黃紫艷 劉 揚(yáng) 溫歡歡 吳輝淵

1 江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江西省南昌市 330000; 2 贛州市腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科; 3 江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科

世衛(wèi)組織[1]預(yù)測(cè)2030年會(huì)有100多萬(wàn)患者病死于肝癌。肝癌在中醫(yī)病屬“積聚”“黃疸”“鼓脹”[2]。肝藏血主疏泄,疏泄失司則氣行不暢,氣機(jī)不利則血水瘀滯,氣血失調(diào)則陰陽(yáng)失和,正氣虧虛,邪毒熾盛,久而成積,發(fā)為肝癌。肝癌治療中放化療雖療效快但復(fù)發(fā)率高,對(duì)人體有損害。然而祖國(guó)醫(yī)學(xué)在扶正祛邪上有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),驅(qū)邪不傷正,正盛則邪退。《仁齋直指方》記載用斑蝥治肝癌,功效為攻毒蝕瘡、驅(qū)散瘀結(jié),其活性成分斑蝥素毒性低,對(duì)骨髓抑制低[3],能升高白細(xì)胞。目前大多數(shù)化療藥僅有2%～5%的療效被腫瘤吸收[3],利用率不高,警示我們肝癌靶向給藥的重要性。

1 材料與方法

1.1 篩選靶點(diǎn) ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Norcantharidin”,獲取Mol2格式化學(xué)結(jié)構(gòu)式,導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)下載csv格式文件得到Uniprot ID。Pubchem 網(wǎng)站下載3D 化合物結(jié)構(gòu),獲得Canonical SMILES:C1CC2C3C(C1O2)C(=O)OC3=O將其輸入到SwissTargetPrediction。在Drugbank、OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲取肝癌靶點(diǎn),在GeneCards獲得的靶點(diǎn)中選取相關(guān)度Score≥23.639的靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn),最終合并去重。

1.2 構(gòu)建NCTD-HCC靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖探究彼此之間的作用關(guān)系。將交集靶點(diǎn)傳輸?shù)絊TRING中,種屬為“智人”,置信度為0.40,下載TSV格式的靶點(diǎn)文件上傳到CytoScape 3.7.1 軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用插件MCODE獲取潛在蛋白質(zhì)功能模塊,進(jìn)行功能分析。

1.3 通路富集分析 將交集基因?qū)隓avid進(jìn)行GO和KEGG分析,GO分析包括分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成,闡釋核心靶點(diǎn)的抗肝癌生物進(jìn)程;KEGG分析探究核心靶點(diǎn)的抗肝癌信號(hào)通路。將得到的核心靶點(diǎn)在CytoScape3.7.1中創(chuàng)建“成分—靶點(diǎn)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 基因生存曲線分析 通過(guò)Kaplan Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)Logrank檢驗(yàn)分析基因在肝癌的生存信息。

2 結(jié)果

2.1 NCTD治療HCC的靶點(diǎn)結(jié)果 PharmMapper得到299個(gè)NCTD靶點(diǎn),Uniprot轉(zhuǎn)化并去重后為288個(gè)。經(jīng)SwissTargetPrediction分析可知靶點(diǎn)中最多的是磷酸酶(40%),其次是激酶(13.3%)、 G蛋白偶聯(lián)受體家族(13.3%)。在Drugbank得到43個(gè)肝癌靶點(diǎn),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)去重合并獲得509個(gè),GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到16 983個(gè)靶點(diǎn),選取相關(guān)度Score≥23.639的靶點(diǎn)作為潛在靶點(diǎn),合并去重篩出1 433個(gè)。將靶點(diǎn)上傳到韋恩圖在線繪制網(wǎng)站繪制韋恩圖得到101個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2 構(gòu)建成分—靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)和分析PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果 101個(gè)候選靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示101個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 203條邊,度值越大節(jié)點(diǎn)越大,評(píng)分越高節(jié)點(diǎn)之間的緊密度越強(qiáng)連線越粗,ALB、AKT1、EGFR、HRAS、SRC、ESR1、CASP3、HSP90AA1、IGF1、MMP9、MAPK1度值排名靠前。ALB、AKT1、EGFR、SRC、HRAS、ESR1、IGF1、HSP90AA1交互關(guān)系最多(見(jiàn)圖1)。運(yùn)用CytoScape 3.7.1的MCODE插件進(jìn)行蛋白質(zhì)交互分析,提取出五個(gè)網(wǎng)絡(luò),IGF1、SRC、HRAS、HSP90AA1、ESR1、EGFR、MAPK14、ALB、AKT1、PPARG、MAPK1的MCODE_Score排前列(見(jiàn)圖2)。

圖1 NCTD-肝癌靶點(diǎn)PPI圖

圖2 NCTD-肝癌靶點(diǎn)PPI圖中的Module

2.3 通路富集分析 David分析101個(gè)候選靶點(diǎn)。GO分析顯示共798個(gè),包括細(xì)胞組成58個(gè),分子功能103個(gè),生物過(guò)程493個(gè),KEGG富集共144條通路。生物過(guò)程主要有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正負(fù)調(diào)控、凋亡負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化和自磷酸化、細(xì)胞增殖正調(diào)控、DNA模板轉(zhuǎn)錄正調(diào)控(見(jiàn)圖3)。

圖3 NCTD治療肝癌靶點(diǎn)富集分析

取通路前8名和通路上相關(guān)基因,利用CytoScape 3.7.1創(chuàng)建“NCTD、肝癌—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖4)。由69個(gè)節(jié)點(diǎn)207條邊構(gòu)成,連線表示互作關(guān)系。經(jīng)Network analyze功能分析后得出EGFR、AKT1、MAPK1、HRAS、MAP2K1、GRB2、PIK3R1、IGF1R、IGF1為重要靶點(diǎn),與NCTD-HCC靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖結(jié)果大多吻合。每個(gè)靶點(diǎn)聯(lián)通多個(gè)通路,利用多靶點(diǎn)多通路防治肝癌,多集中于癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、癌中蛋白聚糖、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、前列腺癌、化學(xué)致癌受體激活、肝細(xì)胞癌通路(見(jiàn)圖3)。

圖4 “NCTD、肝癌—靶標(biāo)—通路”網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 基因的生存分析 綜合前面結(jié)果得出IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1為核心基因,利用Kaplan-Meier Plotter繪制基因生存曲線,經(jīng)Logrank檢驗(yàn)IGF1、HRAS、EGFR的P值<0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

《中藏經(jīng)》云 :“積聚、癥瘕、雜蟲(chóng)者,皆五臟六腑……交合而成也。”為本虛標(biāo)實(shí),邪實(shí)大多與瘀毒相關(guān)。周仲瑛教授[4]秉持濕熱瘀毒是肝癌的主要病機(jī),故應(yīng)清熱利濕、祛瘀消癥解毒,緊抓瘀血。斑蝥為干燥昆蟲(chóng)體,其破血消癥之力對(duì)肝癌有確切療效,藥理學(xué)亦證明其活性成分、衍生物能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡、遏制擴(kuò)散,增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性[5]。斑蝥雖不能抑制HepG2細(xì)胞移植瘤[6]的生長(zhǎng),但能明顯延緩腫瘤生長(zhǎng)且毒性小。

3.1 靶蛋白分析 NCTD靶蛋白中以磷酸酶和激酶類(lèi)居多,兩者屬于反向作用,說(shuō)明激活和失活對(duì)于信號(hào)傳導(dǎo)、蛋白調(diào)控都有重要意義。G蛋白偶聯(lián)受體也占前位在腫瘤中起關(guān)鍵作用[7]。經(jīng)一系列分析最終可得NCTD中IGF1、HRAS、EGFR、AKT1在肝癌中發(fā)揮重要作用。

IGF1是人體內(nèi)分泌激素,是IGF信號(hào)的一種,它通過(guò)與相應(yīng)的特異受體結(jié)合,參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡,影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[8],其水平高低與肝臟合成功能密切相關(guān)。Lacin Sahin等人[9]研究表明肝硬化和晚期肝癌患者的血清IGF-1濃度會(huì)下降。并且能通過(guò)介導(dǎo)PI3K/Akt信號(hào)通路加快腫瘤細(xì)胞增殖[10]。本次研究也證明了IGF1是NCTD治療肝癌的直接靶點(diǎn)。AKT1是蘇氨酸蛋白激酶之一,它從生長(zhǎng)、存活、增殖、代謝到凋亡一直貫穿腫瘤細(xì)胞的全過(guò)程。錢(qián)宏梁等人[11]經(jīng)小鼠實(shí)驗(yàn)得出真武湯通過(guò)降低AKT磷酸化蛋白表達(dá)和PI3K-AKT-mTOR通路遏制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。AKT作為PI3K途徑的中介,是形成腫瘤機(jī)制中常見(jiàn)的信號(hào)通路。本次去甲斑蝥素治療肝癌得出的關(guān)鍵通路中就有PI3K-Akt信號(hào)通路,更加凸顯了本次研究的價(jià)值性。Cancer Discovery[12]有報(bào)告得出:AKT1和AKT2的缺失會(huì)加快肝癌演變進(jìn)程。HRAS屬于原癌基因RAS的一種,它可以激活PI3K-Akt通路,促進(jìn)癌變。產(chǎn)生癌變[13]的關(guān)鍵原因是因?yàn)镠RAS、KRAS和NRAS的突變導(dǎo)致RAS信號(hào)被激活。本次研究得出的關(guān)鍵基因中IGF1也可以激活PI3K-Akt通路,關(guān)鍵通路也有PI3K-Akt信號(hào)通路,更加證明他們產(chǎn)生的協(xié)同作用加速肝癌的演變進(jìn)程。EGFR在肝癌中呈高表達(dá),可與AR協(xié)同作用于肝癌,而NCTD靶點(diǎn)中同時(shí)也含有AR,故此也是筆者認(rèn)為NCTD對(duì)肝癌具有開(kāi)發(fā)和研究?jī)r(jià)值的原因之一,EGFR傳遞信號(hào)的重要蛋白,能使VEGF表達(dá)上調(diào)[14],加快細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移。故在研制制劑和臨床治療中需要抑制肝癌患者的EGFR表達(dá)。MAPK是細(xì)胞傳導(dǎo)的重要傳遞者,能使其他大量蛋白質(zhì)磷酸化,加快蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)。其中MAPK8可將關(guān)鍵因子磷酸化細(xì)胞凋亡。DELIRE[15]發(fā)現(xiàn)MAPK在肝癌患者中異?；钴S。多項(xiàng)研究也表明阻斷MAPK可遏制肝癌HepG2細(xì)胞、SMMC-7721的增殖和侵襲[16]。

3.2 生物富集分析 GO生物進(jìn)程集中于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄正負(fù)調(diào)控、凋亡負(fù)調(diào)控、蛋白磷酸化和自磷酸化、細(xì)胞增殖正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄正調(diào)控。各種靶點(diǎn)、通路的連接離不開(kāi)信號(hào)傳導(dǎo)和相關(guān)功能調(diào)控。NCTD的靶點(diǎn)大多為激酶和磷酸酶類(lèi),它們可將其他蛋白質(zhì)磷酸化,從而擾亂肝癌細(xì)胞的生物膜功能,遏制其生長(zhǎng)。癌癥通路最有顯著意義,它涉及很多相關(guān)基因和調(diào)控機(jī)制,EGFR、IGF1、MAP2K1等都會(huì)作用于此通路上。NCTD可用于多種腫瘤,臨床常用于胃癌、乳腺癌等的治療,但也具有保護(hù)肝細(xì)胞的功能[17]。生存曲線分析IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1的P值分別為0.001 3、0.057、0.019、0.008 5、0.37,故IGF1、HRAS、EGFR是影響肝癌患者生存預(yù)后的重要因素。AKT1的P值為0.057,尚不能認(rèn)為其對(duì)肝癌患者的預(yù)后具有直接相關(guān)性,但因?yàn)榉浅＝咏?.05故認(rèn)為也有可能是數(shù)據(jù)庫(kù)納入的數(shù)據(jù)量大小導(dǎo)致。PI3K-Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路都恰好有能激活本次得出的關(guān)鍵基因,并且這些通路經(jīng)上述分析證明與肝癌密切相關(guān),在癌癥通路中也會(huì)彼此相互連接影響,共同參與肝癌的演變過(guò)程。

本次利用反向分子對(duì)接、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的技術(shù)手段,認(rèn)為NCTD主要通過(guò)蛋白磷酸化和IGF1、AKT1、HRAS、EGFR、MAPK1,主要作用于腫瘤通路,激發(fā)啟動(dòng)因子干預(yù)肝癌。本次研究進(jìn)一步驗(yàn)證和豐富了NCTD治療肝癌的分子生物機(jī)制,為肝癌靶向治療提供思路,促進(jìn)研制去甲斑蝥素相關(guān)靶向制劑,相對(duì)性減少使用放化療對(duì)患者造成的傷害。但因依據(jù)不同數(shù)據(jù)庫(kù)和平臺(tái),故存在數(shù)據(jù)庫(kù)更新問(wèn)題和數(shù)據(jù)差異,有一定的偏倚。