張蕊,張志勇,張晉霞,任伯

急性腦梗死(acute cerebral infarction,ACI)由腦血管血流供應(yīng)突然中斷引起,是全球致殘事件的主要原因,其發(fā)病率隨著社會老齡化的發(fā)展而不斷升高[1-2]。盡早識別ACI、評估患者病情是制定個性化治療的前提,對患者的恢復(fù)和預(yù)后具有重要的臨床和社會價值。溶栓是ACI常用的治療方法,然而,溶栓雖可有效疏通血管,但仍存有一定的風(fēng)險,且不適用于部分大血管閉塞的患者[3-4]。即使在適當(dāng)?shù)闹委煷斑M行了溶栓治療,其預(yù)后仍需密切關(guān)注[5]。因此,尋找更好的評估ACI預(yù)后的血液生物標(biāo)志物具有重要臨床價值。微小RNA(microRNA,miRNA)是一類非編碼短鏈RNA,通過其靶蛋白調(diào)控作用參與癌癥及心腦血管等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。據(jù)報道,微小RNA-29c-3p(miR-29c-3p)低表達不僅提示缺血性腦卒中疾病嚴(yán)重程度較高,且是患者短期預(yù)后不良的危險因素[7]。鼠雙微體2(murine double minute 2,MDM2)是一種原癌基因,在多種人類癌癥中發(fā)揮致癌活性[8]。此外,MDM2已被證明可通過改變神經(jīng)元中的氧化還原穩(wěn)態(tài)參與調(diào)控大鼠缺血再灌注損傷[9]。生物學(xué)研究預(yù)測,miR-29c-3p和MDM2可能存在靶向關(guān)系,然而,miR-29c-3p和MDM2表達在ACI中的作用尚不清楚。因此,現(xiàn)分析ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2表達情況及其與預(yù)后的關(guān)系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2021年7月—2022年7月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院收治的ACI患者90例為ACI組,其中男54例,女36例,年齡49～70(57.52±6.48)歲。同期醫(yī)院健康體檢者90例為健康對照組,其中男56例,女34例,年齡47～69(56.50±6.20)歲。2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);與健康對照組比較,ACI組飲酒史比例、總膽固醇(TC)、高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)水平升高(P<0.05),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、尿酸(UA)水平降低(P<0.05),見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(LS2021027),全部受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 健康對照組和ACI組臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均符合ACI診斷標(biāo)準(zhǔn)[10],且經(jīng)影像學(xué)診斷確診;②急性發(fā)作,發(fā)病到入院時間<72 h;③臨床數(shù)據(jù)完整,且患者均接受隨訪。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①既往有ACI病史;②有靜脈溶栓或發(fā)病后血栓清除史;③任何其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如顱內(nèi)出血、帕金森病或阿爾茨海默病等;④嚴(yán)重心臟病、肺部或其他感染性疾病;⑤癌癥、自身免疫系統(tǒng)疾病或嚴(yán)重的肝腎功能障礙。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血生化指標(biāo)檢測:采集ACI患者入院后24 h內(nèi)、健康者體檢時空腹肘靜脈血10 ml,離心留取血清,儲存于-70℃冰箱。取血清樣本,解凍后采用全自動生化分析儀(型號Chemray800,購自北京澤平科技有限責(zé)任公司)檢測FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、SCr、BUN、UA。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測血清hs-CRP水平,試劑盒購自廣州宏新生物技術(shù)有限公司。

1.3.2 熒光定量PCR法檢測血清miR-29c-3p水平:使用RNA提取試劑盒(購自廣東固康生物科技有限公司) 提取血清總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑(購自北京澤平科技有限責(zé)任公司)對總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。隨后,采用PCR試劑盒(購自廣東固康生物科技有限公司)進行擴增,反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)根據(jù)試劑盒說明書進行,2-ΔΔCt法計算miR-29c-3p水平。引物由安徽佰歐晶醫(yī)學(xué)科技有限公司合成。miR-29c-3p上游引物:5'-GAAGCACCATTTGAAATCAG-3' 和下游引物5'-TTGGCACTAGCACATT-3';內(nèi)參(U6)上游引物:5'-CTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'和下游引物5'-GCTTCGGCAGCACATATAC-3'。

1.3.3 ELISA法檢測血清MDM2水平:采用ELISA法測定血清MDM2水平,試劑盒購自英國Biorbyt公司,于酶標(biāo)儀(型號CMax Plus,購自上海實維實驗儀器技術(shù)有限公司)450 nm處讀取吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清MDM2水平。

1.3.4 生物信息學(xué)評估m(xù)iR-29c-3p和MDM2結(jié)合位點:經(jīng)Starbase數(shù)據(jù)庫(https://starbase.sysu.edu.cn)對miR-29c-3p和MDM2相互作用位點進行預(yù)測。

1.3.5 預(yù)后評估:患者出院后3個月進行門診復(fù)診(3個月內(nèi)無患者死亡),采用改良Rankin量表(mRS)[11]評估患者3個月后神經(jīng)功能恢復(fù)情況。mRS評分以2分為界值,將患者分為預(yù)后良好亞組55例(mRS評分≤2分)和預(yù)后不良亞組35例(mRS評分>2分)。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較 與健康對照組比較,ACI組血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),見表2。

表2 健康對照組和ACI組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較

2.2 ACI患者2亞組血清miR-29c-3p、MDM2水平比較 與預(yù)后良好亞組比較,預(yù)后不良亞組血清miR-29c-3p水平降低,MDM2水平升高(P<0.01),見表3。

表3 預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平比較

2.3 ACI患者血清miR-29c-3p、MDM2水平的相關(guān)性分析 miR-29c-3p與MDM2有靶向作用位點,見圖1。經(jīng)Pearson法分析,ACI患者血清miR-29c-3p與MDM2水平呈負相關(guān)(r=-0.442,P<0.001)。

圖1 miR-29c-3p與MDM2的靶向作用位點

2.4 影響ACI患者預(yù)后不良的多因素Logistic回歸分析 以ACI患者預(yù)后情況為因變量,以上述結(jié)果中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)(飲酒史、TC、HDL-C、UA、hs-CRP、miR-29c-3p、MDM2)作為自變量納入多因素Logistic回歸分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),血清hs-CRP高水平、MDM2高水平是ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素(P<0.05),miR-29c-3p高水平是其保護因素(P<0.05),見表4。

表4 Logistic回歸分析ACI患者預(yù)后不良的影響因素

2.5 血清miR-29c-3p、MDM2預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的價值 繪制血清miR-29c-3p、MDM2 預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清miR-29c-3p、MDM2及二者聯(lián)合預(yù)測ACI患者預(yù)后不良的AUC分別為0.825、0.831、0.909,二者聯(lián)合預(yù)測效能優(yōu)于單項預(yù)測(Z/P=2.222/0.026、2.063/0.039),見圖2、表5。

表5 血清miR-29c-3p、MDM2及二者聯(lián)合對ACI患者預(yù)后不良的預(yù)測價值

3 討 論

ACI可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷,影響患者的健康和生活質(zhì)量[12]。研究顯示,ACI過程中一些miRNA表達會隨著疾病進展而變化,有望作為疾病的潛在預(yù)測指標(biāo)或新的治療方向[13-14]。Song等[15]研究表明,血漿miR-409-3p在ACI中高表達,升高的血漿miR-409-3p與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)。駱嵩等[16]研究顯示,miR-34c水平可評估ACI患者炎性反應(yīng)和神經(jīng)缺損的嚴(yán)重程度。miR-29c-3p是近期發(fā)現(xiàn)的一種可參與缺血性腦病發(fā)展的miRNA[7]。以往研究顯示,miR-29c-3p過表達可通過靶向抑制10-11易位蛋白2介導(dǎo)帕金森疾病模型小鼠中的自噬,進而改善疾病的發(fā)展[17],表明高水平miR-29c-3p對帕金森疾病的進展具有抑制作用。在本研究中,ACI患者血清miR-29c-3p水平較健康者低,與Wang等[17]研究結(jié)果類似,提示低表達的miR-29c-3p可能影響ACI的發(fā)生。Zhang等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-29c-3p是膿毒癥患者心功能不全發(fā)生的獨立危險因素,在動物模型中抑制miR-29c-3p表達可降低膿毒癥引起的心臟功能障礙和炎性反應(yīng)。提示miR-29c-3p在不同的疾病中發(fā)揮的功能不盡相同。隨后評估了miR-29c-3p水平與ACI預(yù)后的關(guān)系,結(jié)果顯示,預(yù)后不良ACI患者血清miR-29c-3p水平較預(yù)后良好ACI患者更低,提示血清中miR-29c-3p低水平可能為ACI預(yù)后不良的早期指標(biāo)。進一步研究發(fā)現(xiàn),血清miR-29c-3p低水平為ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素,在臨床中有望使用miR-29c-3p水平對其預(yù)后進行評估。

Starbase網(wǎng)站預(yù)測miR-29c-3p可能與MDM2存在靶向關(guān)系。同時相關(guān)性分析證實,ACI患者血清miR-29c-3p與MDM2水平呈負相關(guān),與網(wǎng)站預(yù)測的結(jié)果相一致。MDM2是腫瘤抑制因子p53的負調(diào)節(jié)因子,在多種惡性腫瘤中高表達[19-20]。早期研究表明,MDM2可通過調(diào)節(jié)心肌梗死小鼠核因子-κB通路減輕心功能不全和纖維化[21]。胡雪鐘等[22]研究證實,下調(diào)MDM2可通過影響p53通路減輕缺血性腦卒中的發(fā)展。然而,尚未有研究表明MDM2在ACI中的作用。本研究結(jié)果顯示,ACI患者血清MDM2水平較健康者高,預(yù)后不良ACI患者血清MDM2水平較預(yù)后良好ACI患者高,與胡雪鐘等[22]研究結(jié)果一致,驗證了高水平MDM2可促進缺血性腦病的進展。并且血清MDM2高水平是ACI患者預(yù)后不良的獨立危險因素,表明MDM2水平可能與ACI的預(yù)后不良有關(guān),可能作為預(yù)測ACI預(yù)后的潛在標(biāo)志物。通過構(gòu)建ROC曲線發(fā)現(xiàn)血清miR-29c-3p、MDM2水平對ACI患者預(yù)后不良具有較高的預(yù)測價值,并且二者聯(lián)合預(yù)測的AUC和特異度上升,表明二者均有望成為ACI預(yù)后的預(yù)測因子。hs-CRP是一種常見的非特異性炎性因子,據(jù)報道,血清hs-CRP高水平是ACI預(yù)后不良的獨立危險因素[23],與本研究結(jié)果一致?？赡苁且驗閔s-CRP能與脂蛋白結(jié)合,激活經(jīng)典補體途徑,直接增強靜息血管內(nèi)皮細胞,介導(dǎo)內(nèi)皮細胞中白細胞的滾動、吸附和滲出,形成不穩(wěn)定斑塊,最終誘發(fā)缺血性腦卒中[24]。因此,本試驗結(jié)果可能是miR-29c-3p與MDM2相互作用,炎性因子累積,導(dǎo)致ACI的不良預(yù)后,具體機制還需進一步研究。

綜上,ACI患者血清miR-29c-3p呈低水平,MDM2呈高水平,且預(yù)后不良ACI患者血清miR-29c-3p較預(yù)后良好患者更低,MDM2水平較預(yù)后良好患者更高,二者聯(lián)合對ACI患者預(yù)后有較高預(yù)測價值。然而本研究為單中心研究,且樣本量不大,后續(xù)將進行大規(guī)模、多中心的研究以進一步完善該結(jié)論在多樣化ACI群體中的適用性。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張蕊:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;張志勇:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;張晉霞:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;任伯:進行統(tǒng)計學(xué)分析