秦續(xù)元,周平平,宋 旸,杜珍武*,張桂珍,*

(1.長春腫瘤醫(yī)院基因檢測中心,吉林 長春130013;2.吉林大學第二醫(yī)院骨科醫(yī)院,吉林 長春130041)

腫瘤新抗原(Tumor Neoantigen)又稱為腫瘤特異性抗原,該抗原只在腫瘤細胞內(nèi)表達而在正常細胞內(nèi)不表達,并能被人白細胞分化抗原(HLA)I類分子識別、結(jié)合并遞呈到腫瘤細胞表面,激活特異性T淋巴細胞,引發(fā)機體抗腫瘤免疫反應(yīng)[1]。由于腫瘤患病個體異質(zhì)性導致腫瘤新抗原具有個體化特點,由此以腫瘤新抗原為靶點為腫瘤個體化免疫治療提供了科學性和可行性?；谛驴乖_發(fā)的抗腫瘤的RNA、肽疫苗以及樹突細胞疫苗已在黑色素瘤[2-3]、膠質(zhì)瘤[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]及前列腺癌[7]等的臨床應(yīng)用研究中顯示出良好的治療效果,提示腫瘤新抗原在腫瘤治療中具有的潛在應(yīng)用價值。

肺癌是我國發(fā)病率及死亡率居首位的惡性腫瘤。肺腺癌是肺癌中最為常見的病理分型[8],其分子突變譜不僅含有當前靶向治療藥物治療的主要靶點[9],也具有較高的腫瘤特異性突變負荷[10-11],近期兩項基于腫瘤新抗原技術(shù)對于進展期肺腺癌治療的臨床研究結(jié)果顯示了具有良好的治療效果,提示該技術(shù)在肺腺癌治療的應(yīng)用價值[12-13],這些研究結(jié)果將加速腫瘤新抗原在肺腺癌臨床治療的研究進程。

目前,腫瘤新抗原的發(fā)現(xiàn)主要是采用全外顯子高通量測序篩選出腫瘤細胞特異性基因突變并結(jié)合其轉(zhuǎn)錄組測序中的基因表達水平,再通過免疫抗原數(shù)據(jù)庫預(yù)測與人類白細胞抗原(HLA) I類分子的親和力,具有高親和力的肽段體外負載樹突細胞,測定激活淋巴細胞的能力,評估新抗原肽段的免疫原性與抗腫瘤效果[14]。該過程雖然實現(xiàn)基于個體化的腫瘤免疫治療,但相比現(xiàn)有的免疫治療(特別是免疫檢測點及CAR-T細胞治療),在臨床應(yīng)用較為繁瑣、復(fù)雜以及昂貴的治療費用,將限制其在臨床應(yīng)用[15]。分析腫瘤新抗原在人群中的分布情況,發(fā)現(xiàn)腫瘤患者可能共有的新抗原,建立適用于不同人群腫瘤治療的新抗原庫,將有助于提升新抗原在抗腫瘤中的應(yīng)用。

本研究應(yīng)用在長春腫瘤醫(yī)院就診的肺腺癌患者的599個基因全外顯子測序結(jié)果,選擇腫瘤特異性基因突變產(chǎn)生的變異肽段序列,通過pVACtools軟件[16]預(yù)測變異肽段與HLA分型親和力。篩選出親和力分值大于1的肽段作為新抗原進行分析,觀察這些新抗原在肺腺癌人群中的分布,并進一步分析其與臨床病理特征和基因突變特征之間的關(guān)系,為肺腺癌患者的新抗原免疫治療研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

以2020年4月至2022年12月長春腫瘤醫(yī)院進行治療的41例肺腺癌患者為研究對象。41例肺腺癌患者均進行高通量基因測序用于指導肺癌的分子靶向治療。41例患者中位年齡為56歲(33-80歲);男性患者22例(53.7%),女性患者19例(46.3%);腫瘤分期：Ⅰ-Ⅱ期15例(36.5%),Ⅲ-Ⅳ期26例(64.5%);有轉(zhuǎn)移(包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與遠處轉(zhuǎn)移)28例(68.3%),無轉(zhuǎn)移13例(31.7%)。

1.2 肺腺癌標本的高通量測序數(shù)據(jù)獲取

41例肺腺癌患者的高通量基因測序結(jié)果作為本實驗分析的數(shù)據(jù)來源。檢測樣本包括腫瘤石蠟包埋組織(29例)與外周血液樣本(12例)。檢測的靶基因為599個基因的外顯子,檢測基因突變類型包括點突變、缺失、擴增與基因融合。檢測的儀器平臺為Illumina Novaseq 6000高通量測序平臺,平均測序深度為組織平均5000x(最低≥3000x),血液平均10000x(最低≥5000x對照平均 500(最低≥400x)?；驒z測委托金域檢驗公司完成。高通量測序結(jié)果包括基因突變情況以及靶向用藥指導,預(yù)測腫瘤新抗原序列與腫瘤抗原突變總負荷(TMB)情況等。

1.3 新抗原預(yù)測

應(yīng)用pVACtools軟件對新抗原進行預(yù)測,具體過程如下：經(jīng)過質(zhì)控合格的高通量測序的原始數(shù)據(jù),與人參考基因組進行比對,獲取突變比例大于1%的體細胞突變;通過與HLA庫進行比較,獲得HLA-A/B/C的基因型;利用VEP注釋,過濾掉無義突變和跟野生型蛋白相同的變異位點;利用pvacseq軟件將包含體細胞突變的多肽片段,分別切成8-11 bp的肽段,通過NetMHC、SMM、PickPocket等算法,分別預(yù)測與不同HLA分型的親和力,多肽的免疫原性等,輸出親和力超過野生型的多肽片段。對新抗原肽段進行親和力進行打分(新抗原親和力分值=原肽段親和力分值/新肽段親和力分值);選擇新抗原親和力分值大于1的新抗原進行統(tǒng)計。

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.00(IBM Corp,USA)統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析,P<0.05認為具有統(tǒng)計學差異。預(yù)測腫瘤新抗原在人群中分布以及與臨床病理特征之間的關(guān)系根據(jù)數(shù)據(jù)變量不同分別采取卡方檢驗及t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 新抗原預(yù)測情況

通過對41例肺腺癌患者樣本的599個基因的全外顯子高通量測序結(jié)果進行新抗原預(yù)測分析,結(jié)果顯示共有29例樣本(占總樣本數(shù)70.7%)預(yù)測具有新抗原,12例樣本(占總樣本數(shù)29.3%)未發(fā)現(xiàn)新抗原;在29例預(yù)測具有新抗原的樣本中,共預(yù)測出57個新抗原,其中1個新抗原13例(44.8%),2個新抗原10例(34.5%),3個新抗原2例(6.9%),4個新抗原2例(6.9%),5個新抗原2例(6.9%)。

2.2 不同樣本類型高通量測序結(jié)果預(yù)測新抗原情況

29例石蠟組織樣本高通量測序結(jié)果預(yù)測具有新抗原21例(占72.4%),12例外周血樣本高通量測序結(jié)果預(yù)測具有新抗原8例(66.7%),二者在新抗原預(yù)測檢出率上相比無顯著差異。29例樣本共預(yù)測出57個新抗原,其中組織樣本預(yù)測出新抗原45個(2.14個新抗原/例),外周血樣本檢測出新抗原12個(1.5個新抗原/例)。

2.3 預(yù)測新抗原的基因分布及HLA分型情況

本研究預(yù)測57個腫瘤新抗原親和力打分分值范圍1.01-1380.384,分值越高則該新抗原與對應(yīng)的HLA親和力越高,能夠被遞呈到細胞表面,與T淋巴細胞TCR結(jié)合能力越強。表1按照分值列出前10個打分最高的患者及相關(guān)肽段。這些新抗原來源于47個基因,其中含有預(yù)測新抗原數(shù)目前5的基因為表皮生長因子受體(EGFR)基因(7個新抗原),絲氨酸/蘇氨酸激酶3(AKT3)(3個新抗原),kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(KEAP1)(3個新抗原),鈣調(diào)蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶2B(KMT2B )(3個新抗原),絲氨酸/蘇氨酸激酶11(STK11)(3個新抗原)。與57個新抗原結(jié)合的HLA-I類分子共有19種分型,其中HLA-A*02：01分型最多,其次為HLA-A*02：06型。

表1 預(yù)測與HLA I類分子親和力分值前10新抗原

2.4 新抗原與基因突變類型分析

41例肺腺癌患者的599個基因的全外顯子高通量測序結(jié)果共檢測出306個非同義突變,其中包括260個點突變(85%),15個基因刪除突變(5%),12個基因擴增突變(4%),8個刪除插入突變(3%),7個基因重復(fù)突變(2%),2個基因插入突變(1%),1個基因跳躍突變(0.5%),1個基因融合突變(0.5%);檢出的所有突變中,共計260個單核苷酸變異;在所有的306個基因突變中,預(yù)測具有新抗原突變?yōu)?7個(占18.6%),檢出的57個新抗原中基因點突變53個(占93.0%),重復(fù)突變2個(占3.5%),刪除突變2個(占3.5%)。

基因突變數(shù)與預(yù)測新抗原數(shù)目存在相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.512,P值<0.05);點突變數(shù)與新抗原產(chǎn)生存在相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)=0.476,P值=0.002)。

2.5 預(yù)測新抗原與臨床病理類型相關(guān)性分析

腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率在不同性別的腫瘤患者之間沒有差異,腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率在有轉(zhuǎn)移的腫瘤患者(78.6%)明顯高于沒有轉(zhuǎn)移的患者(46.2%),在臨床分期上,處于Ⅲ-Ⅳ期的腫瘤患者的腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)率(80.8%)明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者(42.9%),(P=0.029),有新抗原的患者腫瘤突變總負荷(TMB)明顯高于無新抗抗原的患者(P=0.022),見表2。

表2 預(yù)測新抗原與臨床病理學特征關(guān)系

3 討論

腫瘤新抗原作為疫苗刺激免疫系統(tǒng)并產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)已逐漸成為新型腫瘤免疫療法研究的熱點[17]。高通量基因測序技術(shù)和生物信息學算法的快速進展,為腫瘤新抗原的分子鑒定提供了必要的支持。本研究應(yīng)用41例肺腺癌患者高通量測序結(jié)果進行腫瘤新抗原的預(yù)測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)29例(70.7%)肺腺癌樣本可預(yù)測具有新抗原,最多預(yù)測為5個新抗原。由于本研究基于599個基因外顯子測序結(jié)果進行的新抗原預(yù)測,其預(yù)測出新抗原的效率與數(shù)量低于基于腫瘤組織全外顯子測序的基因結(jié)果進行的新抗原預(yù)測的研究[18]。

基于高通量測序進行腫瘤新抗原預(yù)測的基因突變信息主要來源于腫瘤組織樣本包括手術(shù)切腫瘤組織、穿刺腫瘤組織以及胸腹水脫落腫瘤細胞等,而來源于循環(huán)腫瘤DNA的還未見研究報道。在本研究中用于腫瘤新抗原預(yù)測分析的腫瘤細胞基因突變信息不僅來源于腫瘤組織樣本,也來自外周血循環(huán)腫瘤DNA的樣本。預(yù)測結(jié)果表明腫瘤組織樣本與外周血樣本檢出基因突變均可預(yù)測出腫瘤新抗原,預(yù)測率二者并無差異,說明通過腫瘤患者外周血DNA分析,也能發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原,為無法獲取腫瘤組織患者選擇外周血進行新抗原的預(yù)測提供了理論依據(jù)。DNA突變負荷的動態(tài)變化的可檢測性[19],也為實時實施以個體腫瘤新抗原為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療提供可能。

當前腫瘤新抗原預(yù)測是基于突變的肽段被HLA-I類分子識別與結(jié)合能力,結(jié)合分數(shù)越高,該肽段被遞呈到腫瘤細胞的表面機會越大[20]。由于識別不同肽段的HLA-I類分子不同以及個體HLA-I類分型不同,使具有同一腫瘤類型腫瘤組織的患者預(yù)測新抗原具有差異性。本研究預(yù)測57個腫瘤新抗原親和力打分分值范圍從1.01到1380.384,與57個新抗原結(jié)合的HLA-I類分子共有19種分型,其中HLA-A*02：01分型最多,其次為HLA-A*02：06型。HLA分型決定新抗原與TCR受體結(jié)合的親和力情況,從而影響新抗原疫苗的療效。Tran E等報道[21]的一位患者,經(jīng)過新抗原附載的DC疫苗治療后,三處病灶均減小或消失,但一處病灶出現(xiàn)了免疫超進展,在對次病灶進行HLAI 類分子表達的檢測發(fā)現(xiàn),該患者的HLA I類分子表達缺失,導致新抗原無法被正常遞呈到細胞表面。因此腫瘤組織細胞HLA-I類分子表達檢測在實施腫瘤新抗原治療過程中是十分必要的。

通過腫瘤新抗原的預(yù)測分析將會明確每個新抗原的基因突變信息、突變肽段的氨基酸信息以及相結(jié)合的HLA-I分子的分型。一旦在體內(nèi)外實驗證明應(yīng)用這些新抗原進行腫瘤治療的有效性,對于具有同樣新抗原以及HLA-I分型的其他患者將或從中受益。一項研究對國際癌癥基因組協(xié)會數(shù)據(jù)庫的9155個癌癥樣本體細胞突變進行新抗原預(yù)測[22],發(fā)現(xiàn)65個常見腫瘤驅(qū)動基因存在新抗原,其中最多的新抗原相關(guān)基因是KRAS(G12D和G12V)。研究發(fā)現(xiàn)K-RAS基因第二外顯子G12D突變所在9-10個肽段可作新抗原,與HLA-C*08：02具有高親和性。應(yīng)用該抗原肽分別對具有同樣K-RAS基因突變以及HLA-I分型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者及胰腺癌患者進行治療研,結(jié)果顯示據(jù)具有良好的治療效果[21,23]。本研究預(yù)測新抗原數(shù)目最多為表皮生長因子受體(EGFR)基因(7個新抗原),突變位點集中于L858R、C797S、G719S、L747_P753delinsS。該研究結(jié)果為以EGFR突變預(yù)測存在新抗原進行肺腺癌免疫治療研究提供前期科研信息。

本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新抗原的基因突變類型主要是點突變產(chǎn)生,這與Duksza等的研究新抗原產(chǎn)生基因突變類型相同[24],在新抗原預(yù)測結(jié)果與臨床病理分析上發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)移及Ⅲ-Ⅳ期患者的腫瘤組織或外周血基因檢測獲取的新抗原預(yù)測陽性率明顯增高,說明隨著腫瘤進展,腫瘤基因突變頻率增多,帶來腫瘤新抗原增多。

免疫檢查點抑制(ICI)已成為近10年癌癥免疫治療的主要方法[25],高TMB被作為評價ICIs療效的重要生物標志物[26]。研究表明[27]腫瘤特異性突變會產(chǎn)生新抗原,介導對ICIs的應(yīng)答,故推測高TMB會導致更多的新抗原產(chǎn)生,增加腫瘤免疫原性,提高腫瘤對ICIs的反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)測出具有新抗原的患者TMB明顯高于沒有預(yù)測出新抗原的患者。一項臨床試驗表明[28],新抗原疫苗與PD-1抑制劑結(jié)合,用于高TMB的轉(zhuǎn)移患者具有較高的可行性和安全性。

總之,本研究應(yīng)用肺腺癌患者的高通量基因測序結(jié)果,探討了肺腺癌患者預(yù)測產(chǎn)生新抗原情況,觀察這些新抗原在肺腺癌人群分布,分析其與臨床病理特征和基因突變特征的關(guān)系,為肺腺癌患者的新抗原免疫治療研究提供實驗基礎(chǔ)。