王 霞,王廣元,張一劍

山東省兗礦新里程總醫(yī)院耳鼻喉科,山東濟寧 273500

鼻咽癌(NPC)是起源于鼻咽部黏膜的惡性腫瘤。我國每年NPC新發(fā)病例達4.46萬例,死亡病例達2.42萬例[1]。目前放射治療是NPC的主要治療方式,特別是適形調(diào)強放射技術(shù)的臨床應(yīng)用取得了良好效果[2]。但腫瘤局部復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移仍然是晚期NPC患者治療失敗的主要原因,5年生存率僅為40%,危及患者生命健康[3]。深入研究NPC腫瘤標志物,對于臨床早期診治和預(yù)后判斷具有重要意義。Wilms瘤相關(guān)蛋白(WTAP)編碼基因位于6q25.3上,編碼蛋白定位于細胞核核質(zhì)中,在基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮調(diào)控作用。近年來發(fā)現(xiàn),WTAP在肝癌、胃癌等惡性腫瘤中表達上調(diào),通過抑制抑癌基因如p21的表達,促進腫瘤細胞G2/M期轉(zhuǎn)換,促進腫瘤的惡性增殖[4-5]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是長度在100～300個核苷酸的RNA分子,廣泛參與細胞分化、增殖及凋亡過程的調(diào)控[6]。lncRNA DIAPH1-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的lncRNA,體外細胞實驗表明,lncRNA DIAPH1-AS1能夠促進NPC細胞的增殖及轉(zhuǎn)移,可能是新的NPC腫瘤標志物[7]。因此,本研究通過檢測NPC組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表達,探討二者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2015年3月至2018年3月本院診治的78例NPC患者的臨床資料。納入標準:(1)經(jīng)病理學檢查明確診斷為鼻咽部鱗癌并符合2009年歐洲腫瘤內(nèi)科學會制訂的《鼻咽癌臨床實踐指南》中的診斷標準[8];(2)既往無放化療及免疫治療史;(3)患者臨床病理和隨訪資料完整。排除標準:(1)隨訪過程中發(fā)生第二原發(fā)癌。(2)合并其他惡性腫瘤。(3)伴心、肺、肝、腎等器官功能不全。78例NPC患者中,男48例,女30例;年齡34～78歲,平均(59.8±6.0)歲;有吸煙史38例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期48例,Ⅲ～Ⅳ期30例;腫瘤分化程度:中高分化45例,低分化33例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有41例,無37例。本研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準通過。

1.2儀器與試劑 微量分光光度計Narodrop 2000購自美國賽默飛公司,總RNA提取試劑盒購自北京索萊寶生物有限公司(貨號R1200),反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京索萊寶公司(貨號T2240),SYBR Green Mix實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒購自南京歐凱生物公司(貨號M107R1),WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及內(nèi)參GAPDH的引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計合成。

1.3方法

1.3.1檢測方法 qPCR檢測,取癌及癌旁組織標本,液氮研磨后,3 000 r/min離心5 min,離心半徑10 cm,取上清液,利用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA,Narodrop 2000檢測RNA濃度及純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將組織中總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,進行qPCR反應(yīng)。引物序列,WTAP正向序列:5′-GCAACAACAGCAGGAGTCTGCA-3′,反向序列:5′-CTGCTGGACTTGCTTGAGGTAC-3′。lncRNA DIAPH1-AS1正向序列:5′-ACACTAAAGCTGGGATGGCT-3′,反向序列:5′-TTTCCAGGATGTCAGGCAAC-3′。內(nèi)參GAPDH正向序列:5′-TGATGACATCAAGAAGGTGG-3′,反向序列:5′-TTGTCATACCAGGAAATGAGC-3′?？偡磻?yīng)體系10 μL,其中模板cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,SYBR Master Mix 5 μL,ddH2O 3 μL。程序:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán)。組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的相對表達水平以2-ΔΔCt表示。

1.3.2隨訪 本研究自患者病理診斷明確后開始進行隨訪,每3個月電話隨訪1次,隨訪終點事件為患者因NPC或其并發(fā)癥死亡,連續(xù)隨訪3年,隨訪截止時間2021年3月。

2 結(jié) 果

2.1NPC組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達比較 NPC癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1相對表達水平分別為2.14±0.35、2.37±0.38,癌旁組織中分別為0.74±0.12、0.80±0.14,NPC癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1相對表達水平明顯高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(t=34.346、36.193,P<0.05)。

2.2WTAP與lncRNA DIAPH1-AS1表達的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,NPC組織中WTAP與lncRNA DIAPH1-AS1表達呈正相關(guān)(r=0.524,P<0.05)。

2.3NPC組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達與臨床病理特征的關(guān)系 不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC患者癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),TNM分期Ⅲ～Ⅳ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC患者癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表達分別明顯高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC患者(P<0.05)。不同性別、年齡、分化程度、吸煙史的NPC患者癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 NPC組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.4WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1對NPC的診斷價值 繪制WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及聯(lián)合檢測對NPC診斷的ROC曲線,結(jié)果顯示,WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1及聯(lián)合檢測對NPC診斷的曲線下面積(95%CI)分別為0.801(0.734～0.863)、0.738(0.651～0.827)、0.896(0.853～0.938),聯(lián)合檢測時曲線下面積明顯大于WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1單獨檢測的曲線下面積(Z=2.392、3.302,P=0.017、0.001)。見表2。

表2 WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1對NPC的診斷價值

2.5NPC患者癌組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達對預(yù)后的影響 對所有NPC患者隨訪3～36個月,中位隨訪時間31個月。隨訪期間無失訪,死亡23例,3年總體生存率為70.51%(55/78)。以WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的相對表達水平2.10、2.34為臨界值,分為WTAP高表達組39例和WTAP低表達組39例,lncRNA DIAPH1-AS1高表達組40例和lncRNA DIAPH1-AS1低表達組38例。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果表明,WTAP高表達組3年總體生存率為51.28%(20/39),明顯低于低表達組的89.74%(35/39),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.834,P<0.05)。lncRNA DIAPH1-AS1高表達組3年總體生存率為55.00%(22/40),明顯低于低表達組的86.84%(33/38),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.041,P=0.005)。見圖1。

注:A為lncRNA DIAPH1-AS1表達對NPC患者生存預(yù)后的影響;B為WTAP表達對NPC患者生存預(yù)后的影響。

2.6單因素及多因素Cox回歸分析影響NPC患者生存預(yù)后的因素 對影響NPC患者生存預(yù)后的因素進行單因素Cox回歸分析,將性別(男=0、女=1),年齡(34～60歲=0、>60～78歲=1),吸煙史(無=0、有=1),分化程度(中高分化=0、低分化=1),TNM分期(Ⅰ～Ⅱ期=0、1=Ⅲ～Ⅳ期=1),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0、有=1),WTAP表達(低表達=0、高表達=1),lncRNA DIAPH1-AS1表達(低表達=0、高表達=1)引入回歸方程,結(jié)果表明,TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WTAP及l(fā)ncRNA DIAPH1-AS1表達是NPC患者生存預(yù)后的獨立影響因素。多因素Cox回歸分析結(jié)果表明,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、WTAP高表達、lncRNA DIAPH1-AS1高表達是影響NPC患者生存預(yù)后的獨立危險因素。見表3、4。

表3 單因素Cox回歸分析影響NPC患者生存預(yù)后的因素

表4 多因素Cox回歸分析影響NPC患者生存預(yù)后的因素

3 討 論

NPC具有較高的侵襲性和早期轉(zhuǎn)移特征,許多NPC患者在首次診斷時已處于晚期,患者遠期生存預(yù)后仍不理想。深入研究NPC的分子機制,有助于NPC的臨床診治。N6-甲基腺苷(m6A)修飾是近年來新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制,參與NPC腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。

WTAP基因位于人類6號染色體上,編碼蛋白作為一種m6A書寫器,能夠甲基化修飾RNA分子,調(diào)控下游基因表達。研究表明,WTAP在肝細胞癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中表達升高,其作為一種致癌基因,發(fā)揮促進腫瘤惡性增殖和轉(zhuǎn)移的作用[11]。本研究表明,WTAP在NPC癌組織中的表達較癌旁組織上調(diào)。NPC組織中WTAP表達上調(diào)的機制可能與WTAP轉(zhuǎn)錄后調(diào)控異常有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),miR-501-3p能夠通過靶向結(jié)合WTAP mRNA的3′非編碼區(qū),改變WTAP mRNA的穩(wěn)定性,腫瘤發(fā)生時miR-501-3p表達異常下調(diào),導(dǎo)致WTAP mRNA的穩(wěn)定性增加,促進WTAP的表達,致使腫瘤細胞過度增殖[12]。本研究中,腫瘤TNM分期Ⅲ～Ⅳ期,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NPC患者癌組織中WTAP表達較高,提示W(wǎng)TAP的表達升高可能參與促進NPC的腫瘤的惡性進展。分析其機制可能為,腫瘤中WTAP的表達上調(diào)能夠招募轉(zhuǎn)錄起始因子3復(fù)合體激活Wnt信號通路,促進腫瘤細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力[13]。此外,WTAP通過促進m6A修飾微囊蛋白1的表達,微囊蛋白1能夠激活核因子-κB信號通路,促進腫瘤細胞的惡性增殖[14]。本研究通過生存分析表明,WTAP高表達的NPC患者生存預(yù)后較差,并且WTAP高表達是患者生存預(yù)后的獨立危險因素,結(jié)果表明WTAP是判斷NPC預(yù)后的潛在生物學標志物,檢測WTAP的表達可能有助于患者治療后的隨訪監(jiān)測,值得臨床深入研究。

lncRNA DIAPH1-AS1編碼基因位于5q31.3染色體上,是一種新的lncRNA,具有促進蛋白質(zhì)間相互作用,蛋白質(zhì)磷酸化激活等生物學功能[15]。本研究中,NPC患者癌組織中l(wèi)ncRNA DIAPH1-AS1表達明顯升高,其原因可能與lncRNA DIAPH1-AS1受到上游WTAP的m6A修飾調(diào)節(jié)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),WTAP能夠通過胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白2依賴性途徑m6A修飾lncRNA DIAPH1-AS1的表達,促進NPC腫瘤細胞中的lncRNA DIAPH1-AS1穩(wěn)定性,導(dǎo)致lncRNA DIAPH1-AS1表達升高[7]。本研究中,lncRNA DIAPH1-AS1表達升高與較高的腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),提示lncRNA DIAPH1-AS1的表達升高促進NPC的疾病進展。研究表明,lncRNA DIAPH1-AS1作為一種分子支架促進異黏蛋白、LIM和SH3蛋白1復(fù)合物的形成,誘導(dǎo)LIM和SH3蛋白的表達,促進NPC腫瘤細胞的過度增殖和轉(zhuǎn)移[7]。本研究發(fā)現(xiàn),lncRNA DIAPH1-AS1高表達的NPC患者的生存預(yù)后較差,并且是患者不良預(yù)后的獨立危險因素,表明檢測NPC患者癌組織中l(wèi)ncRNA DIAPH1-AS1表達有助于NPC患者的臨床預(yù)后預(yù)測,是新的預(yù)后判斷的腫瘤標志物。本研究中,NPC患者WTAP與lncRNA DIAPH1-AS1表達呈正相關(guān)。WTAP的高表達能夠通過m6A甲基化修飾增加lncRNA DIAPH1-AS1的穩(wěn)定性,lncRNA DIAPH1-AS1表達升高通過激活下游癌基因表達,促進NPC的腫瘤進展。因此,NPC中WTAP與lncRNA DIAPH1-AS1可能存在協(xié)同關(guān)系,共同促進NPC的腫瘤進展。此外,本研究中,WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1聯(lián)合檢測對NPC具有較高的診斷價值。臨床上,醫(yī)師可以根據(jù)NPC患者癌組織中WTAP 和lncRNA DIAPH1-AS1的表達,進行早期診斷并評估NPC患者的臨床預(yù)后,對高?；颊哌M行積極治療及隨訪,從而改善高危患者的生存預(yù)后。

綜上所述,NPC患者WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達升高,二者表達呈正相關(guān)。NPC患者WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1表達與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1高表達是影響NPC患者生存預(yù)后的獨立危險因素,是新的NPC預(yù)后相關(guān)的腫瘤標志物。但本研究也存在一定的局限性,首先,本研究中雖然已經(jīng)有癌旁組織為對照,但可能與正常組織中WTAP、lncRNA DIAPH1-AS1的表達情況仍存在一定的差異,有待今后設(shè)置正常對照組做進一步研究。其次,本研究樣本量有限,隨訪時間較短,有待今后擴大樣本量深入研究,為臨床提供新的治療靶點。