劉 賀,張 鵬,孫利東,彭 菲 馬 玲,劉振偉,田國(guó)輝

(1.滿洲里海關(guān)技術(shù)中心 食品實(shí)驗(yàn)室,滿洲里021400;2.黑龍江大學(xué) 功能無(wú)機(jī)材料化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150080)

0 引 言

施用農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中通過(guò)控制昆蟲、真菌、雜草和其他有害生物來(lái)減少作物損失、提高產(chǎn)量、提高作物質(zhì)量所使用的主要方法之一[1]。百菌清(Chlorothalonil,CTN)是一種高效、低排的非內(nèi)息性、廣譜、保護(hù)性有機(jī)氯殺菌劑[2-3],被廣泛噴灑于花卉、果蔬、糧食等作物用于病蟲害的防治。百菌清是酶活性抑制劑,通常認(rèn)為其作用機(jī)理是與真菌細(xì)胞中的三磷酸甘油脫氫酶中的半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合,使真菌細(xì)胞的新陳代謝受破壞失去生命力達(dá)到抑菌目的[4-5]。然而百菌清良好的黏著性導(dǎo)致其在果蔬、土壤及水體中產(chǎn)生較大的殘留,直接對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重危害[6]。該農(nóng)藥性質(zhì)穩(wěn)定,根據(jù)土壤理化性質(zhì)不同,半衰期最長(zhǎng)可達(dá)6個(gè)月之久,殘效期長(zhǎng),具有明顯的毒性蓄積[7]。2017年10月27日,世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布了致癌物質(zhì)清單,百菌清在2B類致癌清單中[8]。2020年,歐盟正式?jīng)Q定實(shí)施對(duì)百菌清的禁令[9],因此,食品中百菌清殘留的檢測(cè)日益受到人們的重視。

目前,針對(duì)果蔬中百菌清殘留量檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[10-11]、氣相色譜法[12-14]和氣相色譜-質(zhì)譜法[15-16]等技術(shù)。王天麗等用Florisil柱富集、凈化,用乙酸乙酯洗脫GC-ECD檢測(cè)環(huán)境水樣中百菌清農(nóng)藥殘留[17];李旭霞用HLB固相萃取小柱,全自動(dòng)固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)地表水中百菌清農(nóng)藥殘留[18];李凌云等用乙腈提取,鹽析后離心,膜過(guò)濾后使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜中百菌清殘留量的方法[19]。上述百菌清的前處理檢測(cè)技術(shù)步驟繁多,提取劑消耗量大,既浪費(fèi)又對(duì)環(huán)境造成二次污染,部分提取后不經(jīng)凈化步驟,會(huì)增加儀器維護(hù)頻率,不符合大批量檢測(cè)的要求。

QuEChERs前處理方法是近年來(lái)國(guó)際上運(yùn)用最廣泛的一種樣品前處理技術(shù),由美國(guó)Anastassiades教授等于2003年開發(fā),其原理是利用吸附劑填料吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)從而達(dá)到凈化的目的[20]。根據(jù)樣品基質(zhì)中的雜質(zhì)不同,吸附劑的選擇及用量也不同。本研究設(shè)計(jì)建立了一種優(yōu)化后的QuEChERs前處理方法,使用N-丙基乙二胺、C18粉末(ODS)、多壁碳納米管為吸附劑進(jìn)行凈化,使用氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器檢測(cè)果蔬中百菌清殘留量,對(duì)比不同儀器檢測(cè)百菌清的檢出限與定量限,通過(guò)考察回收率與精密度的數(shù)值,確定該方法的實(shí)用性,以期滿足果蔬中百菌清殘留量的快速檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

BS 150A電子天平(上海有聲恒器有限公司);XW-200E型漩渦混合器(上海青浦瀘西儀器廠);HC-3518型離心機(jī)(安徽中科);氮?dú)獍l(fā)生器(美國(guó)Parker公司);Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司);氣相色譜儀(美國(guó)Agilent科技有限公司),電子捕獲檢測(cè)器(ECD)。

百菌清農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司,純度大于99 %);正己烷、冰乙酸(分析純,上海展云化工有限公司);乙腈 (色譜純,美國(guó)TEDIA公司);丙酮(色譜純,上?；瘜W(xué)試劑廠);硫酸鎂、乙酸鈉(分析純,天津富?；S);0.22 μm微孔有機(jī)濾膜(上海安譜實(shí)驗(yàn)股份科技有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18粉末(ODS)(天津博納艾杰爾公司);多壁碳納米管(MWCNTs)(中國(guó)科學(xué)院成都有機(jī)化學(xué)有限公司),所有用水均為去離子水。

1.2 GC-ECD儀器檢測(cè)條件

氣相色譜儀配有電子捕獲檢測(cè)器(ECD);色譜柱：HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm);載氣：氮?dú)?純度≥99.999%);柱流速1.0 mL·min-1;柱溫：45 ℃保持2 min,以6 ℃·min-1升溫至270 ℃,保持8 min;進(jìn)樣口溫度：190 ℃;檢測(cè)器溫度：320 ℃;進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣量：1 μL。

1.3 百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制

稱取百菌清農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg于100 mL容量瓶中,用正己烷稀釋,配制成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,將其放置在低溫(0～4 ℃)環(huán)境中儲(chǔ)存。

1.4 樣品前處理

稱取果菜樣品10.00 g于50 mL離心管中,加入10 mL 1%乙酸-乙腈混合溶液,漩渦1 min使其充分混勻,加入陶瓷均質(zhì)子,加入5 g硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉,劇烈振搖后,漩渦1 min使其混合均勻,4 200 r·min-1離心分離5 min,使有機(jī)相與水相分層。移取6 mL上層清液至裝有吸附材料(硫酸鎂900 mg,PSA 150 mg,MWCNTs 15 mg)的15 mL離心管中,充分漩渦使其混合均勻,4 200 r·min-1離心分離5 min。準(zhǔn)確吸取2 mL上清液移入15 mL濃縮瓶中,在40 ℃水浴中氮?dú)鈼l件下吹至近干,以丙酮∶正己烷(1∶1)混合溶液復(fù)溶定容至1 mL,使用有機(jī)系濾膜(0.22 μm)過(guò)濾,使用GC-ECD分析測(cè)定。

1.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確吸取1.3中制備的百菌清標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.00 mL(精確到0.01 mL)于10 mL容量瓶中,用正己烷定容,配制成100 mg·L-1的溶液。移取1.00 mL 100 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液并于40 ℃水浴中氮吹至近干,使用不同的果蔬(番茄、黃瓜、芒果和奇異果)空白基質(zhì)溶液將其復(fù)溶,隨后使用空白基質(zhì)逐級(jí)稀釋配制成0.000 625、0.001 25、0.002 5、0.00 5、0.01和0.1 mg·L-1系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,在1.2中色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè),得到百菌清基質(zhì)色譜圖。以峰面積(A)為縱坐標(biāo)、百菌清濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,并擬合得到線性方程及線性相關(guān)系數(shù)?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.6 添加回收實(shí)驗(yàn)

在稱量好的空白果蔬樣品(芒果)中添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,使添加水平分別為0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每個(gè)濃度水平重復(fù)6次,同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照,計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation,RSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

根據(jù)待測(cè)物百菌清農(nóng)藥在有機(jī)試劑的溶解性,對(duì)比提取溶劑分為丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液時(shí)果蔬中百菌清的回收率,結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?百菌清農(nóng)藥在1%乙酸-乙腈中的回收率均明顯高于在丙酮和乙腈中的回收率,在乙腈中加入少量的乙酸,使溶液變?yōu)樗嵝?更有利于提高百菌清的提取效率。因此,采用1%乙腈-冰乙酸溶液進(jìn)行提取。

圖1 百菌清農(nóng)藥在不同提取溶劑中的回收率Fig.1 Recovery rates of chlorothalonil pesticide in different extraction solvents

圖2 百菌清農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖Fig.2 Standard chromatogram of chlorothalonil pesticide

2.2 色素吸附劑的選擇及用量

在水果蔬菜檢驗(yàn)中,僅使用PSA和C18時(shí),會(huì)出現(xiàn)無(wú)法去除色素的問(wèn)題,造成雜質(zhì)峰過(guò)多,影響檢測(cè)精度,也易造成氣相色譜進(jìn)樣口和色譜柱的污染。常規(guī)QuEChERs前處理方法使用的色素吸附劑通常為石墨化炭黑(Graphitized carbon black,GCB),由于GCB表面的正六元環(huán)結(jié)構(gòu),使其對(duì)平面分子有極強(qiáng)的親和力,在吸附果蔬的色素和甾醇等雜質(zhì)的同時(shí),會(huì)吸附很多平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,而百菌清恰好為平面結(jié)構(gòu)。選擇了兩種色素吸附劑,三種用量,使用黃瓜基質(zhì),添加百菌清0.50 mg·kg-1,回收率結(jié)果如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了猜測(cè),具有平面結(jié)構(gòu)的百菌清不適宜使用GCB作為色素吸附劑。而MWCNTs作為除色劑,對(duì)平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥吸附較小,回收率比較穩(wěn)定,所以選擇MWCNTs作為色素吸附劑。隨著MWCNTs用量的增加,回收率呈小幅降低,故確定MWCNTs的最佳使用量為15 mg。

表1 兩種色素吸附劑回收率實(shí)驗(yàn)Table 1 Recovery rate experiments of two kinds of pigment adsorbent

2.3 線性范圍、檢出限和定量限結(jié)果分析

在農(nóng)藥殘留檢測(cè)過(guò)程中,由于果蔬樣品色素、有機(jī)酸、糖類的含量較多,會(huì)出現(xiàn)過(guò)多雜質(zhì)峰干擾檢測(cè)結(jié)果,同時(shí)易形成基質(zhì)效應(yīng)。為了減少雜質(zhì)峰及基質(zhì)效應(yīng)的影響,采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果分析。建立百菌清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸計(jì)算。信噪比為3時(shí),對(duì)應(yīng)樣品的質(zhì)量濃度為檢出限;信噪比為10時(shí),對(duì)應(yīng)樣品的質(zhì)量濃度為定量限。檢測(cè)結(jié)果如表1所示,實(shí)驗(yàn)表明,百菌清在果蔬樣品中,相關(guān)系數(shù)(R)為0.99以上,線性范圍為0.0006 3～0.1 mg·L-1;檢出限為0.000 63 mg·kg-1,定量限為0.001 9 mg·kg-1。符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的限量要求[21]。

2.4 與其他儀器檢測(cè)方法對(duì)比

將本文結(jié)果與文獻(xiàn)中不同儀器檢測(cè)果蔬中百菌清殘留量的定量限與檢出限對(duì)比,如表2所示。本文方法測(cè)得的最低檢出限與定量限分別為0.000 63和0.00 19 mg·kg-1,明顯低于其他儀器檢測(cè)方法,具有更低的檢出限與更高的靈敏度。

表2 不同果蔬樣品中百菌清的線性方程、相關(guān)系數(shù)、定量限和檢出限Table 2 Linear relationship,correlation coefficient,quantification limit and detection limit of chlorothalonil in different fruit and vegetable samples

2.5 回收率與RSD結(jié)果分析

對(duì)不同果蔬樣品進(jìn)行添加回和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差實(shí)驗(yàn)研究。進(jìn)行低、中、高三個(gè)不同濃度添加水平回收試驗(yàn),加標(biāo)水平分別為0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每個(gè)水平做6個(gè)平行樣品測(cè)定,在不同基質(zhì)中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液后充分混勻,使百菌清與果蔬樣品充分接觸,依照1.2實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)分析,檢測(cè)結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明,百菌清樣品回收率為93%～105%,RSD為1.7%～5.8%,均符合農(nóng)藥殘留分析檢測(cè)要求[24]。

表3 不同儀器檢測(cè)果蔬中百菌清的檢出限與定量限的對(duì)比Table 3 Comparison of detection limit and quantification limit of chlorothalonil in fruits and vegetables by different instruments

表4 百菌清的添加回收率、RSD及重復(fù)性(n=6)Table 4 Recovery rate,RSD and repeatability of chlorothalonil (n=6)

運(yùn)用本文建立的方法對(duì)市售果蔬共307個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)監(jiān)控,按1.4方法進(jìn)行樣品前處理,按照1.2儀器條件進(jìn)行測(cè)試分析,結(jié)果顯示,所有果蔬中百菌清農(nóng)藥殘留均低于檢出限。

3 結(jié) 論

建立了測(cè)定常見果蔬中百菌清殘留量的QuEChERs-GC-ECD快速檢測(cè)方法。采用1%乙酸乙腈提取,15 mg多壁碳納米管作為色素吸附劑,使用GC-ECD進(jìn)行檢測(cè),具有檢測(cè)限低、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確率高和結(jié)果可靠的優(yōu)點(diǎn),其檢測(cè)成本低,檢測(cè)時(shí)間短,滿足大批量快速檢測(cè)的要求,具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)也為果蔬中其他農(nóng)藥殘留檢測(cè)提供可借鑒的方法。