孫文韜,張志浩,張古月,任廣鑫,于澄宇

(西北農林科技大學 農學院,陜西楊陵 712100)

漬害即濕害,指土壤水分過飽和,超過田間持水量,使作物根系或全株長期生活在嫌氣環(huán)境中,因缺氧導致其一系列生理代謝過程改變,嚴重危害作物生長發(fā)育及產(chǎn)量形成的現(xiàn)象[1]。油菜是世界各地廣泛種植的油料作物之一[2],中國是世界油菜生產(chǎn)大國,長江流域是中國冬油菜栽培的主要區(qū)域,其產(chǎn)量和面積約占全國的90%[3]。然而,該區(qū)域常年濕潤多雨,尤其3、4、5月多發(fā)陰雨天氣,與油菜產(chǎn)量形成的關鍵時期重合,加之產(chǎn)區(qū)實行水旱一年兩熟制度,油菜-水稻輪作使得土壤黏度增大、通透性變差,更加容易導致漬害的發(fā)生;同時,因為田間較高的濕度,春季較高的溫度,導致漬害與病害常常相伴而生[4-5],這更加危害油菜產(chǎn)量構成因素的形成和物質積累,易造成大幅減產(chǎn)和油菜籽品質不佳的問題。更為嚴重的問題是,近年來隨著農村勞動力轉移和產(chǎn)業(yè)結構調整,輕簡化種植成為長江流域冬油菜栽培方式演變的主流方向[6],傳統(tǒng)解決苗期漬害的主要手段-育苗移栽已經(jīng)逐漸不適應產(chǎn)業(yè)要求,油菜直播比例正在逐年增加且必將成為主要栽培方式[7],這導致苗期漬害一躍成為直播油菜成苗(seedling establishment)的卡脖子問題。

目前學界對油菜耐漬的研究總體較少,主要集中在耐漬油菜種質篩選鑒定以及漬害對油菜生理、產(chǎn)量和品質的影響上,而油菜耐漬分子遺傳和基因定位方面的研究進展緩慢[8-9]。

在油菜材料漬性鑒定方面,前人所用方法不盡相同。Burgos等[10]選取發(fā)芽小麥種子進行水淹脅迫以研究其耐漬性,對后來國內耐漬油菜鑒定工作產(chǎn)生較大影響。范其新等[11]在發(fā)芽期對油菜露白種子水淹24 h,通過其后續(xù)生長情況以鑒定耐漬性,但此方法采用濾紙床以進行材料的后續(xù)培養(yǎng),由于根系因淹水而受損,子葉較重等因素,導致幼苗不能正常固定,產(chǎn)生試驗誤差。而后陳潔等[12]、張學昆等[13]在快速篩選甘藍型油菜耐漬材料時,對其方法進行改良,仍取發(fā)芽期露白種子水淹處理,但以細砂床代替濾紙床固定幼苗,且將水淹時間縮短為12 h進行漬性鑒定,取得良好效果。李云等[14]對50份油菜種質材料在苗期進行漬性鑒定,在幼苗子葉長至平展時全淹6 d以模擬漬害脅迫,將鑒定結果與已知耐漬系數(shù)的材料比較,初步建立了一套油菜苗期漬性篩選的方法。Lee等[15-16]在幼苗兩葉期漬水,脅迫時間存在36 h、72 h、3 d和6 d的差異。張樹杰等[17]則采用盆栽試驗,在幼苗四葉期定苗,五葉期開始時長分別為3 d、6 d、9 d的漬水處理。李玲等[18]更是從五葉期開始進行了長達31 d的漬水脅迫以研究其對冬油菜生長生理的影響。以上均是通過室內試驗模擬田間漬害脅迫,因其試驗過程中的環(huán)境因子可控與穩(wěn)定等特點,成為目前主要的油菜耐漬鑒定研究方法,但也不乏存在學者直接通過大田試驗進行油菜耐漬性鑒定,如Ploschuk等[19]通過大田試驗探討小麥、大麥、油菜、豌豆在營養(yǎng)期和生殖期遭遇漬害時表現(xiàn)出的耐受性差異。陳娟妮等[20]通過田間漬水脅迫對32份長江流域主要甘藍型油菜品種進行漬性鑒定,成功篩選出強耐漬性品種6個,弱耐漬性品種3個,并根據(jù)試驗結果,認為根系活力、總干質量、脯氨酸含量可以作為甘藍型油菜苗期漬性鑒定的指標。

對油菜材料進行大范圍篩選與漬性鑒定,以獲得具有高耐漬性的油菜資源,是選育耐漬油菜品種的基礎,這對于減輕漬害在長江流域油菜生產(chǎn)中造成的巨大經(jīng)濟損失具有重要意義。本研究總結前人的耐漬性油菜篩選與鑒定方法,結合實際加以改進,針對性地選擇育種過程中選育的穩(wěn)定自交系和骨干親本并對其進行漬性鑒定,以期為后續(xù)油菜耐漬定向改良,培育耐漬高產(chǎn)油菜品種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取130份甘藍型油菜材料,其中26份為投入生產(chǎn)的常規(guī)品種,104份為西北農林科技大學農學院油菜團隊選育的穩(wěn)定自交系和骨干親本。

1.2 供試油菜材料的漬性鑒定

參照李云等[14]與許晶等[21]的方法,并將前期不同處理方法的預試驗結合實際情況加以改進,最終確定漬性鑒定分為發(fā)芽、砂培、淹水、排水培養(yǎng)、鑒定5個步驟。

發(fā)芽:每份材料選取80 粒飽滿、大小均勻、無病害的種子,放入內含兩層濾紙、直徑10 cm的無菌培養(yǎng)皿中,以無菌蒸餾水潤濕后放入光照培養(yǎng)箱中,設置為光照16 h/d,恒溫25 ℃,濕度75%,培養(yǎng)48～72 h。砂培:待胚根突破種皮1～2 cm后,挑選外形良好、生命力強的幼芽轉移至預先消毒、盛有石英砂的塑料杯中。淹水:待幼苗生長至子葉平展時,加以無菌水全淹沒至距幼苗頂部2 cm處,之后每天檢查保證水位高度,處理6 d。排水:傾倒排出多余水份后繼續(xù)正常培養(yǎng)3 d。鑒定:記錄幼苗死亡、存活等健康狀況,統(tǒng)計活苗率(Survival rate,SR)。每個材料均設4 個重復。淹水處理之前與排水處理后每12 h逐一檢查水分及幼苗生長情況,保證供水維持在適宜水平,及時排查與記錄非正?，F(xiàn)象。

由于耐漬鑒定方法繁多,受試油菜材料存活、死亡標準未見嚴謹定義。本研究鑒定工作主要圍繞恢復生長后的葉片生長情況(是否卷曲皺縮、變色、形成漬水斑、掉落、滲出內容物等)、莖形態(tài)質地(是否彎曲、褪色、易折斷等)、根系擴展程度、幼苗整體形態(tài)建成等方面展開。

1.3 不同耐漬性材料的生理差異比較

選取極耐漬材料Ning1038(漬水活苗率 100.00%)與不耐漬材料Q5005-L(漬水活苗率 41.38%)進行水淹脅迫培養(yǎng),共設2個處理:對照(CK)正常培養(yǎng),未進行漬水處理;漬水6 d(T)。每個處理設4個重復。形態(tài)方面,測定株高、根長、地上部鮮質量、根鮮質量4 個指標,隨機選取15株取其平均值,并計算相對活力指數(shù)?？寡趸富钚苑矫?超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光化還原法,以抑制50%光化還原反應所需酶量為1 個酶活性單位(U);過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法,以A240每分鐘變化0.1為1 個酶活性單位(U);過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚比色法,以A470每分鐘變化0.01為1 個酶活性單位(U)。

相對活力指數(shù)=(處理幼苗成苗率×處理幼苗莖長)/(對照幼苗成苗率×對照幼苗莖長)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計,方差分析按照單因素完全隨機設計進行,Duncan氏新復極差法檢驗處理材料間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 漬水對油菜活苗率的影響

如表1 所示,受試材料漬水處理后活苗率普遍在50%以上,主要集中在60%～90%,約占總材料的2/3。對漬性統(tǒng)計結果進行單個樣本K-S檢驗,P值=0.686>0.05,表明130份油菜材料的活苗率呈近似正態(tài)分布。

表1 130份材料漬水后的活苗率Table 1 Survival rate of 130 B.napus accessions after waterlogging

根據(jù)結果把試驗材料劃分為5個等級:極耐漬(SR=100%)、耐漬(80%

圖1 130份材料耐漬等級劃分Fig.1 Classification of waterlogging tolerance grades of 130 accessions

圖2 130份材料活苗率的頻數(shù)分布直方圖Fig.2 Frequency distribution histogram of survival rates of 130 accessions

2.2 試驗結果的重復性驗證

由于自行建立漬性鑒定方法可能存在事實偏差,為確認試驗方法可重復與漬性鑒定結果的客觀性,選取16份代表材料進行新一輪重復驗證(表2)。結果表明,大部分材料2 次漬性鑒定結果均無顯著差異,而Arm11與M267a前后2 次鑒定結果差異極顯著,推測是由于以上兩份材料種子的生活力下降所致。2次鑒定間存在1 a時間間隔,復篩階段明確觀察到Arm11與M267a在發(fā)芽至淹水前表現(xiàn)出的生活力與其他材料相比有所不足。為求證上述猜想,針對異常材料Arm11與M267a的第2 次重復鑒定迅速開展。結果表明,Arm11復篩1活苗率(75.36%)與復篩2活苗率(78.87%)、M267a復篩1活苗率(66.67%)與復篩2活苗率(74.29%)在0.01水平上均無顯著差異,因此,可以認為本研究的漬性鑒定結果具有客觀性。

表2 重復鑒定對比結果Table 2 Comparison results of repeat identification

2.3 材料間形態(tài)指標的比較

Ning1038與Q5005-L水淹脅迫后反應分化明顯(圖3)。形態(tài)指標方面,由表3可知,Ning1038莖長、地上部鮮質量、根鮮質量3 個指標均維持在正常水平,相較對照而言無顯著差異,Q5005-L的4 個指標與對照在0.01水平上有顯著差異,表明水淹脅迫對Q5005-L的生長過程產(chǎn)生較大負面作用,嚴重影響其正常生長。此外,上述兩種材料在水淹7 d后根長都發(fā)生顯著變化,分別相較對照縮短25.9%和27.7%,表明無論是高抗材料或是敏感材料,漬害發(fā)生后根系都會受到較大影響。

圖3 排水初期Ning1038與Q5005-L形態(tài)分化Fig.3 Morphological differentiation between Ning1038 and Q5005-L at initial stage of drainage

表3 形態(tài)指標測定結果Table 3 Measurement results of morphological index

2.4 材料間抗氧化酶活性的比較

抗氧化酶活性方面,如圖4、5、6所示,材料間SOD、POD、CAT活性變化各有特點。漬水處理后,Ning1038和Q5005-L的SOD活性都有所增加,但差異不顯著;兩種材料的POD活性則均表現(xiàn)為降低,分別下降10.9%和34.3%;CAT活性方面,Ning1038處理與對照間無顯著差異,而Q5005-L處理后CAT活性表現(xiàn)為下降。以上現(xiàn)象可能是因為Ning1038相較于Q5005-L有著更強生理機制,在漬害脅迫下能更好地維持抗氧化酶系統(tǒng)正常運轉。SOD是植物體內清除活性氧自由基的第一道防線,在漬害脅迫下,H2O2既能通過SOD催化超氧陰離子自由基產(chǎn)生,又能通過幼苗受損直接產(chǎn)生,短時間內H2O2含量驟增意味著要消耗更多的CAT與POD,而Ning1038強大的生理機制使其能夠維持酶保護系統(tǒng)相對正常運轉,因此,相較于Q5005-L,POD活性下降幅度更小,甚至能維持CAT活性處于正常水平。

圖4 處理后兩種材料SOD活性Fig.4 SOD activity of two accessions after treatment

圖5 處理后兩種材料POD活性Fig.5 POD activity of two accessions after treatment

圖6 處理后兩種材料CAT活性Fig.6 CAT activity of two accessions after treatment

3 討 論

3.1 耐漬油菜篩選研究的比較分析

在比較高抗與敏感材料間形態(tài)差異時,漬水處理后,Ning1038根系無論在根長還是支根與根毛的數(shù)量上都勝于Q5005-L,呂艷艷等[22]、張學昆等[23]在油菜耐漬性鑒定研究中,曾觀察到相似的現(xiàn)象,因此筆者推測,維持根系正常生長并保持一定的根系活力,是耐漬油菜材料對抗外界水淹脅迫的有效手段之一。相對活力指數(shù)是前人進行油菜耐漬性評價時常常使用的指標[24],本次評價同樣引入。結果表明,極耐漬材料相對活力指數(shù)為1.01,不耐漬材料為0.34,反映出二者抵御漬害脅迫的能力差異。陳潔等[12]將相對活力指數(shù)大于0.7的材料劃分為高耐漬,0.3～0.7的材料為中等耐漬,小于0.3的為不耐漬;李浩杰等[8]鑒定的強耐漬材料相對活力指數(shù)平均為0.79,弱耐漬材料平均為0.28,本文結果與上述研究具有一致性。

植物體內的抗氧化防御過程是一種非常復雜的生理現(xiàn)象。Tang等[25]以玉米為例,研究植物耐漬生理機制,提出耐漬型ZH32在漬害誘導的氧化傷害中表現(xiàn)出更為強大的生活力,在一定程度上是因為它能維持較高的抗氧化酶活性。在甘藍型油菜水淹脅迫后的抗氧化酶活性變化方面,以往研究結果并不完全一致。水淹脅迫后,油菜幼苗自由基活性氧逐步積累,引起SOD活性升高,以求維持相對穩(wěn)定的活性氧代謝平衡,這是同類研究中觀測到的普遍現(xiàn)象[18,22,26],但其上升幅度各有差異,本文中SOD活性增加幅度較小。張學昆等[23]觀測到漬水處理后耐漬材料POD活性升高,敏感材料POD活性大幅降低,而本文不耐漬材料Q5005-L POD活性同樣大幅下降,但極耐漬材料Ning1038 POD活性也有所降低,李陽陽等[9]觀測到 POD活性卻均為顯著升高。張樹杰等[17]、李玲等[18]進行了更長時間的水淹脅迫,然而得出的結論大相徑庭,前者發(fā)現(xiàn)隨著漬水時間延長,油菜葉片SOD、CAT活性在9 d內呈先降低后升高的趨勢,后者觀測到SOD、CAT活性卻表現(xiàn)為先顯著升高,后顯著降低,且轉折點在第13天。各類研究在供試材料、試驗條件、試驗方法等方面存在差異,導致檢測結果各不相同,但上述種種差異從抗氧化防御系統(tǒng)層面揭示,甘藍型油菜在耐漬性上存在豐富的遺傳變異。

3.2 漬性鑒定方法評價

文章自行建立油菜漬性鑒定方法,有如下兩個突出問題:

第一,室內能否模擬田間漬害,以較為準確的試驗結果應用于生產(chǎn)實踐。張學昆所在研究團隊[11-13,21,23-24,27]以油菜露白種子為材料,采用發(fā)芽期室內水淹脅迫模擬田間漬害,在甘藍型油菜耐漬性方面開展了一系列相關研究,育成以‘陽光2009’為代表的多個高產(chǎn)高抗國審油菜品種。李浩杰等[8]分別采用室內水淹漬害和田間漬害對甘藍型油菜材料進行漬性比較試驗,前后一致的鑒定結果是證明實驗室條件下篩選、鑒定甘藍型油菜耐漬材料可行的有力證據(jù)。

第二,苗期油菜的耐漬能力能否代表本品種(系)的耐漬性。Zou等[27]對油菜不同生育時期的耐漬性進行研究,發(fā)現(xiàn)發(fā)芽期和苗期的耐漬性與成熟期一致。李云等[14]為建立一套室內苗期油菜耐漬能力的快速篩選方法,利用已知耐漬性的高抗材料‘中雙9號’‘中雙7號’和HO102與敏感材料GH01、95-3進行新方法的重復鑒定,篩選結果無論在油菜形態(tài)或是生理方面均能得到驗證,表明新的苗期篩選方法具有可行性。此后,江蘇省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所油菜團隊沿用此法室內模擬甘藍型油菜苗期漬害,開展油菜耐漬生理及性狀遺傳規(guī)律研究[22,28-29],本文同樣有所參考。其他作物方面,孫慧敏等[30]以苗期相對死苗率為主要指標鑒定大豆耐漬性,揭示其遺傳變異特點。本文選擇苗期而非發(fā)芽期開展油菜漬性鑒定,一是考慮盡量與田間生產(chǎn)相結合,因為直播油菜容易遭遇苗期漬害,前人進行大田試驗時,常常選擇苗期水淹脅迫以研究漬害相關問題,例如苗期漬害對直播冬油菜氮肥利用與最終產(chǎn)量的影響[31-32];二是實際試驗過程中,難以客觀判斷露白種子生長情況,會額外增加除漬水以外影響材料正常生長的干擾因素,而選取子葉長至平展的健壯幼苗進行漬水處理,方便觀察選取生命力強的個體,有效避免弱苗影響。

需要指出的是,本文僅依靠苗期漬害處理后幼苗的存活率確定材料耐漬能力,并未對受試油菜材料進行后續(xù)大田鑒定。盡管室內模擬田間漬害已成為一種廣泛應用的研究方法,但評價油菜耐漬能力歸根結底是要運用于生產(chǎn)實踐,因此探討漬害問題更關鍵的是落實到對產(chǎn)量的影響上[33]。由于漬害的負面影響存在一定的滯后性[34-35],油菜材料生育后期的恢復生長情況是否與苗期解除漬害3 d后的狀態(tài)一致,材料間最終產(chǎn)量受漬害影響程度與本文劃分的耐漬等級是否完全吻合有待進一步研究與探索。

3.3 油菜漬性鑒定現(xiàn)狀與展望

目前作物漬性鑒定方法繁多,尚未建立普遍應用的統(tǒng)一標準[36]。如上文所述,前人所用油菜漬性鑒定方法各不相同,總體上可歸納為大田種植鑒定和室內模擬鑒定、以發(fā)芽期和苗期為代表的不同生育時期鑒定、提供一定外源養(yǎng)分和不提供養(yǎng)分(除水以外)的鑒定,并且以上3種類型分別在其具體鑒定方法上同樣存在諸多細節(jié)差異,眾多方法的最大共同點在于它們均向受試材料提供一定程度的漬害選擇壓力以得到相對合理的鑒定結果。這種現(xiàn)象使得不同單位和不同研究者之間的鑒定試驗更多偏向于定性分析,只能得到對具體油菜材料耐漬能力強弱與否的模糊判斷,各個鑒定結果之間由于試驗方法和鑒定標準不同,無法進行統(tǒng)一定量比較,這讓其參考價值和中國耐漬油菜種質資源篩選效率大大降低。另一方面,無統(tǒng)一標準會導致不同研究者對同一份油菜材料進行多次重復鑒定,造成資源浪費,結果的權威性亦有待提升,例如常規(guī)油菜品種‘中雙11號’,經(jīng)過陳娟妮等[20]大田鑒定、許晶等[21]室內發(fā)芽期和本文室內苗期鑒定后,仍僅能判斷‘中雙11號’具有較強耐漬性。

未來應當推動油菜漬性鑒定向著標準化、規(guī)范化方向邁進,形成統(tǒng)一的鑒定方法和參考指標,以提高耐漬油菜種質資源的篩選效率,強化漬性鑒定結果的可靠性,節(jié)約科研資源。

4 結 論

本文對130份甘藍型油菜材料進行漬性鑒定。結果表明,受試油菜材料普遍具有對漬害的一般耐受性,在耐漬性上存在豐富遺傳變異?！柟?009’作為目前生產(chǎn)上主推的常規(guī)品種,耐漬能力突出。耐漬性強的自交系有Ning1038、CarinataZS11、D黃、Arm-Z11、FuC、Z18782、11293AF、Arm11等,幾個新選育的恢復系6611C、Q99AF、Za9C等耐漬性也較好。對漬害極為敏感的材料有澳洲的Jade、中國北方選育的D615、Z532AF等。生理特征比較結果表明,漬害發(fā)生后,材料間表現(xiàn)的耐漬性差異在一定程度上與根系活力和抗氧化酶活性有關。本文結果為后續(xù)油菜耐漬定向改良,培育耐漬高產(chǎn)油菜品種提供參考依據(jù)。