段升強(qiáng),喬建新,徐新文,劉熙鵬,張秀峰

腦膠質(zhì)瘤惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差,且多數(shù)情況下手術(shù)無(wú)法完全切除[1-2]。腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后評(píng)估具有重要意義,然而目前缺乏科學(xué)有效的判斷方法。微小RNA(miRNA)可以與其他信使RNA(mRNA)的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)超過(guò)70%人類基因的表達(dá)[3]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA可參與調(diào)控影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等生物學(xué)行為[4]。微小RNA-4744(miR-4744)是通過(guò)二代測(cè)序在腦膠質(zhì)瘤組織中鑒定的一種新miRNA,其過(guò)表達(dá)可抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲[5],但miR-4744是否可影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后尚未可知。右開放閱讀框激酶2(RIOK2)是蛋白激酶(RIO)家族的成員,又被稱為非典型激酶[6-7]。RIOK2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中高表達(dá),其過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖,其下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并增加對(duì)化療的敏感性[8-9]。因此,RIOK2在惡性腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用,可能作為腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評(píng)估的生物指標(biāo)。本研究檢測(cè)miR-4744、RIOK2在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá),分析二者與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系,以期為腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后評(píng)估提供參考,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年12月—2017年11月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科收治腦膠質(zhì)瘤患者102例作為研究對(duì)象,手術(shù)中收集腦膠質(zhì)瘤組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣≥3 cm)。男58例,女44例,年齡43～66(55.03±7.93)歲;腫瘤部位:額葉63例,顳葉25例,其他14例;腫瘤直徑:<3 cm 50例,≥3 cm 52例;依據(jù)“中國(guó)中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷和治療指南”[10]腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí):Ⅰ～Ⅱ級(jí)57例,Ⅲ～Ⅳ級(jí)45例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者56例,無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者46例;卡氏功能狀態(tài)(KPS)評(píng)分[11]:≥80分55例,<80分47例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LS2014-083),患者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①患者符合相關(guān)指南制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],并結(jié)合病理檢查和頭顱CT檢查結(jié)果最終確診;②患者均為首次確診,入院前未接受臨床干預(yù)措施;③均行手術(shù)切除。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并精神疾病;②合并其他腦部疾病;③心、肝、腎功能嚴(yán)重?fù)p害;④合并其他惡性腫瘤;⑤臨床及隨訪資料不全;⑥妊娠、哺乳期女性。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平:將腦膠質(zhì)瘤組織及癌旁正常組織勻漿,Trizol試劑盒(批號(hào)RJ6829,購(gòu)自北京鴻躍創(chuàng)新科技有限公司)提取組織中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,使用熒光定量PCR儀(型號(hào)Quantagene Q225,購(gòu)自天津迦美惠眾科技有限公司)及PCR試劑盒(批號(hào)HJ-39115,購(gòu)自杭州九洋生物科技有限公司)進(jìn)行擴(kuò)增。miR-4744(內(nèi)參基因U6)、RIOK2 mRNA(內(nèi)參基因GAPDH)的引物序列均由南京有晴生物科技有限公司合成,引物序列見表1。反應(yīng)條件:96℃ 3 min、 95℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s、71 ℃ 5 min,共進(jìn)行38個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束收集相應(yīng)數(shù)據(jù),并進(jìn)行Ct值分析,以2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-4744、RIOK2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)RIOK2蛋白表達(dá):制作腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織石蠟切片,脫蠟,修復(fù)抗原,3% H2O2浸泡15 min,阻斷過(guò)氧化氫酶活性,加入兔抗人RIOK2單克隆抗體(批號(hào)HPA029069,購(gòu)自德國(guó)Sigma公司),室溫孵育1 h,4℃過(guò)夜,磷酸鹽緩沖液清洗1次,而后加入二抗(批號(hào)PA1173,購(gòu)自廣東固康生物科技有限公司)孵育20 min,最后使用蘇木素復(fù)染,脫水、封片,顯微鏡下觀察染色結(jié)果:RIOK2蛋白染色陽(yáng)性信號(hào)定位于胞質(zhì),呈中棕黃色顆粒,依據(jù)著色程度和著色百分比進(jìn)行評(píng)定。著色程度:未著色0分,淺黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分。著色百分比:無(wú)染色記0分,<25%記1分,25%～<50%記2分,50%～<75%記3分,≥75%記4分[12]。兩者乘積為半定量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),≤2分為陰性,>2分為陽(yáng)性。

1.3.3 預(yù)后隨訪:采用電話或門診方式隨訪,隨訪期為5年,隨訪截止日期2022年11月30日。記錄患者術(shù)后第1天到5年后的生存情況:102例均獲訪,患者死亡(死亡組)47例,生存(存活組)55例 。

2 結(jié) 果

2.1 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織miR-4744、RIOK2表達(dá)比較 與癌旁組織比較,腦膠質(zhì)瘤組織中miR-4744表達(dá)水平明顯降低,RIOK2 mRNA和蛋白陽(yáng)性率明顯升高(P<0.01),見表2、圖1。

圖1 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織RIOK2蛋白表達(dá)情況(免疫組化染色,×200)

表2 腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織miR-4744、RIOK2表達(dá)比較

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 分別以腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平的平均值(0.43、1.60)為臨界值(≥平均值為高表達(dá),<平均值為低表達(dá)),將患者分為miR-4744低表達(dá)組51例、miR-4744高表達(dá)組51例;RIOK2 mRNA低表達(dá)組34例、RIOK2 mRNA高表達(dá)組68例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤部位無(wú)關(guān)(P>0.05),與腫瘤分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、KPS評(píng)分有關(guān)(P<0.01),見表3。

表3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

2.3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.636,P<0.001)。

2.4 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示,miR-4744低表達(dá)組患者5年生存率為31.37%(16/51),低于miR-4744高表達(dá)組的76.47%(39/51),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.874,P<0.001);RIOK2 mRNA高表達(dá)組患者5年生存率為42.65%(29/68),低于RIOK2 mRNA低表達(dá)組的76.47%(26/34),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.437,P=0.001),見圖2。

圖2 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系

2.5 多因素Cox回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素 以腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)生存情況(生存=0,死亡=1)為因變量,以腫瘤分級(jí)(Ⅰ～Ⅱ級(jí)=0,Ⅲ～Ⅳ級(jí)=1)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(否=0,是=1)、KPS評(píng)分(≥80分=0,<80分=1)、miR-4744(高表達(dá)=0,低表達(dá)=1)、RIOK2 mRNA(低表達(dá)=0,高表達(dá)=1)為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示,腫瘤分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、KPS評(píng)分<80分、miR-4744低表達(dá)、RIOK2 mRNA高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表4。

表4 多因素Cox回歸分析腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素

2.6 存活組和死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平比較 與存活組比較,死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744表達(dá)水平明顯降低,RIOK2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),見表5。

表5 存活組和死亡組腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平比較

2.7 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平對(duì)患者5年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值 繪制腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平對(duì)患者5年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)患者5年內(nèi)死亡的AUC分別為0.752、0.711、0.885,兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)患者5年內(nèi)死亡的AUC高于miR-4744、RIOK2 mRNA單獨(dú)預(yù)測(cè)的AUC(Z/P=3.147/0.002、3.531/0.004),見表6、圖3。

圖3 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平預(yù)測(cè)患者5年內(nèi)死亡的ROC曲線

表6 腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744、RIOK2 mRNA表達(dá)水平對(duì)患者5年內(nèi)死亡的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤按照其惡性程度分為低級(jí)別(Ⅰ～Ⅱ級(jí))和高級(jí)別(Ⅲ～Ⅳ級(jí))膠質(zhì)瘤,不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤的治療方法也不盡相同,預(yù)后也相差較大[13-14]。對(duì)臨床來(lái)說(shuō),找到有效的膠質(zhì)瘤預(yù)后判斷指標(biāo)很有必要。

miRNA可作為癌基因亦或腫瘤抑制因子,大量研究揭示了miRNA在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的失調(diào)[15]。Qiu等[16]研究顯示,膠質(zhì)瘤患者腦脊液中miR-1246呈低表達(dá),與膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)率相關(guān),miR-1246升高可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的活化與生長(zhǎng)。Song等[5]研究發(fā)現(xiàn),miR-4744可負(fù)向調(diào)控RIOK2表達(dá)來(lái)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織中miR-4744表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,且miR-4744表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、KPS評(píng)分有關(guān),與Song等[5]研究結(jié)果相符,表明miR-4744參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生過(guò)程,且影響疾病的進(jìn)展。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示,miR-4744低表達(dá)患者5年生存率低于miR-4744高表達(dá)患者,死亡組miR-4744表達(dá)水平低于存活組,說(shuō)明miR-4744與患者預(yù)后有關(guān),其低表達(dá)可能提示腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良。隨后的Cox回歸分析也顯示,miR-4744低表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為評(píng)估m(xù)iR-4744在腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值,本研究進(jìn)行了ROC曲線分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-4744預(yù)測(cè)患者5年內(nèi)死亡的AUC為0.752,表明其對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

RIO激酶參與前糖體RNA加工和核糖體生物合成,其在核糖體合成和細(xì)胞周期進(jìn)程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用,可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[17-18]。近年來(lái),關(guān)于RIO激酶參與腫瘤的研究逐漸增多。Messling等[19]發(fā)現(xiàn),靶向抑制RIOK2可促使急性髓系白血病蛋白質(zhì)合成減少和白血病細(xì)胞死亡。Matsuzaki等[20]研究報(bào)道,RIOK2水平與舌鱗狀細(xì)胞癌患者生存率密切相關(guān),敲低RIOK2表達(dá)可抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。Yu等[21]研究發(fā)現(xiàn),RIOK2在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中過(guò)度表達(dá),抑制RIOK2活性可使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn),腦膠質(zhì)瘤組織中RIOK2 mRNA和蛋白陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織,且RIOK2 mRNA表達(dá)水平與腫瘤分級(jí)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、KPS評(píng)分有關(guān),與Yu等[21]研究結(jié)果一致,說(shuō)明RIOK2可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生和進(jìn)展,且與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲特征的機(jī)制之一,其特點(diǎn)是上皮標(biāo)志物(如E-鈣黏蛋白)缺失和間充質(zhì)標(biāo)志物(如N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白)增加,被認(rèn)為是膠質(zhì)瘤侵襲性的重要調(diào)節(jié)因子[22]。推測(cè)RIOK2的過(guò)表達(dá)可能提高N-鈣黏蛋白、β-連環(huán)蛋白的表達(dá),使得腫瘤細(xì)胞向周圍組織或遠(yuǎn)處擴(kuò)散的能力增加,加劇癌癥進(jìn)程。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示,RIOK2 mRNA高表達(dá)患者5年生存率低于RIOK2 mRNA低表達(dá)患者,RIOK2 mRNA高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且死亡組腦膠質(zhì)瘤組織RIOK2 mRNA表達(dá)水平高于存活組,表明RIOK2高表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步ROC曲線分析結(jié)果顯示,RIOK2 mRNA預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者5年內(nèi)死亡的AUC為0.711,而miR-4744和RIOK2 mRNA兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC為0.885,提示兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的價(jià)值更高。

Gao等[9]報(bào)道稱miR-4744可以與RIOK2的3'-非翻譯區(qū)結(jié)合并負(fù)調(diào)控RIOK2的表達(dá),且miR-4744對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用可被RIOK2過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)。本研究相關(guān)性分析顯示,腦膠質(zhì)瘤組織miR-4744與RIOK2 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),與其研究結(jié)果一致。

綜上所述,miR-4744在腦膠質(zhì)瘤組織中低表達(dá),RIOK2 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá),二者呈負(fù)相關(guān),共同調(diào)控腦膠質(zhì)瘤患者的病情進(jìn)展,且miR-4744、RIOK2 mRNA聯(lián)合對(duì)患者預(yù)后預(yù)測(cè)具有較高價(jià)值。但關(guān)于二者調(diào)控腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

段升強(qiáng):設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過(guò)程,課題設(shè)計(jì),論文撰寫;喬建新:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;徐新文:實(shí)施研究過(guò)程,資料搜集整理,論文修改;劉熙鵬、張秀峰:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析