張子龍 柏靜萍 潘賜明 楊 梅 魏寧頤

云南中醫(yī)藥大學(xué),云南省昆明市 650500

目前,云南春燥動(dòng)物模型研究方面取得了較大的成效。本課題組前期采用病因造模方法初步構(gòu)建了云南春燥小鼠動(dòng)物模型?；敬_定了病因造模條件(溫度、濕度、風(fēng)速、光照及飲食)以及評(píng)價(jià)指標(biāo)[1],但尚未對(duì)感燥時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)燥證發(fā)病的影響進(jìn)行證實(shí),本研究的目的是在前期研究基礎(chǔ)上采用不同造模周期下的小鼠模型進(jìn)行研究,以期探索感燥時(shí)間長(zhǎng)短與燥證發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 MUC5ac ELISA試劑盒(南京草本源);AQP5 ELISA試劑盒(南京草本源);Mouse IgG ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科);Mouse IgA ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科);生理鹽水(昆明南疆);75%乙醇消毒液(昆明倍健生物)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 酶標(biāo)儀Spectra Max(美國(guó)MD);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermofisher);-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermofisher);超凈工作臺(tái)(北京半導(dǎo)體設(shè)備);移液器(力辰邦西儀器);一次性使用手術(shù)單(衡水安幫醫(yī)療);一次性無(wú)菌注射器(江蘇治宇醫(yī)療);外科手術(shù)剪(湖南可孚醫(yī)療);止血鑷(湖南可孚醫(yī)療)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF雄性KM小鼠90只,體重為(20±2)g/只。由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;生產(chǎn)準(zhǔn)許證編號(hào):SYXK(滇)K2017-0005;飼養(yǎng)于云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) 小鼠氣道MUC5ac、AQP5及血清IgA、IgG。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組:小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,隨機(jī)分為正常組和模型組,在此基礎(chǔ)上再分別設(shè)置7d、14d、21d正常組及模型組共6組,每組15只。

1.5.2 各組小鼠飼喂及環(huán)境干預(yù)條件設(shè)置:各組小鼠在經(jīng)過(guò)適應(yīng)性飼喂后,置于動(dòng)物培養(yǎng)箱中。飼喂及環(huán)境干預(yù)條件設(shè)置如表1所示。

表1 各組小鼠飼喂及環(huán)境干預(yù)條件設(shè)置

1.5.3 小鼠血清樣本、BALF的采集:7d組小鼠在實(shí)驗(yàn)周期第7天20:00禁食禁水,于次日進(jìn)行取材,14d組、21d組分別在相應(yīng)周期的最后1d禁食禁水,于后1d取材;采用眼球摘除法取血:事先準(zhǔn)備離心管,固定于操作臺(tái)上,左手抓取小鼠,暴露其頭面部,手術(shù)剪剪掉胡須,酒精擦拭消毒,避免污染及溶血,食指沿小鼠背部向后向下捻動(dòng),使小鼠左側(cè)眼部皮膚伸展,左側(cè)眼球充血突出,使小鼠頭部向下,用彎頭鑷夾取眼球并摘除,血液垂直滴入離心管內(nèi),取血約1ml,將離心管于室溫(約25℃)下靜置2h,采集的全血做離心(3 000r/min、4℃、15min)處理,取上清液,采用ELISA法檢測(cè)小鼠IgA、IgG含量;取血后將小鼠固定于超凈臺(tái)上,使用滅菌手術(shù)剪及鑷子解剖小鼠頸部組織,使其氣管暴露完全,鈍性分離覆于氣管上的組織、血管;沿正中線上距喉頭約0.5cm下方處剪一小口,用安裝上8號(hào)灌胃針的無(wú)菌注射器平行插入氣管內(nèi)并固定,緩緩向肺內(nèi)推注37℃的生理鹽水1ml,回抽此液,該動(dòng)作重復(fù)2次即可[2];將取得的灌洗液離心(參數(shù):2 500r/min、4℃、20min),取上清液,采用ELISA方法檢測(cè)小鼠氣道黏蛋白MUC5ac、水通道蛋白AQP5。

2 結(jié)果

2.1 小鼠氣道MUC5ac、AQP5 7d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);14d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);21d組模型小鼠MUC5ac濃度降低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。7d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度升高,但差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);14d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);21d組模型小鼠水通道蛋白AQP5濃度降低,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠氣道MUC5ac、AQP-5濃度比較

2.2 小鼠血清IgA、IgG 與同周期組正常小鼠比較,7d組模型小鼠血清IgA濃度降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),血清IgG濃度升高,極具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01);14d組模型小鼠血清IgA濃度降低,極具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P<0.01),血清IgG濃度升高,極具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P<0.01);21d組模型小鼠血清IgA濃度升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);21d組模型小鼠血清IgG濃度升高,極具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),見表3。

表3 各組小鼠血清IgA、IgG濃度比較

3 討論

3.1 不同實(shí)驗(yàn)周期小鼠氣道黏蛋白MUC5ac、水通道蛋白AQP-5的變化 氣道黏蛋白MUC5ac在氣管、支氣管中分布較多,是由上皮細(xì)胞—杯狀細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種大分子糖蛋白[3],黏蛋白是黏液的主要成分[4],多項(xiàng)研究表明[5-7]MUC5AC分泌增加會(huì)導(dǎo)致氣道黏液高分泌,產(chǎn)生黏痰與氣道炎癥,反之則會(huì)導(dǎo)致氣道黏液分泌減少,使氣道出現(xiàn)干燥改變;而水通道蛋白AQP-5對(duì)于調(diào)節(jié)汗腺、眼睛、肺和腎臟中的水穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[8],作為氣道上水分子轉(zhuǎn)運(yùn)的主要通路,可以調(diào)整氣道內(nèi)的水液量,以維持氣道內(nèi)相對(duì)適宜的環(huán)境[9],AQP-5含量降低會(huì)導(dǎo)致肺阻力增加和氣道高反應(yīng)性[10],從而對(duì)氣管和肺組織產(chǎn)生損傷,同時(shí)減少氣道水液量,造成局部干燥表現(xiàn)。因此MUC5ac、AQP-5的含量降低程度與機(jī)體津液虧損密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在第7、14、21天MUC5ac、AQP-5含量較正常組均有降低,且均以14d組的變化最顯著,而21d組較14d組略有回升。二者含量于本實(shí)驗(yàn)中降低,說(shuō)明春燥環(huán)境下的小鼠體內(nèi)存在著津液損傷的病機(jī)。燥邪對(duì)小鼠氣道的損傷于14d最重。津液損耗加之氣道受邪,其黏膜的結(jié)構(gòu)、功能損傷,津液的生成與輸布失常,可見小鼠MUC5ac、AQP5濃度降低。實(shí)驗(yàn)中隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng),小鼠逐漸適應(yīng)云南春燥環(huán)境,體內(nèi)津液重新分布,燥證得到一定程度的緩解。與前期臨床研究得出的,初入云南比久居云南的人群感燥更加明顯的結(jié)果相符。

3.2 不同實(shí)驗(yàn)周期小鼠IgA、IgG的變化 IgA是血清中占比第二的免疫球蛋白,其中IgA又分為分泌型sIgA及血清型IgA,sIgA主要由呼吸道等黏膜細(xì)胞合成,IgA主要由腸系膜細(xì)胞合成,血清IgA具有某些與IgG相類似的免疫功能[11],可參與機(jī)體大部分特異性免疫,有研究表明,人血清IgA的升高與肺功能呈明顯相關(guān)性[12]。IgG是血漿中最豐富的抗體,是體液免疫反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白,通過(guò)其多重作用將先天免疫和適應(yīng)性免疫聯(lián)系起來(lái)[13],其主要存在于終末細(xì)支氣管以下的氣道內(nèi),是呼吸道體液免疫中的重要免疫球蛋白。IgG一部分由局部合成,一部分由血清滲出到呼吸道中,尤其當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入黏膜引起炎癥反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng)時(shí)可增加IgG由血清滲出,且相較于其他部位,IgG表現(xiàn)出對(duì)肺部感染的高活性[14],其在體內(nèi)的分布和參與免疫應(yīng)答的范圍廣,對(duì)判斷機(jī)體抗感染能力及感染后的免疫強(qiáng)度有著重要的參考價(jià)值。IgA、IgG在呼吸系統(tǒng)免疫防御方面發(fā)揮著重要的作用,與中醫(yī)的肺氣衛(wèi)外功能有著密切的相關(guān)性[15]。動(dòng)物模型氣道內(nèi)分泌型免疫球蛋白sIgA及免疫球蛋白IgG在呼吸系統(tǒng)疾病中與機(jī)體免疫防御功能的強(qiáng)弱存在相關(guān)性[16],一定程度上反映了云南春燥環(huán)境小鼠肺衛(wèi)外功能的變化[17]。即IgA、IgG濃度發(fā)生變化,說(shuō)明機(jī)體呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)對(duì)外環(huán)境產(chǎn)生了應(yīng)答,也相當(dāng)于中醫(yī)邪正相爭(zhēng),衛(wèi)氣抗邪活動(dòng)的表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組小鼠的IgA、IgG濃度均發(fā)生變化,說(shuō)明春燥環(huán)境中的小鼠感受了燥邪并作出防御反應(yīng)。與正常組相比,7d、14d組模型小鼠血清IgA濃度降低明顯,以14d組模型小鼠降低顯著,21d組小鼠血清IgA濃度略高于同周期正常組,但差別不大?？紤]初感春燥小鼠,正氣充足,肺衛(wèi)功能損傷較小,故機(jī)體能夠快速作出防御驅(qū)邪反應(yīng),小鼠血清IgA感應(yīng)春燥邪氣較為敏銳,以第14天最為明顯,隨著感燥時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)至21d,模型小鼠對(duì)于春燥環(huán)境有適應(yīng)性改變,故血清IgA濃度回升,略高于正常且趨近于正常;3組小鼠血清IgG濃度均明顯升高,以21d模型組小鼠血清IgG濃度升高最顯著,綜合小鼠MUC5ac、AQP5含量降低的狀況進(jìn)行分析,筆者認(rèn)為,小鼠在云南春燥環(huán)境下,感受了燥邪,肺系以氣道與外界自然直接連接,燥邪從氣道入而傷肺,肺衛(wèi)作為防御機(jī)體受邪的第一道防線,外燥從外入里侵襲必首先與肺衛(wèi)相爭(zhēng)。小鼠則見燥傷津液與衛(wèi)氣失宣,衛(wèi)外失職共見之表現(xiàn)。這與中醫(yī)“燥勝則干”“燥邪犯?jìng)?首先犯肺”的病因病機(jī)理論相契合。

總之,不同周期模型小鼠在MUC5ac、AQP5、IgG、IgA均出現(xiàn)了改變,且以14d尤為顯著,故說(shuō)明14d周期可以作為云南春燥小鼠動(dòng)物模型最佳造模周期予以進(jìn)一步研究。