDFR在兩品種中表達(dá)規(guī)律大致相同,即pH 5.0處理下表達(dá)量最高,pH 9.0最低。而且花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在弱酸環(huán)境(pH 5.0)表達(dá)總量最多。花青素合成關(guān)鍵正調(diào)控基因BcTT8同樣是pH 5.0時表達(dá)量最高,依次是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0>pH 9.0,BcTTG1規(guī)律相同但總體表達(dá)量差異并不大,說明在弱酸性環(huán)境下,更有利于花青素正向調(diào)控基因(BcTT8,BcTTG1)表達(dá),且BcTT8對pH條件更敏感。

表5 不同pH水平下不結(jié)球白菜花青素合成相關(guān)基因的相對表達(dá)量Table 5 Relative expression levels of genes related to anthocyanin synthesis in non-heading Chinese cabbage cultured with different pH levels

3 討 論

在蔬菜培育過程中,營養(yǎng)液pH往往會間接地影響蔬菜的生長和品質(zhì)[18]。例如,周思婕等[19]研究發(fā)現(xiàn)酸脅迫可通過影響植株光合能力從而影響植物的生長和最終品質(zhì)的形成,而光響應(yīng)曲線可以直觀地反映出植物葉片凈光合速率(Pn)伴隨著光合有效輻射(PAR)增減的變化規(guī)律[20]。本試驗對紫葉品種的4個處理組而言,pH 3.0條件下凈光合速率最大,其次是pH 5.0和pH 7.0處理水平的植株凈光合速率接近,而在綠葉品種中凈光合速率大小規(guī)律是pH 5.0>pH 7.0>pH 9.0>pH 3.0,這極有可能是因為不同品種的不結(jié)球白菜對酸脅迫的耐受力不同,從而對植株光合能力大小的影響也不同。紫色品種對酸脅迫的耐受力更強,而綠葉品種更傾向于弱酸性和中性環(huán)境。另外,本試驗通過對可溶性糖及可溶性蛋白含量變化分析可知,弱酸性和中性營養(yǎng)液(pH 5.0～7.0)更有利于不結(jié)球白菜葉片可溶性糖和可溶性蛋白的積累。兩個品種不結(jié)球白菜的葉綠素的總增長量都是pH 5.0>pH 7.0>pH 3.0>pH 9.0,這也與廖月[21]在多肉中的研究結(jié)果相符,即偏酸、堿性環(huán)境與弱酸性環(huán)境相比,葉綠素合成減弱。綜上可知,pH水平為 5.0～7.0的環(huán)境更有利于提升不結(jié)球白菜的品質(zhì),這可能與不同pH條件下營養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度不同和不結(jié)球白菜對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化程度不同,以及不結(jié)球白菜對酸堿水平的耐受力有關(guān)。

另外,前人研究表明,植物葉片細(xì)胞內(nèi)的pH可通過影響花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶活性以及關(guān)鍵基因的表達(dá)量來影響花青素的表達(dá),從而影響葉色呈現(xiàn)[22]。本試驗中,不同酸堿水平培養(yǎng)的植株葉片組織pH與培養(yǎng)液高低顯著相關(guān),且葉片pH的高低順序與培養(yǎng)液pH的高低順序一致。而且在紫葉品種的不結(jié)球白菜中,pH 5.0和pH 7.0處理水平的植株紫色性狀表達(dá)的更明顯,pH 5.0處理組植株無論是在花青素總增長量還是CHI、PAL酶活性上都要顯著高于其他處理,而且相比強酸性(pH 3.0)的環(huán)境而言,弱酸性(pH 5.0)環(huán)境更有利于紫葉不結(jié)球白菜花青素的合成,從實時熒光定量PCR結(jié)果中看花青素合成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和正調(diào)控基因的相對表達(dá)量pH 5.0條件下表達(dá)總量最多,進(jìn)一步印證了這一結(jié)論,這一結(jié)論也與袁濤等[23]研究結(jié)果相符。說明不同pH水平通過影響不結(jié)球白菜葉片的pH,進(jìn)而影響花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)以及花青素合成相關(guān)酶活性,從而調(diào)控花青素合成與積累,影響葉片的呈色,且在pH 5.0時最有利于不結(jié)球白菜的花青素積累。

綜上,本試驗通過對不結(jié)球白菜施用不同pH水平營養(yǎng)液,觀測植株生長情況及葉色呈現(xiàn),測定一系列生理指標(biāo)以及花青素合成關(guān)鍵基因表達(dá)量,初步得出結(jié)論如下:不同pH水平培養(yǎng)液對不結(jié)球白菜品質(zhì)以及花青素的積累都有顯著影響。其中,pH 5.0～pH 7.0的酸堿水平在不結(jié)球白菜品質(zhì)方面和白菜葉色性狀呈現(xiàn)上都有較好的影響,弱酸性(pH 5.0)環(huán)境更利于不結(jié)球白菜花青素積累。此外,若需要得出更精確的影響規(guī)律則需要進(jìn)一步精細(xì)化分處理水平以及擴(kuò)大樣本數(shù)量。