鄧洪剛，解 偉，高美榮，杜國儒，李 城，隋麗英

(海洋資源化學(xué)與食品技術(shù)教育部重點實驗室，亞洲區(qū)域鹵蟲參考中心，天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津300457)

鹵蟲生存于鹽湖、日曬鹽場蒸發(fā)池等高鹽水環(huán)境中，其無節(jié)幼體是海水魚類和甲殼類幼苗重要的活餌料[1].鹵蟲的品系特征(如卵的孵化質(zhì)量、初孵無節(jié)幼體的大小和營養(yǎng)成分等)對其在水產(chǎn)育苗中的有效利用至關(guān)重要.西藏鹽湖主要分布于那曲市和阿里地區(qū)，海拔4000～4500m，湖水分型多為碳酸鹽型或硫酸鹽型[2].20世紀(jì)90年代以來，西藏雙湖縣其香錯和改則縣拉果錯的鹵蟲卵資源逐步得到商業(yè)化采收和加工利用.

1998—1999 年，劉俊英等[3-4]首次對西藏拉果錯鹵蟲卵的生物學(xué)測定值和營養(yǎng)組成進行分析.2001年，劉鳳岐等[5]對西藏鹵蟲卵(鹵蟲卵來源鹽湖未知)最適孵化溫度進行分析.2003年，Van Stappen等[6]研究分析青藏高原拉果錯、幫錯、博澤錯、鯨魚湖、海雁湖和措勤等鹵蟲卵的生物學(xué)測定值、脂肪酸組成和不同孵化液離子組成對孵化特性的影響.2006年，于秀玲等[7]對西藏改則、雙湖、尼瑪和揚那蓬錯等鹽湖的鹵蟲卵生物學(xué)測定值和脂肪酸含量進行分析.2017—2019年，潘正軍等[8-9]研究了溫度、鹽度、光照和pH對西藏鹵蟲卵孵化率的影響.2018年，李炳乾等[10]對西藏其香錯鹵蟲卵的孵化條件進行研究.2022年，邢明威等[11]對西藏其香錯鹵蟲卵的生物學(xué)測定值、粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸組分進行分析，并肯定了其在凡納濱對蝦育苗中的積極效果.以上研究表明，不同西藏鹽湖鹵蟲卵具有不同的生物學(xué)特性，并且同一鹽湖、不同年份所采收加工的鹵蟲卵的生物學(xué)特性也存在一定差異.除這些研究外，還未見有關(guān)西藏其他鹽湖鹵蟲卵生物學(xué)特性分析的研究.西藏具有較為豐富的鹽湖鹵蟲資源，有必要對西藏鹽湖鹵蟲的生物學(xué)特性進行深入研究.

近年來，由氣候變化導(dǎo)致的鹽湖水環(huán)境因子(如鹽度和溫度)的波動，可能會對西藏鹵蟲卵生物學(xué)特性和營養(yǎng)組成造成影響.并且目前對具有開發(fā)潛力的西藏其他鹽湖(如班戈錯、當(dāng)穹錯)鹵蟲卵生物學(xué)特性的研究還未見報道.基于此，本研究對采自2019—2021年的西藏其香錯、班戈錯、拉果錯和當(dāng)穹錯4個鹽湖鹵蟲卵的生物學(xué)測定值、營養(yǎng)組成和孵化速率進行分析，并且對鹵蟲無節(jié)幼體的主要類胡蘿卜素中的角黃素的含量進行測定.本研究結(jié)果將為西藏鹵蟲卵在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的高效應(yīng)用提供依據(jù)，為西藏鹵蟲資源的可持續(xù)開發(fā)提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 鹵蟲卵樣本及鹽湖水質(zhì)信息

2019—2021 年，在位于西藏那曲市和阿里地區(qū)的4個鹽湖采集鹵蟲卵樣本.4個鹽湖分別為其香錯、班戈錯、拉果錯和當(dāng)穹錯，它們的地理位置和水體物理化學(xué)信息見表1.采集后的樣本需要去除雜質(zhì)并進行脫水，脫水后在-18℃進行冷凍去休眠處理，以便用于后續(xù)分析.4個鹽湖湖水的鹽度為45～100，pH為8.5～9.5，4個鹽湖均為碳酸鹽型鹽湖.

表1 鹽湖的地理位置和水體物理化學(xué)信息Tab.1 Geographical location of salt lakes and physical and chemical information of water body

1.2 鹵蟲水合卵徑、脫殼卵徑和無節(jié)幼體體長分析

鹵蟲卵在淡水中充氣1h，進行充分水合，并用盧戈碘液進行固定，用于測定水合卵卵徑.用NaClO溶液去除卵殼，將收集到的脫殼卵用清水徹底沖洗，用盧戈碘液固定后用于測定脫殼卵卵徑.鹵蟲卵在28℃、鹽度30、pH＝8、光照強度2000lx和連續(xù)充氣的條件下進行孵化，孵化約24h后收集Ⅰ期無節(jié)幼體，用盧戈碘液固定后在解剖鏡(DM500，德國LEICA)下分別測量水合卵徑、脫殼卵徑和Ⅰ期無節(jié)幼體體長(l)，并計算平均卵殼厚度.

式中：hCT為平均卵殼厚度，dHC為水合卵徑，dDC為脫殼卵徑.

1.3 鹵蟲脫殼卵粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸含量分析

脫殼后的鹵蟲卵在60℃烘箱內(nèi)干燥24h，參照GB/T 6432—2018《飼料中粗蛋白的測定 凱氏定氮法》，用凱氏定氮儀(2300-Kjeldahl，丹麥FOSS)測定鹵蟲卵中的粗蛋白含量；參照GB/T 6433—2006《飼料中粗脂肪的測定》，用索氏提取法測定鹵蟲卵中的粗脂肪含量；提取脂肪酸并甲酯化，采用內(nèi)標(biāo)法(C20：2n-6，美國NU-CHEK PREP)用氣相色譜儀(GC-2014，日本島津)分析其脂肪酸甲酯的組成和含量[12].

1.4 鹵蟲無節(jié)幼體角黃素含量分析

收集濕質(zhì)量約1g的Ⅰ期鹵蟲無節(jié)幼體(每個樣品3個平行).用V(氯仿)∶V(甲醇)＝1∶2的混合物提取色素，35℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RV10，德國IKA)濃縮.用氮氣吹干后，用1mL甲醇溶解色素提取物后備用[13].以甲醇為溶劑配制含0.005、0.01、0.02、0.1、0.2g/L角黃素(北京盛世康普化工技術(shù)研究院)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.采用C18色譜柱(5.6μm，4.6mm×250mm，日本島津)，柱溫25℃，流動相為V(甲醇)∶V(乙腈)＝9∶1的混合物，進樣量10μL，流量1mL/min[14]，于477nm處測定吸收峰面積.以角黃素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)制作角黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品峰面積計算得到角黃素含量.

1.5 孵化速率及孵化同步性測定

將2g鹵蟲卵加入含有1L稀釋鹵水(鹽度為30)的孵化管中，孵化條件同1.2節(jié).每隔4h使用24孔板(每孔取樣50 μL，共1.2mL)采樣一次，每組3個平行，在顯微鏡(DM500，德國LEICA)下觀察并記錄無節(jié)幼體、傘狀幼體和未孵化卵(胚胎)的數(shù)量，計算孵化率[12].以最高孵化率為100%，計算每個采樣時間點的相對孵化率.針對相對孵化率，采用二元二次方程擬合計算10%和90%無節(jié)幼體的孵出時間，并計算孵化同步性[12].

式中：ts為孵化同步性，t10、t90分別為10%和90%無節(jié)幼體的孵出時間.

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 25.0軟件對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，使用單因素方差分析和Duncan’s多重比較對實驗數(shù)據(jù)進行檢驗.

2 結(jié) 果

2.1 鹵蟲卵和Ⅰ期無節(jié)幼體生物學(xué)測定值

4個鹽湖鹵蟲卵和Ⅰ期無節(jié)幼體的生物學(xué)測定值見表2.西藏4個鹽湖鹵蟲卵水合卵徑和脫殼卵徑分別在263.6～342.9μm和248.5～315.5μm，Ⅰ期無節(jié)幼體體長為519.6～601.1μm.其中，拉果錯鹵蟲卵水合卵徑、脫殼卵徑和Ⅰ期無節(jié)幼體體長值最大，顯著高于其他組(P＜0.05).當(dāng)穹錯鹵蟲卵卵殼厚度最小(4.1μm)，拉果錯鹵蟲卵卵殼厚度最大(13.7μm).

表2 4個鹽湖鹵蟲卵和Ⅰ期無節(jié)幼體的生物學(xué)測定值(n＝100)Tab.2 Biometrics of Artemia cysts and instarⅠnauplii from four salt lakes(n＝100)

2.2 鹵蟲脫殼卵粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸含量

4個鹽湖鹵蟲脫殼卵粗蛋白和粗脂肪含量見表3，脫殼卵脂肪酸含量見表4.西藏鹵蟲卵粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.87%～57.29% (基于干質(zhì)量，下同)，粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.02%～22.11%.在脂肪酸水平上，拉果錯鹵蟲卵二十碳五烯酸(EPA，C20：5n-3)含量最高，為42.49mg/g，C16：1(n-7)和C18：1(n-9)含量分別為54.86mg/g和20.34mg/g，也明顯高于其他鹽湖鹵蟲卵，且高不飽和脂肪酸(HUFA，C原子數(shù)≥20，n≥3)以及總脂肪酸含量最高，分別為47.47mg/g和217.98mg/g.其香錯鹵蟲卵二十二碳六烯酸(DHA，C22：6n-3)含量最高(0.96mg/g)，并且C18：1(n-7)含量在4組中最高(55.07mg/g).當(dāng)穹錯鹵蟲卵EPA含量最低(10.05mg/g)，未檢測出DHA，但C18：3(n-3)和多不飽和脂肪酸(PUFA，C原子數(shù)≥18，n≥2)含量最高，分別為44.67mg/g和75.23mg/g.

表3 4個鹽湖鹵蟲脫殼卵粗蛋白和粗脂肪含量Tab.3 Crude protein content and crude fat content of the decapsulated Artemia cysts from four salt lakes

表4 4個鹽湖鹵蟲脫殼卵脂肪酸含量Tab.4 Fatty acid profile of the decapsulated Artemiacysts from four salt lakes

2.3 鹵蟲無節(jié)幼體角黃素含量

4個鹽湖鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量如圖1所示，圖中數(shù)據(jù)柱上的不同字母表示組間存在顯著差異(P＜0.05).4個鹽湖鹵蟲無節(jié)幼體中角黃素含量具有一定差異：當(dāng)穹錯鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量最高，為(1.68±0.17)mg/g，顯著高于其香錯和拉果錯鹵蟲無節(jié)幼體(P＜0.05)，但與班戈錯鹵蟲角黃素含量差異不顯著(P＞0.05)；拉果錯無節(jié)幼體的角黃素含量最低，為(0.84±0.03)mg/g.

圖1 4個鹽湖鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量Fig.1Canthaxanthin content in Artemia nauplii from four salt lakes

圖24 個鹽湖鹵蟲卵在28℃、鹽度30條件下的相對孵化率Fig.2Relative hatching rates of Artemia cysts from four origins at 28℃，salinity 30

2.4 鹵蟲卵的孵化速率

4個鹽湖鹵蟲卵在28℃、鹽度30條件下的相對孵化率如圖2所示，鹵蟲卵孵化同步性數(shù)據(jù)見表5.

表5 鹵蟲卵孵化同步性Tab.5 Hatching synchronization of Artemia cysts

4個鹽湖鹵蟲卵均從孵化至16h時開始檢測到有無節(jié)幼體孵出，16～28h為快速孵化期.孵化至24h時，其香錯、拉果錯和當(dāng)穹錯鹵蟲卵相對孵化率為76.1%～82.7%，班戈錯為50.9%.孵化至28h時，4個鹽湖鹵蟲卵相對孵化率較高(95%左右).根據(jù)每個時間點的相對孵化率繪制曲線并進行擬合，計算后可以得出t10和t90，進而可以求得孵化同步性.4個鹽湖鹵蟲卵的孵化同步性在13.7～14.8h之間.因此，西藏鹵蟲卵孵化需要更長的時間(28h)，孵化速率較慢.

3 討 論

到目前為止，世界上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7種兩性鹵蟲和許多種孤雌生殖鹵蟲.20世紀(jì)90年代，Abatzopoulos等[15]應(yīng)用卵和無節(jié)幼體的生物特征、成蟲的形態(tài)特征、遺傳、等位基因和DNA分析以及與已知鹵蟲品系的雜交測試等方法，將拉果錯的鹵蟲種群鑒定為Artemia tibetiana.然而，通過線粒體COI基因和12S-16S rRNA基因的分子標(biāo)記，以及線粒體基因組測序，西藏不同鹽湖的鹵蟲種群已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的分化.西藏鹽湖鹵蟲是否存在亞種或隱存種，以及本研究所涉及的4個西藏鹽湖鹵蟲的種屬關(guān)系還有待進一步研究.

3.1 西藏鹵蟲卵的特征

同一產(chǎn)地不同批次鹵蟲卵卵徑保持相對恒定，且無節(jié)幼體體長和能量等生物學(xué)特征也與卵徑高度相關(guān)，因此根據(jù)鹵蟲卵的這些生物學(xué)特性可以區(qū)分不同產(chǎn)地(品系)的鹵蟲[16].本研究結(jié)果表明，西藏鹽湖鹵蟲水合卵徑和Ⅰ期無節(jié)幼體體長均大于美國大鹽湖GSL鹵蟲卵(均值分別為245.1μm和438.9μm)和中國渤海灣塘沽鹵蟲卵(均值分別為273.7μm和446.2μm)[17].拉果錯鹵蟲卵比報道的鯨魚湖鹵蟲卵更大，但兩者的Ⅰ期無節(jié)幼體體長相似(分別為601.1μm和607.1μm)[6]，后者是迄今報道的最大的鹵蟲無節(jié)幼體.藏北鹽湖大部分位于海拔4400m以上的高海拔地區(qū)，紫外線輻射強，年平均氣溫低(夏季平均氣溫為16.9℃，冬季平均氣溫為-21.3℃)，氣溫日變化大[2].一般而言，生活在高緯度寒冷氣候中的生物往往比生活在低緯度地區(qū)的生物體型更大[18]，如南美洲太平洋沿岸鹵蟲成蟲的體型有隨著緯度的增加而增大的趨勢[19]，淡水橈足類[20]、枝角類[21]和輪蟲[22-23]等其他水生浮游動物有同樣的現(xiàn)象.本研究中西藏鹵蟲的卵徑和Ⅰ期無節(jié)幼體體長均較大，這可能與西藏鹵蟲的品系特征以及青藏高原獨特的地理環(huán)境條件有關(guān).

3.2 西藏鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量

角黃素是鹵蟲中的主要類胡蘿卜素[16].Tsushima等[24]發(fā)現(xiàn)大鹽湖鹵蟲卵中角黃素占總類胡蘿卜素的97.5%，但初孵無節(jié)幼體中角黃素的含量還未見報道.補充角黃素可以促進虹鱒魚[25-27]和鮭魚[28-29]肌肉的色素沉積，并提升虹鱒魚卵[25]的色素含量.本研究中4個鹽湖鹵蟲Ⅰ期無節(jié)幼體角黃素含量具有一定的差異，當(dāng)穹錯鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量最高，為(1.68±0.17)mg/g，而拉果錯鹵蟲無節(jié)幼體的角黃素含量最低，為(0.80±0.03)mg/g，推測角黃素含量的差異可能與鹵蟲種群遺傳背景和環(huán)境有關(guān).

3.3 西藏鹵蟲卵的HUFA含量

鹵蟲卵的營養(yǎng)組成(如粗蛋白、粗脂肪和脂肪酸等)及其代謝產(chǎn)物在不同品系或同一品系不同批次之間具有一定的差異.與美國大鹽湖和中國渤海灣鹵蟲卵相比，西藏其香錯、拉果錯和班戈錯鹵蟲卵EPA和DHA含量較高，HUFA含量為28.26～47.47mg/g，而大鹽湖HUFA含量僅為5.01mg/g，當(dāng)穹錯鹵蟲卵并未與其他3個鹽湖呈現(xiàn)出相同的結(jié)果，其EPA含量(10.05mg/g)和HUFA含量(11.89mg/g)與渤海灣鹵蟲卵的EPA含量(14.96mg/g)和HUFA含量(17.65mg/g)相似[11].鹵蟲卵的營養(yǎng)組成與鹵蟲所攝食的餌料(如單細(xì)胞藻類、細(xì)菌和古菌等)的營養(yǎng)成分差異有關(guān)[30-33].不同鹵蟲種群的脂肪酸組成和含量受物種[32,34-35]和餌料營養(yǎng)[30,36]的影響，當(dāng)投喂HUFA含量高的餌料時，鹵蟲HUFA含量也更高[30,36-37].但是，關(guān)于西藏鹽湖微生物組成及其HUFA含量的信息十分有限.與其他3個鹽湖鹵蟲卵相比，當(dāng)穹錯鹵蟲卵HUFA含量較低，這可能與該鹽湖引進外源HUFA含量低的鹵蟲品系[38]以及湖中餌料微生物營養(yǎng)缺乏有關(guān).除了品系和餌料因素外，西藏鹵蟲卵HUFA含量高還可能與高原強烈的紫外線輻射和極低的水溫有關(guān).繆錦來等[39]發(fā)現(xiàn)增強UV-B紫外線輻射可以增加4種南極冰藻中PUFA的含量.Skerratt等[40]指出，UV-B輻射使南極棕囊藻(Phaeocystis antarctica)PUFA的比例增加.因此，強烈的紫外線輻射可能會增加西藏鹽湖微生物中PUFA的含量，從而通過食物吸收促進HUFA在西藏鹵蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和積累.此外，鹵蟲對脂肪酸的代謝也會影響HUFA的含量.動物的脂肪酸代謝與溫度有關(guān)，溫度升高會提高脂肪酸的代謝率[41].隨著溫度的升高，鹵蟲HUFA的代謝速率變得更快[42-43].因此，可以推測西藏鹽湖較低的溫度可能會降低西藏鹵蟲的脂肪酸代謝率，從而導(dǎo)致鹵蟲體內(nèi)HUFA的積累.然而，西藏鹵蟲較高的HUFA含量是否與低溫下較低的HUFA代謝有關(guān)還有待研究.

鹵蟲中較高的HUFA含量以及DHA/EPA比有利于魚和蝦幼體的存活和生長發(fā)育[1,44-45].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用其香錯初孵無節(jié)幼體投喂凡納濱對蝦幼蝦[11]和雜交石斑魚幼體[46]，與其他品系的鹵蟲相比，其香錯鹵蟲表現(xiàn)出良好的育苗效果，顯著提升苗種對氨氮脅迫和弧菌攻毒的抵抗力.同時西藏鹵蟲卵[4,6-7]和無節(jié)幼體[11,46]富含HUFA，收獲時無節(jié)幼體與卵殼分離較好，且收獲后不需要進行HUFA強化，可直接投喂，能很好地滿足海水魚類、甲殼類苗種以及發(fā)育后期階段苗種的營養(yǎng)需求.

3.4 西藏鹵蟲卵的孵化特性

鹵蟲卵的孵化率和孵化同步性能夠顯著影響其市場價格.孵化同步性好的卵能在較短的時間內(nèi)產(chǎn)出較多大小均勻的無節(jié)幼體，育苗場傾向于使用在24h內(nèi)孵化率達到最高且孵化同步性好的鹵蟲卵[14].優(yōu)質(zhì)鹵蟲卵的孵化同步性ts應(yīng)小于8h，ts超過10h則被認(rèn)為孵化同步性較差[12].本研究表明，其香錯、班戈錯、拉果錯和當(dāng)穹錯的鹵蟲卵孵化率較高，孵化時間較長(28h)，其孵化同步性ts為13.7～14.8h，說明西藏鹵蟲卵孵化同步性較差，孵化結(jié)束晚，孵化速率慢，孵化具有滯后性.

4 結(jié) 語

西藏鹽湖鹵蟲具有較大的卵徑和Ⅰ期無節(jié)幼體體長；其香錯、班戈錯和拉果錯鹵蟲卵營養(yǎng)價值較高，尤其富含EPA，以及少量DHA.其香錯、班戈錯、拉果錯和當(dāng)穹錯鹵蟲卵孵化率較高，但4個鹽湖鹵蟲卵孵化時間長，孵化結(jié)束晚，孵化同步性較差.其香錯、班戈錯和拉果錯鹵蟲卵具有HUFA含量高的優(yōu)點，孵化后可直接投喂，不需要額外的強化，因此更適用于海水魚蝦幼苗的培育；而相對較大的初孵鹵蟲無節(jié)幼體也能更好地滿足發(fā)育后期的水產(chǎn)苗種對餌料適口性的需求.今后需要對西藏鹽湖鹵蟲資源量及其品系特性開展深入的考察和研究，進一步探究西藏鹵蟲卵的加工工藝和最適孵化條件，以期生產(chǎn)高質(zhì)量的西藏鹵蟲卵，可持續(xù)地開發(fā)和利用西藏鹵蟲資源.