馬懿敏,周文凱,楊 波,韓文雄,賀泓凱,王 揚,孫 晶,張 媛,趙維宏,張占勝,柴海亮,王利峰,劉永宏,趙 麗

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院家畜病理學(xué)實驗室,呼和浩特 010018;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室,呼和浩特 010018;3.鄂爾多斯市動物疫病預(yù)防控制中心,內(nèi)蒙古鄂爾多斯 017000;4.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)(集團)股份有限公司,呼和浩特 011517)

蜱(Tick)是哺乳類、鳥類、爬行類和兩棲類等動物體表常見的以吸血為生的體外寄生蟲,世界已知蜱包括硬蜱科(Ixodidae)、軟蜱科(Argasidae)、納蜱科(Nuttalliellidae)和恐蜱科(Deinocrotonidae)4科21屬960種[1],中國記錄的蜱有2科10屬121種[2],其中占多數(shù)、危害最大的為硬蜱科蜱[3]。經(jīng)蜱叮咬,宿主局部組織破損、水腫、潰瘍或因繼發(fā)感染引起化膿、疼痛、皮炎、貧血、消瘦、麻痹等;更重要的是,蜱作為世界第二大病原傳播媒介,在叮咬、吸血時傳播病毒、螺旋體、立克次氏體、細菌或原蟲等病原,具有把野生動物或家畜疾病傳播給人的風(fēng)險,危害人類健康[4-7]。

草原革蜱(Dermacentornuttalli),屬硬蜱科(Ixodinae)、革蜱屬(Dermacentor)[1],其宿主范圍廣泛,成蜱主要寄生于大型哺乳類動物,如牛、犬、馬、駱駝、綿羊和山羊等,有時也侵襲人;幼蜱和若蜱寄生于各種小型嚙齒類動物[7]。該蜱廣泛分布于北京、黑龍江、吉林、河北、遼寧、內(nèi)蒙古和新疆等中國北方地區(qū)[8],且為內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)勢蜱種[9-11]。D.nuttalli成蜱主要在春季活動,幼蜱、若蜱出現(xiàn)于夏、秋兩季,一年發(fā)育一個世代,以成蟲階段越冬[12]。已報道D.nuttalli可傳播綿羊無漿體(Anaplasmaovis)、綿羊泰勒蟲(Theilerialuwenshuni)、布魯氏桿菌(Brucella)、饒氏立克次體(Rickettsiaraoultii)、埃氏立克次體(R.aeschlimannii)、嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)[13]、馬泰勒蟲(Theileriaequi)[14]、伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)[15]、土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)[16]、巴貝斯原蟲(Babesia)[17]等病原。

實驗室人工飼養(yǎng)蜱不僅能夠掌握蜱的發(fā)育生活史、生物學(xué)特性等,還可為蜱及蜱傳疾病的研究提供充足、可控發(fā)育階段的材料。但有關(guān)D.nuttalli的實驗室人工飼養(yǎng)報道較少,只有努爾·庫爾曼艾力等[18]和巴音查汗等[19]在20世紀報道了新疆D.nuttalli的實驗室飼養(yǎng)。本研究針對內(nèi)蒙古地區(qū)優(yōu)勢蜱種D.nuttalli進行實驗室人工飼養(yǎng)和生活史觀察,以期建立一套詳細規(guī)范的D.nuttalli實驗室飼養(yǎng)方法,為D.nuttalli的生物學(xué)研究和綜合防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 蜱 于2021-04-17采集自內(nèi)蒙古呼倫貝爾市新巴爾虎左旗新寶利格蘇木羊體表。

1.1.2 實驗動物 昆明小鼠(6周齡,體質(zhì)量 25～27 g),為唯一供血動物。

1.1.3 試劑和主要儀器 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0(Code No.9765),PremixTaqTM(TakaRaTaqVersion 2.0 plusdye)(Code No.RR901A),4S Green Plus無毒核酸染料(Code No.A616696)、DNA分子量標準(Code No.B600021),購自寶日醫(yī)生物工程(北京)有限公司。高速冷凍離心機(Cat No.75004250,ThermoFisher)、PCR儀(Part No.4359659,Gene Company Limited)、電泳儀(Model No.PowerPacTM Universal Power Supply,BIO RAD)、凝膠成像儀(BDA Box 2,Biometra GmbH)、體視顯微鏡(PXS-1040)等。

1.2 方 法

1.2.1 蜱種鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定。對采集的飽血雌成蜱及同一批未飽血成蜱進行清洗處理,用75%乙醇固定后,參照鄧國藩等[20]和巴音查汗等[21]的蜱形態(tài)學(xué)分類依據(jù),借助體視顯微鏡觀察假頭基、須肢、盾板、肛溝和氣門板等的形態(tài)特征,進行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定。飽血雌成蜱產(chǎn)卵后,對其研磨并采用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0試劑盒提取核酸,利用16S rDNA基因特異性引物,采用PremixTaqTM(TakaRaTaqVersion 2.0)試劑盒對16S rDNA基因片段進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物、PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照文獻[22-23],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 序列測定及分析 將PCR陽性產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,序列應(yīng)用美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)BLAST在線平臺和DNAstar等軟件,進行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育進化樹構(gòu)建。

1.2.3 人工飼養(yǎng) 羊體表叮咬的、飽血將要脫落的雌蜱單只置于含有潮濕脫脂棉的50 mL無菌離心管中,用紗布封口后帶回實驗室。雌蜱開始產(chǎn)卵后,觀察并記錄每日產(chǎn)卵數(shù)量、停止產(chǎn)卵時間、形態(tài)變化及卵孵化為幼蜱的時間。

以昆明小鼠為唯一供血動物飼養(yǎng)幼蜱和若蜱。首先選取健康昆明小鼠,剃除背毛后將小鼠頸部及后肢用醫(yī)用膠布固定,置于2 000 mL燒杯內(nèi)[24],將幼蜱(若蜱)用醫(yī)用棉簽沾取后置于小鼠體表,燒杯壁四周上沿涂抹一層醫(yī)用凡士林[18,25],以防小鼠及幼蜱(若蜱)逃逸。吸血完畢后,飽血幼蜱自行從宿主體表脫落,用金屬尖頭鑷或沾水棉簽輕輕將其取出,置于含有潮濕脫脂棉的2.5 mL離心管內(nèi),管蓋作好標記,管口扎洞保持空氣暢通,每2～3 d用無菌注射器從管口注水,防止?jié)穸认陆?。觀察到若蜱飽血后,及時用金屬尖頭鑷,垂直于小鼠體表方向夾飽血若蜱的軀體或假頭,輕輕搖動,順勢取下,謹防小鼠誤食。為了采到完整飽血若蜱,采集前,可用煤油、氯仿或乙醚等藥物涂于叮咬部位[26]。利用體視顯微鏡觀察人工飼養(yǎng)條件下卵孵化到幼蜱,幼蜱到若蜱以及若蜱到成蜱的各期蟲體形態(tài)特征,并拍照記錄。

飼養(yǎng)期間,室內(nèi)自然溫度為20～30 ℃,相對濕度為30%～75%,飼養(yǎng)過程中除自然光照外,不加其他燈光照射,并避免蟲體直接暴露于自然強光下。

2 結(jié)果與分析

2.1 草原革蜱鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 雌蜱:整體為卵圓形;假頭基位于軀體前端呈矩狀;幾丁質(zhì)盾板覆蓋蟲體背部前1/3處,呈長卵圓形;盾板有銀白色琺瑯斑,后緣似微波狀;頸溝短且深陷,側(cè)溝細窄;氣門板呈橢圓形;腹面后部有肛門,肛溝圍繞肛門之后;須肢粗短(圖1-A,1-B)。

A.雌蜱背部;B.雌蜱腹部;C.雄蜱背部;D.雄蜱腹部

雄蜱:蟲體窄長,呈卵圓形;假頭短,假頭基位于軀體前端呈矩形;盾板大且有混雜不均一的銀白色琺瑯斑;氣門板呈逗點狀;肛溝呈半月形,須肢粗短,外緣呈弧形;各足基節(jié)順序增大,4對足粗短(圖1-C,1-D)。

基于蜱上述形態(tài)結(jié)構(gòu)特征,確定本次試驗采集蜱為革蜱屬蜱。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 蜱樣本DNA經(jīng)PCR擴增16S rDNA基因,凝膠電泳顯示擴增產(chǎn)物(圖2)與預(yù)計大小一致。

M．DNA分子質(zhì)量標準;N.陰性對照;1～6.蜱16S rDNA基因PCR擴增產(chǎn)物M．DNA Marker;N.Negative control;1-6.PCR amplification products of tick 16S rDNA gene圖2 蜱16S rDNA基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 PCR analysis of 16S rDNA gene amplification in ticks

測得的2個16S rDNA基因片段長度均為416 bp,BLAST在線分析顯示,與序列1和序列2同源性最高的序列(GenBank登錄號為MH324407.1和JX051114.1)均為D.nuttalli,同源性分別為98.77%和99.26%。2個16S rDNA序列與GenBank中D.nuttalli及其他革蜱屬蜱的16S rDNA序列,運用DNAstar軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖3)顯示,序列與已知的D.nuttalli序列聚在同一分支上。

圖3 革蜱屬16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA gene sequences of Dermacentor

2.2 草原革蜱人工飼養(yǎng)

2.2.1 飽血雌成蜱產(chǎn)卵期 飽血雌成蜱飽滿呈豆狀,灰褐色,短暫活動1～3 d,然后進入靜止狀態(tài),藏匿于潮濕棉花下,待產(chǎn)卵。其產(chǎn)卵量與飽血程度呈正比,飽血程度越高,產(chǎn)卵量越多。產(chǎn)卵時雌蜱僅肢體微弱活動,通過分泌的黏性物質(zhì)將卵粘在一起,卵呈堆狀或葡萄串狀聚集于假頭處。產(chǎn)卵期持續(xù)13～18 d,平均為15.5 d,產(chǎn)卵總量約2 680～4 050枚,平均約3 393枚,日均產(chǎn)卵量約219枚;產(chǎn)卵期1～6 d為產(chǎn)卵增長期,每日產(chǎn)卵量約為160～300枚,產(chǎn)卵期7～10 d為產(chǎn)卵平衡期,每日產(chǎn)卵量約為320～370枚,隨后產(chǎn)卵量逐漸下降,至最后1、2 d每日產(chǎn)卵量為10～30枚。隨著產(chǎn)卵天數(shù)的增加和產(chǎn)卵量的增大,飽血雌蜱體積逐漸變小,表面失去光澤出現(xiàn)花紋,顏色逐漸變?yōu)橥咙S色,后期雌蜱體表干癟、皺縮(圖4),并于產(chǎn)卵結(jié)束后3～6 d死亡,顏色變?yōu)楹谏?/p>

圖4 產(chǎn)卵中的飽血雌成蜱Fig.4 Full blood of female adult tick laying eggs

2.2.2 卵孵化期D.nuttalli的卵為棕黃色,呈橢圓形,半透明狀(圖5)。卵在孵化初期沒有任何明顯變化,隨后卵的顏色變淺,開始由棕黃色逐漸變成透明的乳白色,破殼前卵殼內(nèi)可見有呈黃褐色的幼蜱。在室溫(內(nèi)蒙古自治區(qū)4～5月)下孵化期為25～29 d,平均為27.38 d。

圖5 體視顯微鏡下的卵Fig.5 Eggs analyzed under stereomicroscope

從飽血雌蜱所產(chǎn)卵中隨機取300枚卵,每30枚卵為一組分別放置于10個2.5 mL離心管中,管中放有浸水的脫脂棉花以維持濕度,卵孵化情況見表1,孵化率為75%～100%,總體孵化率為93.33%(280/300)。

表1 卵孵化情況Table 1 Egg hatching

幼蜱剛孵出時為淺黃色,具3對黃白色足,可緩慢爬動,活動不活躍。經(jīng)2～3 d后聚集在一起活動,呈堆狀;隨后3～4 d幼蜱體色變深,呈黃褐色(圖6),活動增強且爬行速度加快,具備叮咬侵襲力,積極尋找宿主。幼蜱耐饑餓能力較強,2到3個月未找到宿主寄生仍能保持較強的活力。釋放到供血小鼠體表的幼蜱,經(jīng)1～2 h開始叮咬寄生,2～3 d時可見體積明顯增大,逐漸變?yōu)榘导t色或黑紫色,并有黑色粉末狀物體,幼蜱在小鼠體表吸血至飽血脫落需4～6 d,平均為5.23 d。

圖6 體視顯微鏡下的幼蜱Fig.6 Larva analyzed under stereomicroscope

2.2.3 幼蜱蛻化期D.nuttalli幼蜱飽血后自行脫落,呈芝麻狀,黑紅色,表面光滑,蟲體較吸血前明顯增大(圖7)。在室溫(內(nèi)蒙古自治區(qū)5～6月)條件下,離開宿主后活動2～3 d,準備蛻皮。經(jīng)人工飼養(yǎng)后收集到飽血幼蜱2 974只,75%乙醇保存92只,-80 ℃凍存1 255只,1 627只進行幼蜱蛻化。蛻化期為4～15 d,主要集中于7～ 11 d,平均約為8.83 d,在此期間成功蛻化為饑餓若蜱的有1 316只,蛻化率為80.89%(1 316/ 1 627),具體蛻化時間及蛻化數(shù)量見表2。

表2 幼蜱蛻化時間及蛻化數(shù)量Table 2 Degeneration days and number of larva

圖7 體視顯微鏡下的飽血幼蜱Fig.7 Full blood of larva under stereomicroscope

剛蛻變完成的若蜱較幼蜱大,顏色為淺棕色,與成蜱一樣有4對足(圖8),四肢尚未完全伸展,行動遲緩,一般經(jīng)1～2 d靜伏期后開始活動,活動逐漸增強且爬行速度加快,經(jīng)蛻皮5～10 d后,排出白色液滴狀物體,即可叮咬寄生。若蜱在吸血過程中也會有黑色粉樣物體排出,隨著吸血時間增加,其體積也逐漸增大,顏色轉(zhuǎn)為青灰色。若蜱在小鼠體表吸血期為4～8 d,平均約為5.41 d。

圖8 體視顯微鏡下的若蜱Fig.8 Nymph under stereomicroscope

本階段有293只若蜱成功叮咬寄生,逐漸成功收集154只飽血若蜱(表3),75%乙醇保存5只,-80 ℃凍存33只,其余116只飽血若蜱進入下一階段生長發(fā)育。

表3 飽血若蜱寄生情況Table 3 Parasitism of bloody nymphs

2.2.4 若蜱蛻化期D.nuttalli若蜱飽血后呈小豆狀,青灰色(圖9),自行離開宿主經(jīng)1～2 d活動期,進入休止期準備蛻皮。脫落后1～5 d內(nèi)形態(tài)無明顯變化,第10天起表皮開始變白,其體色逐漸由青灰色變?yōu)槿榘咨Ｔ谑覝?內(nèi)蒙古自治區(qū)6～8月)條件下,經(jīng)12～21 d的蛻變期后蛻化為成蜱(圖10、圖11),其中主要集中在12～17 d,平均蛻化時間約為14.81 d。116只飽血若蜱中有79只成功蛻化為成蜱,其蛻化率為68.10%(79/116),包括49只雌蜱和30只雄蜱,成蜱的雌雄比例為1.63∶1。具體蛻化時間、蛻化數(shù)量及雌雄比例見表4。

圖9 體視顯微鏡下的飽血若蜱Fig.9 Bloody nymphs under stereomicroscope

圖10 體視顯微鏡下的雌性成蜱Fig.10 Female ticks under stereomicroscope

表4 飽血若蜱蛻化時間、蛻化數(shù)量及雌雄比例Table 4 Degeneration number of time and proportion of male and female of bloody nymphs

剛蛻化的成蜱靜臥不動,在離心管內(nèi)可見一層蛻下的透明薄皮,經(jīng)1～2 d后在管內(nèi)緩慢爬行,離心管底部有白色小球狀物體堆積,漸漸活動頻繁。

3 討論及結(jié)論

D.nuttalli為三宿主蜱,發(fā)育過程包括卵、幼蜱、若蜱和成蜱4個階段,需飽血3次才能完成整個發(fā)育過程。硬蜱的生殖和發(fā)育受多種因素的影響,如地域分布、環(huán)境及宿主等因素[27]。人工飼養(yǎng)條件下,不同種蜱的生活史周期不同,同種蜱在不同宿主表現(xiàn)的生活史周期也不同,在不同溫、濕度條件下同種蜱在同種宿主上的生活史周期也存在差異[28]。

本研究中,D.nuttalli在室內(nèi)條件(20 ℃～30 ℃)下,飽血雌蜱的產(chǎn)卵期約13～18 d,平均15.5 d,單雌產(chǎn)卵量為2 680～4 050枚,產(chǎn)卵期長于巴音查汗等[19]報道的7～13 d,但遠短于呂洪昌等[29]報道的27～35 d和努爾·庫爾曼艾力等[18]的35～40 d;產(chǎn)卵量少于努爾·庫爾曼艾力等[18]報道的8 000～9 200枚及呂洪昌等[29]的 4 628～8 653枚,但與巴音查汗等[19]報道的 3 606枚大體一致,可能與雌蜱飽血程度及體質(zhì)量等相關(guān)。此外,在本研究中的卵經(jīng)過25～29 d,平均27.38 d孵化成為幼蜱,與巴音查汗等[19]報道的18～28 d大體一致,但長于努爾·庫爾曼艾力等[18]報道的18～20 d,更與呂洪昌等[29]報道的29～42 d相距甚遠,究其原因可能與溫度、濕度、種群自身狀態(tài)、不同地域環(huán)境來源的蜱等有關(guān)。饑餓幼蜱的吸血期平均為5.23 d;飽血幼蜱到饑餓若蜱的蛻皮期平均為8.83 d,與巴音查汗等[19]報道的5.5 d和8 d研究結(jié)果基本一致。饑餓若蜱吸血期平均為5.41 d,飽血若蜱到成蜱的蛻皮期平均為14.81 d,均短于巴音查汗等[19]報道的平均8.5 d和21.5 d,這些差異可能與宿主和自身飽血程度等相關(guān)。文獻報道在實驗室條件下,D.nuttalli從雌蜱吸血到下一代成蜱共需 62～121 d[12]。本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙地區(qū)D.nuttalli從雌蜱產(chǎn)卵到下一代成蜱共需72～114 d,平均需 90.66 d。綜上所述,這些差異可能體現(xiàn)了內(nèi)蒙D.nuttalli種群地域特性和遺傳多樣性。本次D.nuttalli人工飼養(yǎng)還較詳細地研究了D.nuttalli卵孵化率及其各階段蛻化率,卵孵化率高達93.33%,飽血幼蜱蛻化率為80.89%,飽血若蜱蛻化率為 68.10%,初步推算顯示實驗室條件下一批卵發(fā)育到成蜱的概率為51.41%。

蜱類的繁殖、生長與發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì),必須通過在宿主身上吸血才能獲得。幼蜱、若蜱均需在宿主身上攝取營養(yǎng),才能發(fā)育蛻變進入下一生長階段。D.nuttalli成功叮咬宿主后一般不改變其吸血部位,直至飽血才離開宿主。人工飼養(yǎng)條件下,D.nuttalli幼蜱和若蜱在鼠體叮咬吸血情況良好,飽血后個體差異較小,能正常發(fā)育為成蜱。努爾·庫爾曼艾力等[18]曾報道蛻化成功的若蜱不在同一宿主體表吸血寄生,另擇其他宿主;但在本次D.nuttalli人工飼養(yǎng)中,將飽血幼蜱蛻皮完成后的饑餓若蜱繼續(xù)接種到同一宿主時仍表現(xiàn)嗜血,且飽血后可正常發(fā)育為成蜱。

本研究成功建立了內(nèi)蒙古D.nuttalli人工飼養(yǎng)方法,明確了從飽血雌蜱產(chǎn)卵至下一代成蜱共需72～114 d,平均需90.66 d。試驗結(jié)果初步表明,用昆明小鼠作為內(nèi)蒙D.nuttalli幼蜱和若蜱的供血動物是可行的,雖然利用供血鼠體大量繁殖有困難,但仍可用于實驗室初期飼養(yǎng),從而為今后在實驗室擴繁D.nuttalli奠定基礎(chǔ)。