陳 乾 付 琦 王天明 李曉麗 陳全鑫 吳志航 潘海邦

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅省蘭州市 730000

胃癌是世界上最常見的胃腸道惡性腫瘤之一,其死亡率和發(fā)病率均居惡性腫瘤的前五位[1-2]。近年來,胃癌的診療水平已有了很大的提高,但因其起病較隱匿,早期無癥狀或癥狀不明顯,早期易漏診,多數(shù)患者診斷時(shí)已是臨床晚期或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌診斷有一定指導(dǎo)意義,但靈敏度及特異度均不佳,因此尋找特異性強(qiáng)和靈敏性較高的生物標(biāo)志物用于胃癌早期診斷、指導(dǎo)治療和判斷預(yù)后顯得尤為重要。

Ⅰ型膠原蛋白是膠原蛋白家族中的一個(gè)重要成員,其中Ⅰ型膠原α2鏈(COL1A2)被認(rèn)為影響腫瘤的侵襲和進(jìn)展,是細(xì)胞外間質(zhì)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分。COL1A2具有多種生物學(xué)功能,近年來發(fā)現(xiàn)可在肺癌、胰腺癌等多種組織呈高表達(dá)狀態(tài),并且可以允許癌細(xì)胞侵襲和遷移[4-5]。但關(guān)于COL1A2在胃癌中的研究相對(duì)較少,因此,本研究通過生物信息學(xué)分析,探討COL1A2在胃癌組織中的表達(dá)水平及其與免疫細(xì)胞浸潤的關(guān)系,為胃癌的臨床診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 資料來源 COL1A2的數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)。TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)是用于系統(tǒng)分析各種癌癥類型的免疫浸潤的綜合數(shù)據(jù)庫。Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)收錄了肺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌的生存信息,可以用來評(píng)估基因?qū)颊呱媛实挠绊憽?/p>

1.2 COL1A2表達(dá)水平分析 通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析不同腫瘤與鄰近正常組織中COL1A2的基因表達(dá)。從TCGA數(shù)據(jù)庫下載胃癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)共407例,其中包含胃癌組織375例、正常胃組織32例。使用R軟件中的“l(fā)imma”包對(duì)胃癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和整理。

1.3 COL1A2預(yù)后的相關(guān)性分析 將COL1A2輸入Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫中,得到K-M生存曲線,比較COL1A2不同表達(dá)水平患者的總生存期(OS)、首次進(jìn)展生存期(FP) 和再次進(jìn)展生存期(PPS)?；赥CGA數(shù)據(jù)庫通過R軟件中“timeROC”“survival”“regplot”包繪制胃癌患者預(yù)后發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的列線圖模型,并作受試者工作特征曲線(ROC),計(jì)算曲線下面積(AUC),繪制校準(zhǔn)曲線檢驗(yàn)評(píng)估列線圖模型準(zhǔn)確度;采用單因素Cox回歸分析COL1A2在胃癌預(yù)后中的評(píng)估價(jià)值。

1.4 COL1A2單基因GSEA分析 根據(jù)TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中COL1A2表達(dá)量的中位值,將基因表達(dá)數(shù)據(jù)分為高、低表達(dá)組。應(yīng)用R軟件中“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”包對(duì)COL1A2進(jìn)行信號(hào)通路富集分析,以|NES|≥1.0、NOM p-val<0．05、FDR q-val<0．25為條件對(duì)COL1A2單基因富集結(jié)果進(jìn)行篩選。

1.5 免疫細(xì)胞浸潤分布特點(diǎn) 根據(jù)TCGA-STAD數(shù)據(jù)集,使用R軟件中的“CIBERSORT”包分析22種免疫細(xì)胞與胃癌中COL1A2的關(guān)系,并揭示免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)聯(lián)性,使用“vioplot”包進(jìn)行預(yù)后模型可視化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用R軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。應(yīng)用Wilcoxon檢驗(yàn)分析COL1A2在胃癌組織與正常組織之間的表達(dá)差異;應(yīng)用Kruskal檢驗(yàn)分析COL1A2表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性;應(yīng)Kaplan-Meier分析COL1A2高、低表達(dá)組之間生存率的差異;應(yīng)用單因素Cox回歸模型分析COL1A2在胃癌患者中的預(yù)后意義;使用Spearson函數(shù)分析COL1A2與免疫細(xì)胞浸潤之間的相關(guān)性,P<0．05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COL1A2在胃癌組織中的表達(dá)水平 通過TIMER數(shù)據(jù)庫分析COL1A2在不同腫瘤組織中的表達(dá),結(jié)果提示COL1A2在胃癌組織中表達(dá)顯著高于正常組織。TCGA-STAD數(shù)據(jù)集分析顯示胃癌組織中COL1A2的表達(dá)量高于正常組織(P<0.001,見圖1a);對(duì)TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中胃癌組織及相對(duì)應(yīng)正常組織的分析結(jié)果表明,COL1A2在胃癌組織中的表達(dá)高于配對(duì)正常組織(P<0.001,見圖1b)。

a b

腫瘤組織及相對(duì)應(yīng)正常組織中COL1A2的表達(dá);*P<0.001

2.2 COL1A2的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 TCGA-STAD數(shù)據(jù)集的分析結(jié)果表明。COL1A2基因表達(dá)與T分期、臨床分期和組織學(xué)分級(jí)具有相關(guān)性。COL1A2表達(dá)水平在T1與T2、T3、T4具有相關(guān)性,臨床分期Stage1和Stage2、Stage3具有相關(guān)性,組織學(xué)分級(jí)Grade2和Grade3具有相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05),見圖2。

圖2 COL1A2表達(dá)量與胃癌患者臨床病理特征相關(guān)性

2.3 COL1A2基因與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 運(yùn)用Kaplan-Meier plotter繪制COL1A2基因與胃癌患者預(yù)后的生存曲線(見圖3)。結(jié)果顯示COL1A2基因高表達(dá)與胃癌患者更短的總生存期(OS) (HR=1.58,95%CI:1.33～1.87,Log-rankP<0．001)、首次進(jìn)展生存期(FP) (HR=1.61,95%CI:1.31～1.97,Log-rankP<0．001)及再次進(jìn)展生存期(PPS) (HR=1.46,95%CI:11.15～1.85,Log-rankP=0.0017)顯著相關(guān)。

圖3 不同COL1A2基因表達(dá)水平胃癌患者的生存曲線

2.4 COL1A2表達(dá)水平列線圖的構(gòu)建和驗(yàn)證 根據(jù)

篩選的變量構(gòu)建了列線圖來評(píng)估胃癌患者的預(yù)后。將性別、年齡、T分期、M分期、N分期、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)7個(gè)獨(dú)立預(yù)后相關(guān)因素納入構(gòu)建列線圖,得到胃癌患者1、3、5年總生存率的列線圖?？偟梅质歉鶕?jù)使用列線圖模型計(jì)算的單個(gè)因素得分確定的;本研究中的大多數(shù)患者的總危險(xiǎn)得分為370～520。COL1A2表達(dá)水平預(yù)測胃癌1年不良預(yù)后的AUC為0.561;預(yù)測3年不良預(yù)后的AUC為0.577;預(yù)測5年不良預(yù)后的AUC為0.726,>0.7對(duì)于患者的預(yù)后評(píng)估有參考價(jià)值。列線圖的校準(zhǔn)曲線分析表明,該列線圖預(yù)測的1、3、5年總生存率與實(shí)際生存率之間具有良好的一致性,見圖4。

2.5 COL1A2與臨床特征單因素Cox回歸分析 單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,年齡(HR=1.026,P=0.004)、腫瘤分期(HR=1.534,P<0.001)和COL1A2(HR=1.172,P=0.016)可有效預(yù)測胃癌患者的生存,見表1。

表1 COL1A2與臨床特征單因素Cox回歸分析

2.6 COL1A2基因的GSEA富集分析 GSEA結(jié)果根據(jù)校正后的富集得分(NES)選擇了最顯著的信號(hào)通路(FDR<0.05,P<0.05)。篩選出COL1A2高表達(dá)樣本主要富集于軸突引導(dǎo)通路、細(xì)胞黏附分子通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、TGF-β信號(hào)通路。低表達(dá)樣本主要富集在嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,見表2。

表2 COL1A2功能富集分析

2.7 COL1A2表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤 以COL1A2表達(dá)的中位值,將375例腫瘤樣品分為高、低表達(dá)兩組,通過CIBESORT算法評(píng)估樣本中22種免疫細(xì)胞表達(dá)水平的差異(見圖5)。B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是受COL1A2影響的主要細(xì)胞,其中低表達(dá)組的幼稚B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、漿細(xì)胞增加(P<0.05),而M2巨噬細(xì)胞、活化的肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞減少(P<0.05)。M2巨噬細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、γδT細(xì)胞和中性粒細(xì)胞和COL1A2正相關(guān),幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞和COL1A2負(fù)相關(guān)。

圖5 22種免疫細(xì)胞在胃癌及正常組織中的表達(dá)差異

3 討論

胃癌的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,是多種危險(xiǎn)因素和保護(hù)因素相互作用的結(jié)果。胃癌的治療關(guān)鍵在于早期確診以便于患者進(jìn)行有效的治療,但大部分胃癌患者都在晚期被確診。因此,探索胃癌可能的致病機(jī)制以及尋找胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子標(biāo)志物對(duì)于胃癌的診斷和治療具有重要意義。

COL1A2是編碼Ⅰ型膠原α2鏈的重要基因。COL1A2具有多種生物學(xué)功能,異常表達(dá)的甲基化的COL1A2可以引起機(jī)體內(nèi)環(huán)境的改變,從而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展,研究人員發(fā)現(xiàn)COL1A2基因在大腸癌組織中高甲基化,其mRNA表達(dá)明顯降低,而COL1A2 mRNA在髓母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)[6]。COL1A2在膀胱癌、食管癌、肝癌、肺癌等多種惡性腫瘤中也明顯增加[7-9]。

在本研究中,通過TIMER數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)COL1A2在胃癌中的表達(dá)水平高于正常組織。進(jìn)一步分析顯示,COL1A2與T分期、臨床分期和組織學(xué)分級(jí)相關(guān),并且COL1A2高表達(dá)提示胃癌患者預(yù)后不良。此外,通過K-M分析發(fā)現(xiàn)COL1A2高表達(dá)與胃癌患者更短的總生存期、首次進(jìn)展生存期及再次進(jìn)展生存期顯著相關(guān)。本研究所建立的列線圖模型表明COL1A2能有效預(yù)測胃癌患者預(yù)后,基于該列線圖模型預(yù)測高?；颊呔哂幸欢ㄅR床價(jià)值。單因素Cox分析顯示,COL1A2可有效預(yù)測胃癌患者的生存。為深入研究COL1A2在胃癌發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能及分子調(diào)控機(jī)制,本文對(duì)COL1A2進(jìn)行GSEA富集分析,結(jié)果顯示COL1A2高表達(dá)樣本主要富集在軸突引導(dǎo)通路、細(xì)胞黏附分子通路、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、TGF-β信號(hào)通路。已有研究表明軸突引導(dǎo)通路在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中起重要作用,并在胰腺癌中起作用細(xì)胞黏附分子通路主要涉及黑色素瘤的傳播、與微環(huán)境的相互作用和轉(zhuǎn)移[10]。Bao等[11]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路可能參與乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展。Colak 等[12]強(qiáng)調(diào)TGF-β信號(hào)通路可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥。上述證據(jù)表面COL1A2可以通過這些過程和途徑對(duì)人體起作用,本研究結(jié)果有助于增進(jìn)對(duì)COL1A2生物學(xué)功能的理解。

本研究進(jìn)一步探索了COL1A2基因表達(dá)與胃癌免疫微環(huán)境的關(guān)系,結(jié)果顯示COL1A2基因與多種免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)在胃癌中,B細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞是受COL1A2表達(dá)影響的主要細(xì)胞。M2巨噬細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、γδT細(xì)胞和中性粒細(xì)胞和COL1A2正相關(guān),幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞和記憶性B細(xì)胞和COL1A2負(fù)相關(guān)。巨噬細(xì)胞是浸入腫瘤組織中主要的炎癥細(xì)胞,其釋放大量的炎癥介質(zhì),創(chuàng)造炎癥環(huán)境,促進(jìn)腫瘤生長并降低抗腫瘤免疫力。既往研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞浸潤與胃癌的預(yù)后不良相關(guān)[13]。本研究提示COL1A2可能通過影響這些免疫細(xì)胞的浸潤而調(diào)控胃癌的進(jìn)展,但這仍需要更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,COL1A2在胃癌組織中高表達(dá),可調(diào)節(jié)胃癌發(fā)展過程中的免疫浸潤細(xì)胞水平,并與胃癌的預(yù)后不良有關(guān)。因此,COL1A2可作為胃癌的獨(dú)立預(yù)后因子,并有望為胃癌診斷和治療策略提供一定價(jià)值。