黃雪靜,簡少芬,劉愛佳,雷 明,鐘 楚,繆劍華,,

(1.廣西醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,南寧 530021;2.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室,南寧 530023;3.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心,南寧 530023;4.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,南寧 530200)

植物花芽分化是從營養(yǎng)生長期向生殖生長期轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志,開花期是關(guān)系到植物繁衍后代的重要生育時期[1-3]。植物的開花時間主要受五個遺傳途徑調(diào)控:內(nèi)源性衰老[4-5]、赤霉素途徑[6]、光周期誘導(dǎo)[7]、春化途徑[8]和自主途徑[9]。植物從營養(yǎng)生長期向生殖生長期過渡,伴隨著體內(nèi)碳水化合物積累的變化[10-12]。例如,石蒜的可溶性糖含量在葉期、花期和花期后呈先上升后下降再回升趨勢,淀粉含量在葉期至花芽期呈上升趨勢[13];咖啡開花后葉片可溶性糖和淀粉含量呈下降趨勢[14];全葉馬蘭開花前后根部的可溶性碳水化合物呈先下降后持續(xù)上升趨勢[15];擬南芥無淀粉粒突變體pgm和淀粉合成過表達體sex1在光照短于16 h時都具有晚開花表型[16]。此外,外源施加蔗糖、海藻糖等能夠直接或間接地調(diào)節(jié)擬南芥葉片中蔗糖濃度及淀粉的積累或降解,促使其由葉期向花期轉(zhuǎn)換[4,17-23]。這些研究結(jié)果表明,碳水化合物在植物開花時間的調(diào)控中扮演了重要角色。

植物體內(nèi)碳水化合物中的海藻糖-6-磷酸(Trehalose 6-phosphate,T6P)被認(rèn)為是調(diào)控植物開花的關(guān)鍵代謝物[21-22,24-25],其由海藻糖-6-磷酸合酶(Trehalose 6-phosphate synthase,TPS)催化葡萄糖-6-磷酸(Glucose 6-phosphate,G6P)和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)反應(yīng)生成,T6P進一步由海藻糖磷酸磷酸化酶(Trehalose 6-phosphate phosphatase,TPP)去磷酸化作用生成海藻糖和無機磷酸鹽[23,26-27],而后經(jīng)海藻糖酶降解為葡萄糖。在模式植物擬南芥中,有11個AtTPSs和10個AtTPPs基因分別調(diào)控T6P合成和代謝。不同的AtTPS基因在擬南芥不同器官中表達模式存在較大差異[25,28],其中AtTPS1在野生型胚胎發(fā)育過程中的表達不斷增加,在幼苗、根、葉、莖、花和果實中均能觀察到。AtTPS1能夠調(diào)控植物開花時間,其介導(dǎo)合成的T6P還能促進胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)[4,24]。AtTPS1缺失突變體植株發(fā)育嚴(yán)重不良,根系生長減少,不能開花甚至胚胎致死[25,29-30],而擬南芥過表達TPS1則生長速度明顯快于野生型,且能夠促進海藻糖-6-磷酸積累并提前開花[29]。這些研究結(jié)果表明,TPS1在控制植物開花過程中起著關(guān)鍵作用。

開花期也是1年生藥用植物活性成分積累的關(guān)鍵時期。研究表明,開花前黃芩地上部的黃酮類有效成分黃芩苷、黃芩素最高,開花后根部的黃芩苷快速積累而莖葉的黃芩苷含量則顯著下降[31-32];野老鸛草在開花后酚類有效成分沒食子酸及鞣花酸的含量上升,在果期最高[33];穿心蓮則在始花期時其二萜內(nèi)酯類有效成分穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯含量最高,且盛花期二者含量開始下降[34]。因此,調(diào)控植物開花期對藥用植物活性成分的生產(chǎn)及新品種的選育和改良具有重要意義。

有關(guān)TPS基因克隆和遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究在擬南芥[25-26]、木薯[35]、茶樹[36]、丹參[37]、玉米[38]、百合花[39]等植物中已有相關(guān)報道,在模式植物擬南芥中對AtTPS1基因的克隆和遺傳調(diào)控的研究比較深入[4,25-30]。然而,目前尚未有穿心蓮中關(guān)于TPS1基因的相關(guān)報道。本文在對穿心蓮海藻糖-6-磷酸合酶1基因(命名為ApTPS1)的生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,比較穿心蓮不同器官、不同生態(tài)型及其在不同光周期下該基因的表達差異,旨在明確ApTPS1與穿心蓮開花期的關(guān)系,為后期進一步研究ApTPS1調(diào)控穿心蓮開花期與內(nèi)酯合成的關(guān)系及穿心蓮優(yōu)良品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

以爵床科穿心蓮屬植物穿心蓮(Andrographispaniculata(Burm.f.) Nees)為試驗材料,通過系統(tǒng)選育篩選出開花期存在明顯差異的4株植株(早花型和晚花型各2株),經(jīng)3代純化,選擇性狀穩(wěn)定且一致的后代種子用于本研究。

穿心蓮種子于2021年谷雨(4月20日)播種,6月1日大田移栽。移栽時幼苗3對真葉,種植株行距為20 cm×30 cm,統(tǒng)一水肥管理。早花型材料于8月下旬進入開花期,晚花型材料于9月下旬進入開花期。于2021年8月14日取兩個材料上部葉片及老葉、新葉、花蕾、已開放的花和未成熟果實(幼果),液氮冷凍,-80 ℃保存,用于RNA提取。

光周期試驗在人工光照培養(yǎng)室進行,以早花型和晚花型各1個材料為研究對象。幼苗長至第1對真葉時移栽到花盆中進行土培,將兩個材料分別置于短光照(10 h/14 h,光/暗,下同)、中光照(12 h/12 h)和長光照(14 h/10 h)條件下,光量子通量密度為200 μmol·m-2·s-1。統(tǒng)一水分管理。生長1個月后取新鮮葉片提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進行ApTPS1基因的表達量測定。

1.2 ApTPS1基因的克隆

新鮮葉片樣品用液氮冷凍后-80 ℃保存。將冷凍的穿心蓮樣品置于液氮預(yù)冷的滅菌研缽中,加入液氮將其磨碎后,利用Trans Zol Up Plus RNA Kit試劑盒(全式金生物,北京)提取穿心蓮葉片總RNA,以總RNA為模板,采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNASynthsisSuperMix試劑盒(全式金生物,北京)合成cDNA第一鏈。根據(jù)廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室測得的穿心蓮全長轉(zhuǎn)錄組序列集篩選到ApTPS1基因序列,利用 Primer 5.0 軟件設(shè)計cDNA全長克隆引物:正向引物GGGGAAAGGACCATCACAATCAAAT;反向引物CAAACAAACTTATAGAGAGTGAACTCATTCCAC。以穿心蓮葉片cDNA為模板,采用普通PCR方法克隆ApTPS1基因,擴增反應(yīng)體系為:cDNA 1.5 μL,正反向引物(10 μmol·L-1)各1 μL,KOD高保真酶1 μL,10×Buffer 5 μL,dNTPs(2 mmol·L-1)5 μL, MgSO4(25 mmol·L-1)3 μL,加RNase-free ddH2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序為: 94 ℃,2 min;98 ℃,10 s;54 ℃,30 s;68 ℃,2.5 min; 72 ℃,5 min;4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在室溫條件下連接到通用載體pCE2-TA/Blunt-Zero vector(諾唯贊生物,南京),轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1(全式金生物,北京),將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂抹在含有X-gal、ITPG和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上,封膜后37 ℃倒置培養(yǎng) 12 h,用滅菌槍頭挑取白色陽性單菌落,置于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r·min-1條件培養(yǎng) 12 h。選取渾濁的菌液采用通用引物M13R和M13F進行菌液PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,選取陽性克隆菌液送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用 NCBI在線工具 ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)、CD-Search(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找該序列的開放閱讀框、蛋白保守結(jié)構(gòu)域和同源序列;ExPASyProtParam(https://web.expasy.org/protparam)在線分析分子特性,ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)在線預(yù)測蛋白/親疏水性,SignalP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? Signal P-5.0)進行信號肽分析,TRMHMM server v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/ services/TMHM M-2.0/)進行跨膜結(jié)構(gòu)域分析;使用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)工具分析蛋白二級結(jié)構(gòu),SWISS-MODEL(https://www.expasy.org/resources/swiss-model)在線預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu);利用PSORTⅡ pre-diction(https://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測亞細(xì)胞定位;利用DNAMAN軟件進行多重序列比對;利用 MEGA-X軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,節(jié)點支持率使用 100 次 Bootstrap 檢驗。

1.4 ApTPS1基因表達量測定

采用qRT-PCR方法分析不同表型材料、不同器官及不同光周期條件下穿心蓮ApTPS1基因的表達水平,利用Primer 5.0 軟件設(shè)計qRT-PCR引物:正向引物AGGACTTTGCCATCTC-G;反向引物TACACCGCAGCTACACG。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系按照試劑盒說明書(全式金生物,北京):cDNA 2 μL,正反向引物各0.4 μL,2×Perfect StartTMGreen qPCR Super Mix 10 μL,Passive Reference Dye(50×)0.4 μL,加RNase-free ddH2O至總體積20 μL。反應(yīng)程序為:Hold stage:1.6 ℃·s-1,94 ℃,30 s。PCR stage: 1.6 ℃·s-1,94 ℃,5 s;60 ℃,15 s;72 ℃,10 s,共40個循環(huán)。Melt Curve stage: 1.6 ℃·s-1,95 ℃,15 s;60 ℃,60 s;95 ℃,1 s。采用2-△△Ct法進行相對定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013對數(shù)據(jù)進行處理和作圖,顯著性檢驗采用SPSS 19.0軟件中單因素方差分析、獨立樣本t檢驗等方法進行分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApTPS1基因克隆及分子特性分析

以穿心蓮葉片cDNA為模板,利用設(shè)計的全長引物克隆,將目的片段連接到通用載體pCE2-TA/Blunt-Zero vector中,采用M13雙向測序、拼接后得到一條3 354 bp的序列,與預(yù)期大小相近(圖1),與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的序列一致,命名為ApTPS1。對該基因保守區(qū)預(yù)判,顯示該基因編碼的蛋白質(zhì)同時具有N端的TPS(位于1 397～ 2 794 bp)和C端的TPP(位于638～1 300 bp)保守結(jié)構(gòu)域,C端TPP結(jié)構(gòu)域缺乏磷酸水解酶/磷酸轉(zhuǎn)移酶的3個保守基序(LDYD—GD—T—LM—和 GDDRSD)[40]。對其分子特性進行分析,結(jié)果顯示ApTPS1包含一個2 787 bp的開放閱讀框,編碼928個氨基酸殘基,其中含量最高為亮氨酸(Leu),含量最低為半胱氨酸(Cys);蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為105 178.82 u,理論等電點(pI)為6.67,酸性氨基酸有109個,堿性氨基酸有114個;親水性(GRAVY)為 -0.453,屬于親水性蛋白;不穩(wěn)定指數(shù)為45.08,屬于不穩(wěn)定蛋白;信號肽分析顯示該蛋白無信號肽;跨膜域分析結(jié)果表明ApTPS1蛋白為非跨膜蛋白。

a.穿心蓮 ApTPS1的普通PCR擴增結(jié)果;M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL5000);1. ApTPS1的PCR擴增產(chǎn)物; b.穿心蓮 ApTPS1的通用載體構(gòu)建,插入位點為TOPO binging site(412～421 bp)a.the normal PCR amplification of ApTPS1 of Andrographis paniculata;M.DNA marker(DL5000);1.PCR amplification product of ApTPS1;b.indicates the general vector construction of ApTPS1 of Andrographis paniculata,the insertion site is TOPO binging site (412-421 bp)圖1 穿心蓮 ApTPS1的克隆Fig.1 Cloning of ApTPS1 of Andrographis paniculata

2.2 ApTPS1同源性比對及系統(tǒng)進化樹分析

NCBI BLAST結(jié)果顯示,穿心蓮TPS1氨基酸序列與丹參Salviasplendens(XP_042042550.1)、鳳梨Handroanthusimpetiginosus(PIN19818.1)、芝麻Sesamumindicum(XP_011098162.1)、煙草Nicotianatabacum(NP_001312790.1)、松蒿Phtheirospermumjaponicum(GFP78691.1)、山茶Camelliasinensis(XP_028106857.1)、擬南芥Arabidopsisthaliana(NP_177979.1)等植物的相似度均達到80%以上,表明該蛋白序列與多種植物的TPS1的同源性較高。將其以FASTA 格式下載,利用DNAMAN 軟件進行同源性比對,結(jié)果表明,穿心蓮TPS1與其他植物TPS1均存在2個高度保守位點,即參與結(jié)合G6P底物的位點(Arg90、Trp129、Tyr166、Trp175 和 Arg397)和參與結(jié)合UDP-葡萄糖底物的位點(Gly111、Asp277、His251、Arg359、Asp458 和 Glu466)(圖2),Asp458和 Glu466標(biāo)志著糖原磷酸化酶糖基轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)域(“1”和“2”)和糖原磷酸化酶糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycogen phosphorylase glycosyltransferase,GPGTF)家族共有的保守位點[41-42]。為進一步分析 ApTPS1蛋白與其他物種TPS1蛋白之間的關(guān)系,利用MEGA-X的鄰近法構(gòu)建ApTPS1的系統(tǒng)進化樹(圖3),結(jié)果顯示穿心蓮TPS1在進化上與鳳梨TPS1親緣關(guān)系最近,與芝麻TPS1親緣關(guān)系也較近,而與擬南芥和煙草的TPS1的親緣關(guān)系較遠。

圖2 穿心蓮ApTPS1氨基酸序列與其他物種的TPS1氨基酸序列的多重比較Fig.2 Multiple alignments of amino acid sequence of ApTPS1 of Andrographis paniculata with TPS1s from other species

圖3 不同植物的TPS1蛋白的系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of TPS1 protein from different plants

2.3 ApTPS1蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

ApTPS1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示(圖4),該蛋白由33.41%的α-螺旋,49.03%的無規(guī)則卷曲和17.56%的β-折疊組成,無β-轉(zhuǎn)角,無規(guī)則卷曲是其主要結(jié)構(gòu)。利用SWISS-Model在線預(yù)測和同源建模穿心蓮TPS1蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖5),結(jié)果表明, ApTPS1蛋白為同源二聚體,參考模板為α,α-trehalose-phosphate synthase 蛋白(PDB:5hut.1.A),兩者氨基酸序列相似性達到50.33%。亞細(xì)胞定位預(yù)測分析該蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(52.25%),其次分布在細(xì)胞核中 (34.8%),再次為線粒體(8.7%)和囊泡(4.3%)。

綠色部分為 ApTPS1蛋白結(jié)構(gòu)域中的糖原磷酸化酶糖基轉(zhuǎn)移酶家族的活性位點;紅色部分為11個重要的氨基酸The green parts are the active site of the glycogen phosphorylase glycosyltransferase family in the protein domain of ApTPS1;the red parts are 11 important amino acids圖5 SWISS-Model模擬穿心蓮 ApTPS1蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure prediction of ApTPS1 from Andrographis paniculata by SWISS-Model

2.4 ApTPS1基因表達特征分析

2.4.1ApTPS1在穿心蓮不同器官中的表達差異 穿心蓮不同器官(老葉、新葉、花蕾、花、果實)中的ApTPS1基因的表達分析發(fā)現(xiàn)(圖6-A),ApTPS1在開放的花中的表達量最高,其次為幼果,而在老葉、新葉和花蕾中的表達量較低且三者之間無顯著差異。

A.穿心蓮不同器官中 ApTPS1基因的差異表達;B.不同生態(tài)型穿心蓮葉片 ApTPS1基因的差異表達,E1、E2均為早花型,L1、L2均為晚花型;C.不同光周期處理下穿心蓮葉片 ApTPS1基因的差異表達分析,LD為長光照,SD為短光照,ND為中光照;采取Duncan’s法進行多重比較,圖柱上不同字母表示在P<0.05水平差異顯著A.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in different organs; B.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in leaves of different ecotypes,E1 and E2 are early-flowering materials,and L1 and L2 are late-flowering materials; C.Differential expression analysis of ApTPS1 gene in leaves under different photoperiod treatments,LD means long day,SD means short day and ND means normal day; The Duncan’s method was used for multiple comparisons.Different letters on the bars represent significantly different at the P<0.05 level圖6 穿心蓮 ApTPS1基因在不同器官、不同生態(tài)型及光周期處理下的差異表達Fig.6 Differential expression of ApTPS1 gene of Andrographis paniculata in different organs,different ecotypes and photoperiodic treatments

2.4.2 不同生態(tài)型穿心蓮及光周期處理對ApTPS1基因表達的影響 利用RT-qPCR對不同生態(tài)型的穿心蓮葉片ApTPS1進行差異表達分析,發(fā)現(xiàn)早花型穿心蓮的ApTPS1基因表達量顯著高于晚花型(圖6-B)。通過不同光周期處理,分析穿心蓮葉片ApTPS1的差異表達,如圖6-C所示,早花型在各光周期條件下ApTPS1的表達水平均高于晚花型。不同光周期對晚花型穿心蓮ApTPS1基因的表達沒有顯著影響,短光照(SD)下早花型的ApTPS1的表達量顯著高于長光照(LD)。LD下晚花型植株葉片中ApTPS1基因表達量與早花型植株差異不顯著,而在SD和中光照(ND)下晚花型植株葉片中ApTPS1的表達量顯著低于早花型。

3 討論與結(jié)論

T6P是植物調(diào)控開花的信號分子,其合成酶TPS1蛋白中有兩個保守位點分別結(jié)合G6P底物和UDP-葡萄糖底物,可催化葡萄糖從UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)移到G6P生成T6P和UDP,進一步由海藻糖酶催化T6P生成海藻糖,是高等植物TPS-TPP生物合成途徑的關(guān)鍵酶。本試驗基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)首次從穿心蓮中擴增得到 1 條編碼區(qū)為 2 787 bp的TPS1基因全長序列,分析表明,穿心蓮的TPS1氨基酸序列具有兩個極度保守的位點:參與結(jié)合G6P底物的位點(Arg90、Trp129、Tyr166、Trp175 和 Arg397)和參與結(jié)合 UDP-葡萄糖底物的位點(Gly111、Asp277、His251、Arg359、Asp458 和 Glu466)。由于物種不同,這兩個保守位點的各個活性氨基酸位置與擬南芥不同[41],其中,Asp458所在的RDGMNLVS區(qū)域和Glu466所在的EFVA區(qū)域共同標(biāo)志著糖原磷酸化酶糖基轉(zhuǎn)移酶的保守區(qū)域(“1”和“2”),同時第458位的Asp和第466位的Glu也被認(rèn)為是糖原磷酸化酶糖基轉(zhuǎn)移酶(Glycogen phosphorylase glycosyltransferase,GPGTF)家族共有的保守位點[41-42]。

植物從營養(yǎng)生長期到生殖生長期的轉(zhuǎn)換受體內(nèi)糖信號的調(diào)控[13-15]。外源施加蔗糖能促進擬南芥從葉期過渡到花期[4,17-23],且伴隨著TPS1和TPPB基因的表達增強,表明海藻糖代謝途徑的相關(guān)酶參與糖信號調(diào)控的植物開花[43]。許多研究表明,TPS1在植物胚胎發(fā)育和調(diào)控開花的過程中扮演至關(guān)重要的角色。擬南芥缺失TPS1不開花,且會導(dǎo)致植物形成胚胎致死型突變體,而過表達TPS1或tps1缺失突變體恢復(fù)表達TPS1使胚胎發(fā)育正常,但純合子突變體植株即使恢復(fù)TPS1表達仍表現(xiàn)為生長緩慢,開花期延遲[1,12,24,29-30]。本研究結(jié)果表明,ApTPS1在穿心蓮花中和幼果中的相對表達量較高,而在葉中的表達量較低,表明ApTPS1也可能參與穿心蓮胚胎發(fā)育,且與擬南芥中的TPS1具有相似的功能。對不同開花期穿心蓮進行比較發(fā)現(xiàn),早花型ApTPS1的表達量遠高于晚花型ApTPS1的表達量,進一步說明ApTPS1表達水平與穿心蓮的開花期之間存在密切關(guān)系。有意思的是,對兩個不同開花期材料進行光周期誘導(dǎo),并未改變ApTPS1在材料之間的表達差異,而早花型材料在不同光照條件下的表達顯著差異。結(jié)果說明,ApTPS1可能參與了植物自主開花的調(diào)控過程,與光周期誘導(dǎo)的開花通路相對獨立。

開花期是許多藥用植物有效成分積累的關(guān)鍵時期[31-34]。已有研究表明,隨著生育期的變化,穿心蓮內(nèi)酯、脫水穿心蓮內(nèi)酯類等有效成分的積累呈現(xiàn)出先上升后下降變化,在始花期含量最高[34,44]。此外,開花期較晚的穿心蓮品種的生物量和內(nèi)酯含量都較高[44]。ApTPS1作為與穿心蓮開花期密切相關(guān)的因子,與穿心蓮內(nèi)酯成分的合成之間必然存在一定的聯(lián)系。糖在促進藥用植物次生代謝方面起到重要的作用[45],筆者前期研究也表明,糖和淀粉積累有利于穿心蓮內(nèi)酯的合成和積累[46-47]。ApTPS1是聯(lián)系植物糖代謝與開花時間的重要樞紐,ApTPS1基因的克隆對深入研究穿心蓮內(nèi)酯合成與開花期的耦合關(guān)系,揭示穿心蓮內(nèi)酯合成的調(diào)控機制,并為其它植物的類似研究奠定良好的研究基礎(chǔ)。ApTPS1因此也可以作為選育高內(nèi)酯含量的穿心蓮優(yōu)良種質(zhì)資源的候選基因,對后期篩選穿心蓮優(yōu)良品種的培育提供理論依據(jù)。