吳守燕

福建省邵武市婦幼保健院檢驗(yàn)科 354000

陰道微生態(tài)是由陰道解剖結(jié)構(gòu)及局部免疫系統(tǒng)、陰道微生物、宿主內(nèi)分泌系統(tǒng)共同組成的動(dòng)態(tài)平衡系統(tǒng)。健康狀態(tài)下,微生態(tài)系統(tǒng)處于平衡狀態(tài)能夠抵御病原菌感染,確保生殖道的健康,若優(yōu)勢(shì)菌定植率下降、大量病原菌繁殖則會(huì)導(dǎo)致陰道微生態(tài)失衡,很容易誘發(fā)宮頸病理性改變[1]。近年來(lái),大量的研究證實(shí)陰道微生態(tài)菌群與宮頸炎、宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)[2-3]。有報(bào)道表明宮頸上皮內(nèi)病變(CIN)、宮頸癌(CC)的發(fā)生也與機(jī)體免疫系統(tǒng)有關(guān),以T淋巴細(xì)胞亞群為主的免疫細(xì)胞在抗腫瘤中發(fā)揮巨大的作用[4]。目前宮頸疾病陰道微生態(tài)及細(xì)胞免疫等相關(guān)研究較多,但兩者在宮頸疾病中的關(guān)聯(lián)性研究較少?；诖?本研究旨在分析宮頸疾病患者陰道微生態(tài)失衡對(duì)免疫功能的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年3月—2021年3月收治的宮頸疾病患者89例作為觀察對(duì)象,依據(jù)pH試紙及陰道分泌物涂片檢查結(jié)果分為兩組:陰道微生態(tài)正常組(正常組)43例,年齡25～73歲,平均年齡(45.7±6.5)歲;體質(zhì)指數(shù)(BMI)18.4～26.4kg/m2,平均BMI(23.7±2.8)kg/m2;疾病類型:宮頸炎30例、CIN 9例、CC 4例。陰道微生態(tài)失衡組(失衡組)46例,年齡29～76歲,平均年齡(46.8±6.0)歲;BMI 18.4～26.4kg/m2,平均BMI(23.7±2.8)kg/m2;疾病類型:宮頸炎28例、CIN 13例、CC 5例。兩組患者基本資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診,臨床資料完整;(2)對(duì)試驗(yàn)知情且自愿參與患者;(3)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并腫瘤,且近期行放療、化療及免疫治療患者;(2)合并免疫系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾病患者;(3)宮頸手術(shù)史或子宮切除患者;(4)妊娠期、哺乳期女性;(5)檢查前3d內(nèi)陰道沖洗或性生活者。

1.3 方法

1.3.1 陰道微生態(tài)平衡判斷:用窺陰鏡充分暴露受檢者的陰道、宮頸組織,采用長(zhǎng)棉簽刮取陰道側(cè)壁1/3處分泌物。使用陰道微生態(tài)聯(lián)合測(cè)定試劑盒測(cè)定過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide,H2O2)、白細(xì)胞酯酶(Leukocyteesterase,LE)及唾液酸苷酶(Neuraminidase,NRH)活性3種指標(biāo)。陰道微生態(tài)環(huán)境判斷標(biāo)準(zhǔn):H2O2<2mmol/L(呈藍(lán)色)為陽(yáng)性,LE呈綠色或藍(lán)色即陽(yáng)性、NRH呈紫色或紅色即為陽(yáng)性,該3項(xiàng)均為陽(yáng)性診斷為陰道微生態(tài)正常,任一項(xiàng)為陰性即表示陰道微生態(tài)失衡[5]。

1.3.2 陰道分泌物微生物檢查:用窺陰鏡充分暴露受檢者的陰道、宮頸組織,采用醫(yī)用長(zhǎng)棉簽刮取。(1)用高倍鏡10個(gè)視野下計(jì)數(shù)滴蟲,有活動(dòng)的滴蟲即為陰道毛滴蟲感染。(2)將分泌物標(biāo)本置于無(wú)雙抗培養(yǎng)基中7d,取無(wú)菌容器上層清液500μl,制作PCR模板檢測(cè)評(píng)估支原體感染情況。(3)在分泌物標(biāo)本中滴加反應(yīng)液檢測(cè)衣原體感染狀況。(4)將分泌物標(biāo)本懸浮于涂于載玻片上,假絲酵母菌經(jīng)石炭酸復(fù)紅染色(陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn):呈紅色,顯微鏡油視鏡可觀察菌絲及芽生孢子)、淋菌行革蘭染色(陽(yáng)性:呈紅色且顏色較深)、霉菌行石炭酸棉藍(lán)染色(霉菌細(xì)胞、菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)均為亮藍(lán)色,顯微鏡可觀察菌絲和芽生孢子);10個(gè)高倍視野下計(jì)數(shù)乳酸桿菌數(shù)量并計(jì)算其定植密度。(5)使用人乳頭瘤病毒(HPV)特定檢測(cè)試劑盒檢測(cè),即用檢測(cè)和中的取樣刷自行取樣,再將刷頭涂抹至自測(cè)卡(卡片變色即取樣成功),報(bào)告送至檢測(cè)中心?；蚴褂脤?shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)是否出現(xiàn)HPV感染。

1.3.3 免疫細(xì)胞檢測(cè):分別于空腹?fàn)顟B(tài)采集周靜脈血液5ml,分別放置于2個(gè)依地酸(EDTA)抗凝管中,將抗凝管上下顛倒5次左右混勻備用。一管3 000r/min離心10min,取上層血清置于-20℃冰箱中待檢,使用ELISA法測(cè)定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)及免疫球蛋白M(IgM)水平。采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離有核細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀(Attune NxT)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+水平,計(jì)算CD4+/CD8+。

1.4 觀察指標(biāo) (1)陰道分泌物病原菌檢出情況。記錄兩組患者陰道毛滴蟲、支原體、衣原體、假絲酵母菌、淋菌、霉菌及HPV等檢出情況。(2)優(yōu)勢(shì)菌及乳酸桿菌定植密度對(duì)比。即顯微鏡下陰道分泌物菌群中生物量/定植密度最大的細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)菌;比較兩組患者分泌物中乳酸桿菌定植密度情況。陰道分泌物涂片革蘭染色后使用顯微鏡油視鏡觀察(×100),選取20個(gè)高倍視野乳酸桿菌數(shù)量,計(jì)算每個(gè)高倍視野乳酸桿菌數(shù)量即為乳酸桿菌定植密度。(3)免疫功能指標(biāo)。對(duì)比兩組患者體液免疫及細(xì)胞免疫指標(biāo)的差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者陰道分泌物微生物檢出率比較 失衡組患者的陰道毛滴蟲、支原體、衣原體、霉菌以及HPV感染檢出率均顯著高于正常組,數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者陰道分泌物微生物檢出率比較[n(%)]

2.2 兩組患者陰道微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌及乳酸桿菌定植密度比較 正常組優(yōu)勢(shì)菌中乳酸桿菌占比顯著高于失衡組,且乳酸桿菌定植密度顯著高于失衡組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者陰道分泌物優(yōu)勢(shì)菌及乳酸桿菌定植密度比較

2.3 兩組患者免疫功能指標(biāo)比較 失衡組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+及IgA、IgG、IgM水平均顯著低于正常組(P<0.05),CD8+則高于正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者免疫細(xì)胞表達(dá)水平比較

3 討論

女性陰道內(nèi)聚集大量的微生物,健康狀態(tài)下陰道微環(huán)境中的乳酸桿菌等為優(yōu)勢(shì)菌,其通過(guò)分泌H2O2、乳酸和細(xì)菌素等物質(zhì)來(lái)殺滅致病菌,維持酸性環(huán)境和微環(huán)境平衡。若陰道內(nèi)菌群多樣性減少或增加,酸性環(huán)境發(fā)生改變(pH>4.5),則致病菌成為優(yōu)勢(shì)菌,微生態(tài)失衡便會(huì)引發(fā)生生殖道感染性疾病、宮頸疾病等;此外,宮頸疾病也會(huì)加劇陰道微生態(tài)紊亂以形成惡性循環(huán),嚴(yán)重威脅女性的身體健康[6]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)、流行病學(xué)等研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)陰道微生態(tài)環(huán)境改變不僅在生殖道感染性疾病起到非常重要作用,還會(huì)影響宮頸疾病、宮頸癌發(fā)生和進(jìn)展。目前研究發(fā)現(xiàn),HPV感染后陰道局部免疫改變?cè)诨颊卟∏闅w轉(zhuǎn)起著重要的作用,HPV病毒感染是宮頸癌前病變、宮頸癌發(fā)生及進(jìn)展的重要因素[7-8];另外,腫瘤的發(fā)生也與機(jī)體免疫功能降低密切相關(guān)。T淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免疫反應(yīng)的參與者是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、維持免疫平衡的關(guān)鍵;自然殺傷細(xì)胞能夠殺滅病灶細(xì)胞起到治療的目的[9]。雖然陰道微生態(tài)及免疫功能均是誘發(fā)宮頸病變的重要因素,本研究就該兩者間的關(guān)系進(jìn)行分析,以期能夠在宮頸病變預(yù)防治療中提供理論參考。

本文結(jié)果顯示,失衡組患者陰道毛滴蟲、衣原體、支原體、HPV感染及霉菌檢出率均顯著高于正常組,且失衡組乳酸桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的占比、乳酸桿菌定植密度均低于正常組(P<0.05)。李慧等[10]的研究發(fā)現(xiàn),慢性宮頸炎患者陰道分泌物中衣原體、支原體、滴蟲、細(xì)菌性陰道病(BV)等檢出率顯著高于正常宮頸婦女,而宮頸癌組陰道分泌物中上述微生物檢出率高于宮頸炎和正常宮頸組,而乳酸桿菌定植密度則低于其他兩組,與本研究結(jié)果相符合。李小雪等[11]的研究表明,陰道微環(huán)境紊亂、HPV感染均能夠增加宮頸病變的患病風(fēng)險(xiǎn),且在中重度CIN的發(fā)生和進(jìn)展中存在協(xié)同作用。Kovachev等[12]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)32名宮頸癌患者陰道微生態(tài)紊亂占比為71.9%。陰道微生態(tài)菌群的主要特點(diǎn)是多樣性,通過(guò)對(duì)健康女性陰道細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序發(fā)現(xiàn),陰道微生物群至少有5種主要類型,其中4種是乳酸桿菌為主要的菌群定植。乳酸桿菌與宿主細(xì)胞受體之間有著高度親和作用,因此能夠組織致病菌與宿主細(xì)胞受體相結(jié)合,從而降低病原菌感染的風(fēng)險(xiǎn)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),失衡組乳酸桿菌占比明顯低于正常組,且乳酸桿菌定植密度也低于正常組。進(jìn)一步說(shuō)明陰道微生物乳酸桿菌失去主導(dǎo)地位,乳酸桿菌定植量急劇下降,產(chǎn)生的H2O2減少、pH值升高,微環(huán)境失調(diào)屏障作用消失,無(wú)法及時(shí)清除滴蟲、支原體等致病微生物,從而引發(fā)病變。

T淋巴細(xì)胞亞群是細(xì)胞免疫功能中最重要的細(xì)胞群,Ig則是體液免疫功能中的蛋白家族,在機(jī)體免疫功能下降時(shí)則表現(xiàn)為免疫細(xì)胞和免疫球蛋白水平下降。本文失衡組患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+以及IgA、IgG、IgM免疫球蛋白水平均低于正常組,說(shuō)明陰道微生態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致宮頸疾病患者細(xì)胞免疫和體液免疫受到不同程度的損傷。分析原因可能是宮頸疾病患者因?yàn)榈蜗x、支原體、HPV成為優(yōu)勢(shì)菌后會(huì)大量消耗抗原、抗體,在患者局部免疫功能無(wú)法清除致病菌時(shí)病原菌便會(huì)與宿主細(xì)胞合成E6、E7等蛋白,從而躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視,而隨著病情的進(jìn)展微環(huán)境更趨于紊亂,機(jī)體免疫力會(huì)持續(xù)下降。

綜上所述,宮頸疾病患者陰道微生態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致乳酸桿菌的優(yōu)勢(shì)菌占比降低,并減少其定植密度,還會(huì)降低機(jī)體細(xì)胞免疫、體液免疫功能。本研究有兩點(diǎn)不足:(1)未能對(duì)陰道微生態(tài)失衡患者的程度再分幾個(gè)亞組進(jìn)行研究;(2)沒有將乳酸桿菌定植密度與免疫功能指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,希望在之后的研究中開展多中心研究,以獲得更為準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。