梁博 何躍 劉泓鍵 奉友剛 何俊

膀胱癌復(fù)發(fā)率高,了解膀胱癌發(fā)病機制,尋找相關(guān)標志物對其早期診斷及治療有積極意義[1]。膀胱癌病人中多種miRs表達異常,其中miR-144在人體7號染色體中,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。有研究顯示,膀胱癌病人血清miR-144水平降低,且與病人臨床病理特征有關(guān)[2-3]。肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metasis-associatedlung adenoearcinoma transcript 1,MALA T1)首次發(fā)現(xiàn)于非小細胞肺癌中,近年來進一步證實了在多種腫瘤及疾病發(fā)生過程中可見MALA T1參與,其與腫瘤的侵襲性、轉(zhuǎn)移等行為緊密相關(guān)[4]。睪丸蛋白聚糖(SPOCK1)是與膀胱癌密切相關(guān)的癌基因 ,下調(diào)SPOCK1的表達能夠使膀胱癌細胞的增殖、細胞周期、侵襲均發(fā)生停滯[5]。本研究檢測膀胱癌組織中miR-144、MALAT1及SPOCK1表達,探討三者在膀胱癌中的診斷價值。

對象與方法

一、對象

2018年1月～2021年1月本院收治的膀胱癌病人96例,男72例,女24例,年齡39～79歲,平均年齡(48.69±7.54)歲。中高分化69例,低分化27例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例;腫瘤TNM分期Ⅰ～Ⅱ期72例,Ⅲ～Ⅳ期24例。手術(shù)留取膀胱癌病人新鮮腫瘤組織(腫瘤組)及距離腫瘤邊緣>2 cm癌旁正常組織(癌旁組)各5 mg。術(shù)后依據(jù)自身情況輔助化療,通過電話和門診隨訪等方式進行隨訪,隨訪截止2022年1月30日。根據(jù)病人預(yù)后情況分為預(yù)后良好組與預(yù)后不良組。復(fù)發(fā)定義為尿道鏡檢查提示尿道(前列腺部尿道已切除)存在異常腫物,且病理檢查最終證實為尿路上皮癌。納入標準:(1)臨床資料完整;(2)病人術(shù)前活檢標本或膀胱電切或膀胱根治性切除術(shù)術(shù)中/后送檢,經(jīng)病理診斷,符合《歐洲腫瘤醫(yī)學(xué)協(xié)會膀胱癌診斷、治療和隨訪實踐指南》中膀胱尿路上皮癌相關(guān)診斷及分期標準[6];(3)均簽署知情同意書;(4)無其他惡性腫瘤病史;(5)入院前未接受相關(guān)治療;(6)術(shù)前活檢標本或術(shù)中/后送檢,經(jīng)病理診斷證實。排除標準:臨床資料缺失;妊娠期或哺乳期婦女;合并間質(zhì)性膀胱炎、神經(jīng)源性膀胱;有嚴重泌尿系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、精神障礙。

二、方法

1.miR-144、MALAT1及SPOCK1的檢測:術(shù)中將病灶組織切除,同時保留部分離癌組織>2 cm位置的正常組織,將獲得標本做成5 mm×5 mm小塊,清洗后放置于甲醛溶液浸泡。miR-144、MALAT1及SPOCK1均采用熒光實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)法進行檢測,使用TRIzol總RNA試劑盒(北京天根公司)提取樣本總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄儀將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束后,使用PCR分析儀行實時熒光PCR檢驗,采用Opticon Monitor軟件分析PCR反應(yīng)結(jié)果并計算循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct),2-ΔΔCt法計算目標RNA的相對表達量。中△Ct=Ct目標基因-Ct內(nèi)參基因,△△Ct=△Ct檢測樣品-△Ct基準樣品。

2.觀察指標:比較腫瘤組與癌旁組miR-144、MALAT1及SPOCK1相對表達量;對比miR-144、MALAT1及SPOCK1在不同膀胱癌臨床病理特征中表達情況,如臨床分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等,計算miR-144、MALAT1、SPOCK1對膀胱癌診斷效果。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.腫瘤組與癌旁組miR-144、MALAT1及SPOCK1相對表達量比較:腫瘤組MALAT1及SPOCK1相對表達量高于癌旁組,miR-144相對表達量低于癌旁組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 腫瘤組與癌旁組miR-144、MALAT1及SPOCK1相對表達量比較

2.miR-144、MALAT1及SPOCK1在不同膀胱癌臨床病理特征中表達情況:Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者miR-144表達明顯低于Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者;Ⅲ～Ⅳ期、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者MALAT1、SPOCK達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05),見表2。

表2 miR-144、MALAT1及SPOCK1在不同膀胱癌臨床病理特征中表達情況

3.miR-144、MALAT1及SPOCK1對膀胱癌診斷價值:繪制ROC曲線,計算AUC值。miR-144、MALAT1及SPOCK1對膀胱癌診斷AUC值分別為0.643、0.557,SPOCK1診斷AUC值為0.717(95%Cl:0.688～0.845),以SPOCK1診斷AUC值最高(P<0.05),見表3、圖1。

A:miR-144對膀胱癌診斷ROC曲線圖;B:MALAT1對膀胱癌診斷ROC曲線圖;C:SPOCK1對膀胱癌診斷ROC曲線圖

表3 miR-144、MALAT1及SPOCK1對膀胱癌診斷價值

4.不同預(yù)后病人miR-144、MALAT1及SPOCK1表達情況比較見表4。96例病人中預(yù)后良好85例,預(yù)后不良11例。預(yù)后不良組miR-144低于預(yù)后良好組,MALAT1及SPOCK1高于預(yù)后良好組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 兩組病人miR-144、MALAT1及SPOCK1表達情況比較

討論

miRNAs對機體細胞具有調(diào)控作用,miRNAs中有超過50%分布在與腫瘤有關(guān)的脆性點位以及基因區(qū)域內(nèi),參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展。miR-144在胃癌細胞中表達下調(diào),可靶向激活增強結(jié)合蛋白4從而抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移與侵襲[7-8]。本研究結(jié)果表明,與癌旁組織相比,癌組織中miR-144表達降低,靶向前B細胞白血病轉(zhuǎn)錄因子3作用降低,引起腫瘤發(fā)生、發(fā)展[9],且與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),miR-144表達越低,其臨床臨床分期增加,出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率越高,考慮與癌細胞突變后對miR-144調(diào)控機制產(chǎn)生影響,進而使其表達降低。通過miR-144抑制劑阻斷內(nèi)源性的miR-144表達后發(fā)現(xiàn),膀胱癌細胞出現(xiàn)增殖速度加快,增強miR-144表達后細胞增殖被抑制,認為其機制與miR-144靶向zeste同源物2抑制了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路有關(guān),達到抑制膀胱癌細胞增殖的目的[10]。

MALAT1已被證實在肺癌、肝癌等惡性腫瘤中表達明顯增加,與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11]。有研究顯示,MALAT1可作為分子海綿結(jié)合并抑制miR-375的功能,從而促進下游癌基因YES相關(guān)蛋白1的表達,致使腫瘤細胞出現(xiàn)浸潤轉(zhuǎn)移以及無限增殖的情況,在MALAT1高表達者中其預(yù)后不良的幾率增加[12]。有學(xué)者認為,MALAT1或可作為腫瘤診斷及治療的新靶點。本研究結(jié)果顯示,膀胱癌組織中MALAT1表達升高。同時本研究結(jié)果也顯示,Ⅲ～Ⅳ期、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者及預(yù)后不良者中MALAT1均為高表達,表明MALAT1與病情發(fā)展存在一定關(guān)系。MALAT1可通過和分子海綿結(jié)合miR-101-3p,提高促進血管內(nèi)皮因子的水平,或是促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、引起預(yù)后較差的原因。

SPOCK1作為鈣離子結(jié)合蛋白多糖家族中的一員,可影響機體內(nèi)細胞的生長、分化等生物學(xué)行為,同時也可參與細胞與基質(zhì)以及細胞與細胞之間的作用[13]。有研究顯示,肝癌、非小細胞肺癌中SPOCK1表達異常升高,高表達的SPOCK1可促進病人癌細胞增殖能力,并促進其發(fā)展[14]。本研究發(fā)現(xiàn),在癌組織中SPOCK1表達增加,與miRNA對SPOCK1轉(zhuǎn)錄后表達及調(diào)控之間存在關(guān)系。有學(xué)者認為,miR-139可與SPOCK1的3'非編碼區(qū)之間相互作用,進而使SPOCK1的穩(wěn)定性被破壞,其表達也會受到明顯抑制;腫瘤發(fā)生后,miR-139表達減少,導(dǎo)致對SPOCK1抑制程度減少,SPOCK1表達隨之升高[15]。同時,SPOCK1表達與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),提示SPOCK1或可為促癌基因,對膀胱癌發(fā)展有促進作用。有研究認為,SPOCK1在細胞外基質(zhì)重塑中有重要作用,對癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有促進作用,腫瘤細胞在此影響下出現(xiàn)基質(zhì)分離幾率更高,導(dǎo)致腫瘤更易發(fā)展轉(zhuǎn)移與侵襲。

通過繪制ROC曲線可知,miR-144、MALAT1及SPOCK1對膀胱癌均具有一定診斷價值,其中以SPOCK1診斷價值較高,三者表達與病人臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示三者均為可病人臨床診斷及病人病情嚴重程度提供參考。

綜上所述,膀胱癌組織中miR-144、MALAT1及SPOCK1異常表達,與腫瘤病理特征存在一定聯(lián)系,或可作為膀胱癌潛在診斷標志物。本研究不足在于研究納入樣本量較少,并未對病人進行長期隨訪。