羅 書,李書明,黃 勇,關紅瓊

1.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科,海南?？?570311;2.海南醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院,海南海口 570311;3.海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科,海南?？?570311

子癇前期(PE)是妊娠期特有的并發(fā)癥,影響全世界約2%～8%的妊娠女性,是全球孕產(chǎn)婦和圍生期胎兒發(fā)病和死亡的重要原因之一。然而,PE的確切病因和具體發(fā)病機制仍不清楚,這導致盡早對其進行診斷和干預治療仍有困難[1]。近年來,有研究發(fā)現(xiàn),胎盤特異性生物標志物19號染色體微小RNA(C19MC)簇在PE患者的胎盤組織與血漿標本中異常表達[2]。miR-517屬于C19MC簇成員,有研究報道表明,miR-517在PE患者血漿和血漿外泌體中的表達均明顯降低,并提示miR-517可能是一種新的胎盤特異性標志物,且在妊娠早期,檢測上述標本中miR-517水平具有早期預測PE發(fā)生的潛在價值[3-4]。外泌體是一種直徑在30～150 nm的胞外囊泡,可由包括滋養(yǎng)層細胞在內的多種細胞分泌,并通過與靶細胞膜融合后,釋放多種信號分子(如蛋白質、脂質、RNA、DNA、miRNAs等)介導細胞間通訊[5]。既往有研究表明,外泌體可通過miRNAs介導免疫調控與滋養(yǎng)層細胞的功能而參與妊娠相關疾病的發(fā)生與發(fā)展[6],但在PE中,血漿外泌體中miR-517異常表達的具體作用尚不清楚。因此,本研究通過體內外實驗,旨在進一步驗證miR-517在胎盤外泌體中的表達及其相關作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年5月至2021年5月于海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院確診為PE的患者50例(PE組)和同期于海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院就診的年齡、孕周相近,且無高血壓、蛋白尿等妊娠相關并發(fā)癥的50例健康孕產(chǎn)婦作為NP組,兩組孕產(chǎn)婦一般臨床資料如表1所示。納入標準:(1)孕產(chǎn)婦年齡在20～35周歲,妊娠孕周在20～42周;(2)PE患者的診斷標準按照《婦產(chǎn)科學》(第9版)[7]相關標準執(zhí)行;(3)兩組孕產(chǎn)婦均經(jīng)陰道分娩,且均為自然單胎妊娠,未合并慢性高血壓、糖尿病、腎臟疾病、傳染病或其他妊娠合并癥。使用含EDTA的抗凝管抽取兩組孕產(chǎn)婦空腹肘靜脈血約7 mL,保存于-80 ℃冰箱用于提取外泌體。同時,在分娩后立即在胎盤中央?yún)^(qū)去除黏膜后,取適量絨毛組織置于RNAlater儲存液中,保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)胎盤RNA的提取。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準,所有研究對象均簽署書面知情同意書。

表1 兩組孕產(chǎn)婦一般臨床資料比較

1.2儀器與試劑 人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/SVneo(HTR-8)與人T細胞系Jurkat T細胞均購自美國ATCC細胞庫,RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素與鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司,miR-517 mimic與陰性對照序列(miR-NC)購自廣州銳博生物技術有限公司,轉染試劑Lipofectamine?2000購自美國Thermo公司,RIPA細胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、CCK-8試劑盒、辣根過氧化物酶標記兔抗小鼠IgG購自江蘇碧云天生物技術有限公司,TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司,RNAlater儲存液、外泌體RNA提取試劑盒、實時熒光定量PCR(qPCR)試劑盒SYBRTMGreen Master Mix購自美國Qiagen公司,基質膠購自美國BD公司,miRNA反轉錄試劑盒購自廣州易錦生物技術有限公司,小鼠抗CD63、腫瘤易感基因101(TSG101)、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、清蛋白抗體購自美國Abcam公司,PKH67熒光染料試劑盒購自美國Sigma公司,共聚焦顯微鏡(C2+型)購自日本Nikon公司,酶標儀(ReadMax 1000F型)購自上海閃譜生物科技有限公司,Nanosight LM10納米示蹤分析儀器(NS300型)購自英國Malvern公司,超薄切片(JEM-1011型)購自日本JEOL公司。

1.3方法

1.3.1細胞的培養(yǎng)和轉染 采用含10%FBS和100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素混合的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HTR-8與Jurkat T細胞,并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。每2 d更換一次培養(yǎng)基,4～5 d傳代一次細胞。取傳至3代以后的HTR-8或Jurkat T細胞,調整密度后,按2.5×105/mL接種至6孔板中,待細胞生長融合至60%～80%時,按照轉染試劑Lipofectamine?2000使用說明書方法將終濃度為25 nmol/L的miR-517 mimic與miR-NC轉染入細胞中,24 h后檢測轉染效率。

1.3.2外泌體的分離 取兩組孕產(chǎn)婦的抗凝肘靜脈血,800×g離心10 min,取上層血漿,加入等量的PBS溶液進行稀釋后,4 ℃下3 000×g離心30 min,取上層組織清液,參考文獻[8]方法分離血漿中的胎盤外泌體,將上述組織清液經(jīng)0.22 μm的濾網(wǎng)過濾后,加入8%聚乙二醇(PEG)6000在4 ℃下孵育過夜,10 000×g離心20 min后,取底層沉淀物重懸于0.25 nmol/L的蔗糖溶液中,采用蔗糖密度梯度進一步離心純化,逐層取出各個梯度溶液后,加入8%PEG 6000再次于4 ℃下孵育過夜,10 000×g離心1 h,沉淀物即為所需的胎盤外泌體,200 μL PBS稀釋后用于后續(xù)實驗。

1.3.3透射電子顯微鏡(TEM)觀察外泌體形態(tài) 采用TEM觀察外泌體形態(tài),簡述如下:取5～10 μL新鮮分離的外泌體懸液進行超速離心后,4 ℃下在2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的固定液中固定1 h,梯度乙醇脫水,隨后浸泡在環(huán)氧樹脂中過夜。包埋樣品后,60 ℃下聚合24 h,鉛鈾染色,超薄切片后進行TEM觀察。所有切片在80 kV加速電壓下觀察、拍照。

1.3.4納米示蹤技術(NTA)分析 NTA從光散射和布朗運動兩個方面檢測外泌體的大小分布和濃度。使用PBS溶液將外泌體樣品稀釋至(1～9)×108/mL,采用Nanosight LM10儀器進行檢測。跟蹤每個樣品30 s,攝像機設置為16,其中增益設置為6.0,閾值設置為11。記錄外泌體的運動軌跡。以稀釋后樣品的濃度和粒度分布圖為輸出,計算外泌體粒徑大小分布與濃度。

1.3.5外泌體的標記與攝取 參考PKH67熒光染料試劑盒標記外泌體,并采用BCA蛋白定量試劑盒進行外泌體定量。取稀釋后的外泌體懸液與PHK67試劑輕輕混勻后,4 ℃下100 000×g離心2 h,取底層沉淀,PBS溶液洗滌2次后,取約100 μg標記的外泌體溶液加入提前接種于24孔板中的HTR-8細胞中,在37 ℃、5%CO2孵箱中孵育24 h,用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察HTR-8細胞攝取外泌體的情況。

1.3.6細胞的處理與分組 取處于對數(shù)生長期的HTR-8或Jurkat T細胞,按實驗目的將細胞分為5組:正常培養(yǎng)的對照組,轉染miR-517 mimic序列的miR-517 mimic組,轉染miR-NC序列的miR-NC組,分別與5.0 μg/mL NP-外泌體或PE-外泌體進行共同培養(yǎng)的NP-外泌體組或PE-外泌體組。上述各組HTR-8或Jurkat T細胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h,用于后續(xù)實驗檢測。

1.3.7CCK-8法檢測細胞的增殖 將HTR-8或Jurkat T細胞按5×103/孔的密度接種至96孔板中,按步驟1.3.1將miR-517 mimic與miR-NC轉染至細胞中,并按步驟1.3.6的分組進行處理后置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),按照CCK-8試劑盒操作方法分別在培養(yǎng)的0、24、48 h后,在酶標儀490 nm處檢測各組細胞吸光度值(A值)。所有時間點的細胞活力以各孔與空白對照校正后的A值表示,并以0 h的細胞活力進行歸一化處理。

1.3.8Transwell檢測細胞的侵襲 在24孔板中采用孔徑為8 μm的Transwell小室檢測各組HTR-8細胞的侵襲能力。簡述如下:在預先包被BD基質膠的小室中加入200 μL含1%FBS和1×106個細胞的RPMI-1640細胞懸液,下室為800 μL含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h后,取出小室,經(jīng)4 ℃預冷5%戊二醛固定和0.1%結晶紫染色后,PBS溶液充分洗滌細胞2次,顯微鏡下觀察穿出的細胞數(shù)。

1.3.9qPCR檢測細胞與外泌體中miR-517的表達 TRIzol法提取胎盤組織或細胞中的總RNA,外泌體中總RNA利用外泌體RNA提取試劑盒說明書方法進行提取。使用反轉錄試劑盒All-in-OneTM將總RNA反向轉錄為cDNA,然后用SYBRTMGreen Master Mix進行qPCR檢測,引物序列如下:miR-517上游:5′-GCCACATCGTGCACCCTTTT-3′,miR-517下游:5′-GTCGTACCAGTGCAGGGTCC-3′,U6上游:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,U6下游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,以U6為內參,采用2-ΔΔCt方法分析miR-517表達。

1.3.10蛋白質印記法(Western blot)檢測外泌體標志性蛋白CD63、TSG101和胎盤特異性蛋白PLAP的表達 采用蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液在冰上提取外泌體中的總蛋白,4 ℃下,12 000 r/min離心4 min,收集上清液,BCA試劑盒測定蛋白濃度。取約20 μg蛋白樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行層析后,濕轉法轉移至聚偏氟乙烯膜上,采用5%脫脂奶粉在室溫下封閉抗體1 h后,加入一抗CD63(1∶500)、TSG101(1∶1 000)、PLAP(1∶500)、血清清蛋白(1∶2 000),4 ℃下孵育過夜,隨后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000),室溫下孵育2 h后,滴加增強型化學發(fā)光檢測試劑在凝膠成像系統(tǒng)進行顯色、成像,采用Image-Pro Plus 6.0軟件用于蛋白灰度分析。

2 結 果

2.1miR-517在健康孕產(chǎn)婦和PE患者胎盤組織中的表達 qPCR檢測結果顯示,與NP組比較,miR-517在PE組胎盤組織中的表達明顯降低(P<0.05),見圖1。

注:與NP組比較,aP<0.05。

2.2miR-517在胎盤外泌體中的表達 TEM與NTA檢測結果顯示,來源于PE組與NP組的胎盤外泌體具有典型的圓盤狀或新月形的雙層膜結構,顆粒直徑在30～150 nm,見圖2A、B。Western blot檢測結果顯示,CD63、TSG101、PLAP在胎盤外泌體中高表達,而血清清蛋白呈低表達,見圖2C。上述結果符合胎盤外泌體的基本特征,提示成功分離了來源于PE組與NP組血漿中的胎盤外泌體。qPCR檢測結果顯示,與NP-外泌體組比較,miR-517在PE-外泌體組中的表達明顯降低(P<0.05),見圖2D。

注:A為TEM觀察外泌體形態(tài);B為NTA檢測外泌體大小和密度;C為Western blot檢測CD63、TSG101、PLAP的表達;D為qPCR檢測miR-517在胎盤外泌體中的表達;與NP-外泌體組比較,aP<0.05。

2.3各組滋養(yǎng)層細胞中miR-517表達比較 PKH67標記的胎盤外泌體與HTR-8細胞共培養(yǎng)后,采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察,結果表明,胎盤外泌體可被HTR-8細胞攝取,見3A;qPCR檢測各組HTR-8細胞中miR-517表達的結果顯示,與對照組比較,miR-517 mimic組與NP-外泌體組中miR-517表達明顯升高(P<0.05),miR-NC組與PE-外泌體組miR-517表達均無明顯改變(P>0.05);與NP-外泌體組比較,miR-517 mimic組miR-517表達明顯升高(P<0.05),PE-外泌體組miR-517表達明顯降低(P<0.05),見圖3B。

2.4各組滋養(yǎng)層細胞增殖能力的檢測 CCK-8法檢測各組HTR-8細胞增殖能力的結果顯示,與對照組比較,miR-517 mimic組和NP-外泌體組細胞的增殖能力明顯升高(P<0.05),miR-NC組無明顯改變(P>0.05),PE-外泌體組明顯降低(P<0.05);與NP-外泌體組比較,miR-517 mimic組細胞增殖能力明顯升高(P<0.05),而PE-外泌體組明顯降低(P<0.05),見圖4。

注:與對照組比較,aP<0.05;與NP-外泌體組比較,bP<0.05。

2.5各組滋養(yǎng)層細胞侵襲能力的檢測 Transwell檢測結果顯示,與對照組比較,miR-517 mimic組和NP-外泌體組的侵襲細胞數(shù)明顯增加(P<0.05),miR-NC組無明顯改變(P>0.05),PE-外泌體組明顯減少(P<0.05);與NP-外泌體組比較,miR-517 mimic組的侵襲細胞數(shù)明顯增加(P<0.05),PE-外泌體組卻明顯減少(P<0.05),見圖5。

2.6各組Jurkat T細胞中miR-517的表達及增殖能力檢測 qPCR檢測外泌體中miR-517表達的結果顯示,與對照組比較,miR-517 mimic中miR-517表達表達明顯升高(P<0.05),miR-NC組無明顯改變(P>0.05),見圖6A;CCK-8法檢測結果顯示,與對照組比較,miR-517 mimic組與NP-外泌體組的Jurkat T細胞增殖能力明顯降低(P<0.05),miR-NC組無明顯改變(P>0.05),而PE-外泌體組卻明顯升高(P<0.05);與NP-外泌體組比較,miR-517 mimic組Jurkat T細胞增殖能力明顯降低(P<0.05),而PE-外泌體組卻明顯升高(P<0.05),見圖6B。

注:A為qPCR檢測各組Jurkat T細胞中miR-517表達;B為CCK-8法檢測各組Jurkat T細胞的增殖能力;與對照組比較,aP<0.05;與NP-外泌體組比較,bP<0.05。

3 討 論

PE嚴重影響母嬰健康,其不僅增加早產(chǎn)和低出生體重兒的風險,而且也是導致孕產(chǎn)婦和胎兒死亡的主要原因。同時,PE還使孕產(chǎn)婦和胎兒在遠期罹患心血管疾病和高血壓的風險明顯升高[1]。miRNA是一類非編碼小RNA分子,可通過調控機體超過90%的基因表達而參與多種疾病的發(fā)生和進展。人類胎盤細胞表現(xiàn)出器官和物種特有的miRNA圖譜,該圖譜在整個妊娠過程中不斷變化,對反映孕產(chǎn)婦和胎兒的健康狀況具有重要意義[3]。C19MC簇是一種獨特的胎盤特異性生物標志物,因其在妊娠期間的血漿外泌體表達較高而被檢測到。如C19MC簇中的成員miR-517,在其他組織中表達極少,但在孕婦血漿(從妊娠早期到足月妊娠)標本中的檢出率為100%,提示其表達變化的檢測可能具有妊娠相關疾病的診斷潛力[2,4]。本研究結果顯示,miR-517在PE患者胎盤組織與胎盤外泌體中的表達明顯降低,而過表達miR-517可促進滋養(yǎng)層細胞增殖與侵襲能力,但可抑制Jurkat T細胞的增殖。

既往研究表明,在妊娠早期(妊娠12～14周)的血漿標本中miR-517表達的降低對PE發(fā)展具有較高的預測準確性[2]。同時,近期一項基于血漿外泌體中C19MC簇定量檢測的回顧性研究發(fā)現(xiàn),妊娠早期血漿外泌體中miR-517表達降低同樣具有診斷早期PE的潛力,且其診斷準確性明顯高于孕婦血漿標本[4]。這提示,作為C19MC簇的代表性成員,miR-517可能被胎盤細胞以外泌體的形式釋放至周圍環(huán)境中進而調控多種靶細胞的功能,參與影響PE的發(fā)生、發(fā)展。如前所述,盡管PE的發(fā)病機制尚不清楚,但主流觀點認為:滋養(yǎng)層細胞侵襲能力受損,導致的子宮螺旋小動脈重鑄不足,胎盤血流減少和胎盤功能受損誘導孕婦的炎癥分子和細胞因子的大量釋放是最終導致系統(tǒng)性炎癥反應和一系列孕婦臨床病理表現(xiàn)的重要機制[1]。本研究首先比較miR-517在PE患者與健康孕產(chǎn)婦的胎盤組織與胎盤外泌體中的表達差異,結果表明,miR-517在PE患者中的表達明顯降低,這與上述研究結果一致,均提示miR-517具有作為PE生物學標志物的應用潛力[2-4]。然而,miR-517是否調控PE發(fā)生中具有重要地位的滋養(yǎng)層細胞的侵襲功能尚不清楚。但在腫瘤領域,如在結直腸癌中,MA等[9]研究表明,在結直腸癌組織中的表達明顯升高的miR-517a可能通過促進腫瘤細胞的遷移與侵襲能力而發(fā)揮促癌基因的功能。而在膠質瘤中,中藥活性成分柴胡皂苷D可通過下調miR-517a的表達,促進膠質瘤細胞發(fā)生凋亡,并抑制細胞的遷移、侵襲與增殖能力,從而在體內發(fā)揮抑制腫瘤細胞與組織生長的作用[10]。鑒于滋養(yǎng)層細胞與腫瘤細胞均具有活躍的增殖與侵襲能力[11],本研究通過分離來源于健康孕產(chǎn)婦與PE患者血漿中的胎盤外泌體,在體外實驗中探究miR-517表達差異的外泌體對滋養(yǎng)層細胞增殖與侵襲能力的影響。同時,在滋養(yǎng)層細胞中進行過表達miR-517進一步直接驗證miR-517對滋養(yǎng)層細胞的影響。研究結果顯示,與PE患者的胎盤外泌體比較,健康孕產(chǎn)婦的胎盤外泌體可明顯促進滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲能力,且過表達滋養(yǎng)層細胞中的miR-517則具有更為明顯的促進作用,這提示胎盤外泌體中的miR-517表達對滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲能力具有明顯的促進作用。

眾所周知,外泌體可被鄰近或遠處的受體細胞識別并內化,從而通過其內攜帶的多種生物活性成分誘導后者的功能發(fā)生一系列改變[5]。由于孕婦免疫系統(tǒng)在妊娠期間需要進行特定地適應,以產(chǎn)生對同種異體胎兒的免疫耐受性,因此免疫細胞可能是來源于胎盤外泌體的重要靶目標,尤其是具有多種亞型與功能的T細胞[12]。T細胞的增殖、活化及其釋放的白細胞介素(IL)-2、IL-17和其他炎癥細胞因子對妊娠具有潛在的危害,并可能參與PE和其他妊娠相關疾病的發(fā)生與進展[13]。同時,探究胎盤外泌體轉運的miRNAs對PE的早期診斷和治療及理解免疫調控機制具有重要意義。因此,為進一步探究胎盤外泌體對T細胞功能的影響,本研究選取了Jurkat T細胞進行體外實驗,結果表明與來源健康孕婦的胎盤外泌體比較,PE患者的外泌體能明顯促進Jurkat T細胞的增殖能力,但過表達細胞中的miR-517卻抑制了Jurkat T細胞的增殖能力,這提示胎盤外泌體中的miR-517表達對T細胞功能可能發(fā)揮下調作用。而miR-517對滋養(yǎng)層細胞與Jurkat T細胞增殖方面的相反作用也證實了miRNAs功能的異質性和細胞特異性反應的假說。

綜上所述,在PE患者胎盤組織與胎盤外泌體中表達下調的miR-517可能通過調節(jié)滋養(yǎng)層細胞的增殖與侵襲和T細胞的功能參與疾病發(fā)生與進展。本研究進一步探討了miR-517在PE中的作用及其可能的作用方式,為miR-517成為PE的早期臨床診斷的生物學標志物提供了新的思路與依據(jù)。