姜 鳴，劉思佳，岳 杰，劉 霞，白占濤

（1.延安大學 生命科學學院；2.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心；3.延安市多肽資源藥物工程技術(shù)研究中心；4.延安市神經(jīng)腫瘤免疫與干細胞重點實驗室，陜西 延安 716000）

電壓門控鉀通道（voltage-gated potassium channel，Kv）Kv7 家族也被稱為KCNQ 鉀通道，是一種介導M電流外向整流的電壓門控型鉀離子通道，在人體生理過程中起關(guān)鍵作用，包括心臟動作電位，鉀穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)元興奮性等［1-2］。KCNQ通道包含5個α亞基（Kv7.1-Kv7.5），由KCNQ1至KCNQ5基因編碼，這些α亞基排列為同源或異源，各自具有特征性組織分布和功能，KCNQ基因突變通常與許多心臟、聽覺和神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)［3-6］。選擇性激動劑和抑制劑對KCNQ 通道的調(diào)節(jié)可以改善由KCNQ 通道異常誘發(fā)的心律失常、癲癇發(fā)作、進行性聽力損失和疼痛等相關(guān)疾病的診治。KCNQ 通道不同亞型特異性激活劑和抑制劑的開發(fā)與使用有助于理解KCNQ通道參與許多疾病發(fā)生的作用機制，尋求更優(yōu)的診療方法［7］。

電壓門控鈉離子通道β1 亞基（Voltage-gated sodium channels β1 subunit，Navβ1），由SCN1B基因編碼，定位于心室細胞的夾層、T管及心房細胞的閏盤，是負責調(diào)節(jié)電壓門控鈉離子通道的動力學和表達的輔助亞基［8-9］，也與細胞的遷移、神經(jīng)突增長以及軸突向?qū)У肉c通道α 亞基所缺失的功能有關(guān)［10］。研究發(fā)現(xiàn)Navβ 亞基在癲癇、神經(jīng)病、心臟功能性疾病以及癌癥中都有一定的作用［11］，Navβ1 亞基雖然以鈉離子通道輔助亞基的身份被發(fā)現(xiàn)，但其對Kv通道也具有調(diào)控作用。前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當Navβ1亞基與不同Kv 通道共表達時，其可以激活Kv4.3 通道的開放［12-13］，增強Kv4.2 通道的電流密度［14］，通過加強與通道的結(jié)合，抑制Kv1.2和Kv1.3通道依賴電壓的激活［15］，而有關(guān)Navβ1 亞基對KCNQ 通道的調(diào)控作用鮮有報道。本研究利用體外全細胞膜片鉗技術(shù)明確了Navβ1亞基對KCNQ 通道及其亞型的調(diào)控作用，為解析KCNQ 通道的結(jié)構(gòu)功能以及KCNQ通道疾病的診療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

研究中所使用的培養(yǎng)細胞是HEK 293T 人胚腎上皮細胞系（BNCC353535，北納生物）；質(zhì)粒培養(yǎng)菌株為大腸桿菌DH5α（CD201-01，全式金），Navβ1亞基和KCNQ（1、2、3、4）表達質(zhì)粒由中國科學研究院、昆明動物研究所、上海大學生命科學學院贈予。

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基（11995，Solarbio），完全培養(yǎng)基DMEM+胎牛血清（Gibco?by life technlogies TM）；青霉素-鏈霉素混合液（P7630，Solarbio）；DMEM+FBS；HEK 293T 細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA Lip 3 000；Opti-MEM培養(yǎng)基（無血清培養(yǎng)基）；細胞外液：150 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2.5 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 葡萄糖、10 mmol/L HEPES（pH7.4），滲透壓280～300 mOs，配制好后用0.22 μm 濾頭過濾，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。細胞?nèi)液：130 mmol/L 天冬氨酸鉀、5 mmol/L MgCl2、10 mmol/L HEPES、5 mmol/L EGTA（pH7.2），滲透壓280～300 mOsm，配制好后用0.22 μm濾頭過濾，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK 293T 細胞培養(yǎng)：HEK 293T 復蘇置于37 ℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，鏡檢觀察細胞狀態(tài)（密度60%～80%）。

HEK 293T 細胞轉(zhuǎn)染：KCNQ 通道質(zhì)粒，Navβ1質(zhì)粒采用了脂質(zhì)體介導法，通過脂質(zhì)體和質(zhì)粒DNA靜電作用結(jié)合為DNA 脂質(zhì)體復合體，鑲嵌于膜表面，內(nèi)吞進入細胞，從而在細胞膜表達。

1.3.2 細胞膜片鉗電流記錄實驗

細胞膜電壓鉗制在-80 mV，以10 mV 的增量從-80 mV 步階進至+30 mV，持續(xù)時間為200 ms，誘導出KCNQ、KCNQ+Navβ1電流。

1.3.3 全細胞電壓鉗檢測

顯微鏡下將細胞調(diào)至視野中央，利用電子顯微操作儀將微電極下降到細胞外液液面后給予液接電位補償，此時觀察電極入液電阻，2～8 MΩ 較佳（入液電阻太小或太大的電極棄之）；通過電子顯微操作儀控制電極，當電極處于細胞的斜上方時，調(diào)整速度慢慢靠近細胞表面，觀察到電阻值略微升高時，利用小針管施加負壓，待高阻封接（1 GΩ 以上）狀態(tài)穩(wěn)定后，給予電容補償，破膜，記錄電流數(shù)據(jù)：細胞膜電容（Cm）、串聯(lián)電阻（Rs）、接入電阻（Ra）、時間常數(shù)（t）、Hold。

1.4 數(shù)據(jù)分析

由于細胞的電流大小受細胞狀態(tài)，細胞大小不同的影響，本文通過記錄全細胞電流（I），細胞膜電容（Cm）計算分析電流密度（Id），對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。電流密度表示單位細胞膜面積的通道電流大小，利用式（1）計算。

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計統(tǒng)計學分析采用Clampfit 10.3、OriginPro 9.0、GraphPad prism 7.0 軟件分析，所有分析結(jié)果以平均值±標準誤差表示，即Mean±SEM。

2 實驗結(jié)果

2.1 Navβ1亞基對KCNQ1通道電流的調(diào)制作用

為了明確Navβ1亞基對KCNQ 通道及其亞型的調(diào)制作用，利用全細胞膜片鉗記錄了HEK 293T 細胞單獨轉(zhuǎn)染KCNQ通道和與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染時細胞電流特性的變化。將細胞鉗制在-80 mV，以10 mV的增量步階增進至+30 mV，誘導出KCNQ1和KCNQ1+Nav β1 電流（圖1A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單獨轉(zhuǎn)染KCNQ1 通道時，隨著激活電壓增加，KCNQ1 通道的激活電流強度穩(wěn)步增加（圖1C），當與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染時，KCNQ1通道的激活電流強度增加幅度減緩（圖1D）。在激活電壓為+30 mV 時KCNQ1 通道單獨轉(zhuǎn)染的電流密度達到峰值為63.9±0.3 pA/pF。與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時，KCNQ1 通道的電流密度顯著下降，僅為31.5±1.4 pA/pF（圖1B）。結(jié)果表明，細胞中Navβ1 亞基的表達可以顯著抑制KCNQ1 通道的電流密度，說明Navβ1亞基減少了KCNQ1通道的離子流量，抑制了KCNQ1通道的開放。

圖1 Navβ1亞基對KCNQ 1通道電流的調(diào)制作用

2.2 Navβ1亞基對KCNQ2通道電流的調(diào)制作用

在對KCNQ2通道的檢測時，發(fā)現(xiàn)Navβ1亞基可以抑制KCNQ2 通道的電流。以10 mV 的增量從-80 mV 步階增加至+30 mV，誘導出KCNQ2 電流特征（圖2A）。隨著激活電壓增加，KCNQ2 通道的激活電流強度穩(wěn)步增加，但其增加幅度較?。▓D2C），而當其與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時，隨著激活電壓的增加電流強度的增幅顯著減?。▓D2D）。在電流密度的檢測中發(fā)現(xiàn)，單獨轉(zhuǎn)染時KCNQ2通道的電流密度在+30 mV 時達到峰值為19.1±2.1 pA/pF。與Navβ1 亞基共同轉(zhuǎn)染時，KCNQ2 通道的電流密度在激活電壓為-80 mV 與+10 mV 之間與其單獨轉(zhuǎn)染時無差異。當激活電壓為+20 mV 時，與Navβ1亞基共同轉(zhuǎn)染的KCNQ2通道電流密度到達峰值，為10.76±1.0 pA/pF，相較KCNQ2 單獨轉(zhuǎn)染時有顯著下降（圖2B）。這一結(jié)果表明Navβ1 亞基抑制了KCNQ2通道的電流密度，在激活電壓達到+20 mV以上時表現(xiàn)出抑制效果。

圖2 Navβ1亞基對KCNQ2通道電流的調(diào)制作用

2.3 Navβ1亞基對KCNQ3通道電流的調(diào)制作用

利用激活電壓以10 mV 的增量從-80 mV 步階增加至+30 mV 刺激，誘導KCNQ3 電流時發(fā)現(xiàn)（圖3A），相較于單獨轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道，Navβ1 亞基可以增強KCNQ3 通道的電流密度，從-40 mV 開始Navβ1 亞基對KCNQ3 通道電流密度的增強作用便具有顯著差異，并且從0 mV 開始其電流密度曲線急速上升，在+30 mV 時達到峰值為56.6±3.0 pA/pF（圖3B）。單獨轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道的電流密度峰值僅為22.2±1.5 pA/pF。在電流軌跡圖中也發(fā)現(xiàn)，單獨轉(zhuǎn)染KCNQ3 通道的電流強度總體較低，僅+10 mV以上高電壓激活時的電流強度有明顯上升（圖3C）。Navβ1 亞基和KCNQ3 共轉(zhuǎn)時電流強度增幅更顯著，從-20 mV 開始就有顯著增強（圖3D）。以上結(jié)果表明Navβ1亞基可以增加通過KCNQ3通道的離子流，激活KCNQ3通道。

圖3 Navβ1亞基對KCNQ3通道電流的調(diào)制作用

2.4 Navβ1亞基對KCNQ4通道電流的調(diào)制作用

Navβ1 亞基也可以增強KCNQ4 通道的電流。激活電壓以10 mV的增量從-80 mV步階增進至+30 mV 的誘導過程中（圖4A），電流軌跡圖中Navβ1亞基共轉(zhuǎn)染對KCNQ4 通道的電流強度并未有顯著的影響（圖4C 和D）。電流密度統(tǒng)計分析的結(jié)果顯示，當激活電壓為0 mV 以上時，Navβ1 亞基可以顯著增強KCNQ4 通道的電流密度。在+30 mV 時，相較于單獨轉(zhuǎn)染KCNQ4 通道的電流密度峰值14.2±0.6 pA/pF，與Navβ1亞基共轉(zhuǎn)染KCNQ4通道電流密度峰值可顯著上升至24.2±2.2 pA/pF（圖4B）。這一結(jié)果表明對于Navβ1亞基與KCNQ4通道共轉(zhuǎn)時，可以促進KCNQ4 通道的開放，加快通過KCNQ4 通道的離子流速，激活通道。

圖4 Navβ1亞基對KCNQ4通道電流的調(diào)制作用

2.5 Navβ1 亞基對KCNQ 通道不同亞型電流的調(diào)制差異

Navβ1 亞基對KCNQ 通道不同亞型電流密度峰值作用的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，Navβ1 亞基可以顯著抑制KCNQ1通道的電流密度峰值，其下調(diào)幅度可達50.71%，對KCNQ2 電流密度峰值的抑制幅度為43.70%。Navβ1 亞基可以增強KCNQ3 和KCNQ4 的電流密度峰值，其增強幅度分別為154.64% 和70.56%（圖5）。結(jié)果說明，Navβ1 亞基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的電流，激活KCNQ3 和KCNQ4的電流，對KCNQ3的激活效果優(yōu)于KCNQ4。

圖5 Navβ1亞基作用對KCNQ通道亞型電流密度峰值的影響

3 討論與結(jié)論

Navβ1亞基是電壓門控鈉離子通道的輔助亞基之一，通過與電壓門控鈉離子通道α 亞基結(jié)合調(diào)控通道的門控特性與通道的激活和失活［16］。前期研究報道指出Navβ1 亞基作為輔助亞基也可以與鉀離子通道結(jié)合［14］，并對鉀離子通道產(chǎn)生不同的調(diào)控作用，Navβ1 亞基在體外可增強異源表達的Kv4.2通道和Kv4.3 通道電流密度［12-13］，易化Kv1.1 和Kv1.2 通道的激活，而抑制Kv1.6通道的活化［14］。本研究利用全細胞膜片鉗技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基可以差異性調(diào)控異源表達的KCNQ 通道電流特性。實驗結(jié)果顯示，Navβ1 亞基可以抑制KCNQ1 和KCNQ2 通道的活性，而激活KCNQ3 和KCNQ4 通道。同時我們發(fā)現(xiàn)，KCNQ2 通道僅在+30 mV 時表現(xiàn)出抑制作用（圖2B），而Navβ1 亞基對KCNQ1 通道的抑制作用從-70 mV 開始便具有顯著差異（圖1B），說明Navβ1 亞基的結(jié)合延緩了KCNQ1 通道的激活，相較于KCNQ2通道Navβ1亞基可能更易與KCNQ1 通道發(fā)生作用。KCNQ 通道在閾值膜電位下開放，激活閾值接近靜息膜電位，對膜興奮性有強烈的抑制作用［1］，Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制作用可能與其協(xié)同電壓門控鈉離子通道電流參與細胞興奮性有關(guān)。Nguyen 等報道Navβ1 亞基通過胞外“Ig”結(jié)構(gòu)域與Kv1.3 通道α亞基結(jié)合抑制Kv1.3 通道的開放［14］，本研究中發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道的抑制效果與Kv1.3 相似，提示Navβ1 亞基可能也是通過其胞外“Ig”結(jié)構(gòu)域與KCNQ1 和KCNQ2 通道結(jié)合產(chǎn)生抑制作用，而Navβ1 亞基對KCNQ1 和KCNQ2 通道抑制效果的差異可能與KCNQ不同亞型和Navβ1亞基之間的結(jié)合差異有關(guān)，其具體機制有待進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)Navβ1 亞基可以易化KCNQ3 和KCNQ4 通道的激活，但作用也具有差異性。Navβ1亞基對KCNQ3 通道的激活效果更加地顯著，在-40 mV 的激活電壓下就有明顯的激活效應(yīng)（圖3B），而對KCNQ4 通道僅在0 mV 時具有顯著的激活作用（圖4B）。Navβ1 亞基對KCNQ3 通道電流密度峰值的激活程度約為KCNQ4 通道的2 倍（圖5），該激活作用提示我們，Navβ1 亞基對KCNQ3和KCNQ4 通道的激活可能與防止癲癇相關(guān)神經(jīng)元和心肌細胞等的過度興奮及復極化有關(guān)。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Navβ1亞基對KCNQ 通道具有亞型選擇性的調(diào)控作用，其對KCNQ1 和KCNQ2 通道具有抑制作用，并且對KCNQ1 通道的抑制效果要強于KCNQ2通道。Navβ1亞基對KCNQ3和KCNQ4通道具有激活作用，且對KCNQ3 的激活作用要強于KCNQ4 通道。Navβ1 亞基的這種差異性調(diào)控功能，將為解析癲癇及心臟功能障礙等相關(guān)疾病中KCNQ通道功能異常調(diào)控以及KCNQ通道疾病的診療提供新思路。