張朋壘 張明婷 郝禮森 靳麗敏 潘恩亮 何宇 苗笑佳 王薇

肝纖維化是肝臟對(duì)各種損傷產(chǎn)生的修復(fù)反應(yīng),長(zhǎng)期進(jìn)展可演變?yōu)楦斡不痆1]。而肝星狀細(xì)胞 (hepatic stellate cells, HSC) 是參與肝纖維化的最重要細(xì)胞,其活化及增殖在肝纖維化的形成及發(fā)展中扮演重要角色[2-4]。含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)是第一個(gè)被確定為具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶,廣泛表達(dá)于人體各個(gè)組織和細(xì)胞,其過表達(dá)可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖參與多種惡性腫瘤的形成及發(fā)展[5-6]。近年來一些學(xué)者對(duì)SHP2在某些非腫瘤領(lǐng)域的作用給予了廣泛關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)[7],體外活化大鼠HSC的 SHP2表達(dá)下調(diào)可使其增殖明顯受到抑制。但SHP2在纖維化肝組織及在體HSC中的表達(dá)變化與在體HSC活化及增殖的關(guān)系仍不清楚。本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型,探討大鼠肝纖維化病程中肝組織及在體HSC的SHP2表達(dá)與在體HSC活化及增殖的關(guān)系。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

50只清潔級(jí)健康雄性 SD大鼠(350～400 g/只)購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司。SP試劑購(gòu)于北京中山金橋生物有限公司,兔抗 SHP2多克隆抗體購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,小鼠抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (alpha-smooth muscle actin, α-SMA)單克隆抗體購(gòu)于臺(tái)灣arigo公司。

二、方法

(一)大鼠肝纖維化模型的構(gòu)建 上述實(shí)驗(yàn)大鼠均按清潔級(jí)要求在華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng),并被隨機(jī)分為:對(duì)照組(10只)、模型組(40只)。大鼠肝纖維化模型采用腹腔注射四氯化碳法構(gòu)建[8],將 50%的四氯化碳橄欖油混合液,經(jīng)腹腔注射入模型組大鼠,每周2 次,每次劑量為1 mL/kg,共8周,并在造模 2周、4周、6周、8周分別取10只大鼠,無菌條件下麻醉后取適量肝組織,隨即用4%多聚甲醛固定,用于免疫熒光、免疫組織化學(xué)、Masson三色及HE染色;對(duì)照組大鼠每周2 次腹腔注射生理鹽水,劑量同模型組,肝組織標(biāo)本按上述方法與8周模型組大鼠一同留取。本研究所涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

(二)肝組織病理學(xué)及免疫組織化學(xué)染色 大鼠肝組織經(jīng)石蠟常規(guī)包埋、切片,進(jìn)行Masson三色及HE染色,觀察肝組織病理學(xué)變化。并應(yīng)用SP法進(jìn)行SHP2及α-SMA免疫組織化學(xué)染色,用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照染色,結(jié)果以棕褐色為陽性表達(dá)。SHP2及α-SMA免疫組化染色圖像應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件分析,積分光密度值 (integral optical density, IOD)表示陽性表達(dá)水平。

(三)SHP2與α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)在體HSC的SHP2表達(dá) 常規(guī)脫蠟及水化的大鼠肝組織切片經(jīng)抗原修復(fù)及血清封閉后,加入一抗小鼠抗α-SMA 單克隆抗體及兔抗SHP2多克隆抗體(均為1∶100稀釋)于4 ℃冰箱中過夜,用PBS清洗,5 min/次,共3次;先后滴加異硫氰酸熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋)二抗及四甲基異硫氰酸羅丹明標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶200稀釋)三抗,在滴加二抗與三抗之間及三抗之后,分別于37 ℃恒溫箱中內(nèi)孵育30 min,并用PBS清洗3次,5 min/次;最后滴加DAPI避光孵育10 min染核。用PBS代替一抗進(jìn)行陰性對(duì)照染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察肝組織的SHP2與α-SMA共表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、大鼠肝組織的病理組織學(xué)變化

HE及Masson三色染色顯示大鼠肝纖維化模型成功構(gòu)建,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),正常肝細(xì)胞由于不同程度變性壞死而逐漸減少,肝纖維化逐漸加重(圖1)。

A:對(duì)照組HE染色;B:造模4周HE染色;C: 造模8周HE染色;D: 對(duì)照組Masson染色;E:造模4周Masson染色;F: 造模8周Masson染色

二、在體HSC的活化與增殖

α-SMA在對(duì)照組大鼠肝組織中僅表達(dá)于血管壁平滑肌細(xì)胞,與對(duì)照組大鼠肝組織的α-SMA陽性表達(dá)IOD相比,造模不同時(shí)間(2周、4周、6周、8周)大鼠纖維化肝組織的α-SMA陽性表達(dá)IOD顯著增加(P<0.05),且逐漸升高,P<0.05 (圖2、表1)。由于α-SMA 為HSC的活化標(biāo)志,檢測(cè)肝組織的α-SMA表達(dá)水平可間接反映肝組織的在體HSC活化及增殖。故上述結(jié)果顯示,隨著大鼠肝纖維化的加重,在體HSC的活化及增殖逐漸加快。

表1 各組大鼠肝組織的SHP2及α-SMA蛋白陽性表達(dá)IOD比較(±s, n=10)

A:對(duì)照組;B:造模2周;C:造模4周;D:造模6周;E:造模8周

三、在體HSC的SHP2表達(dá)

SHP2與α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記檢測(cè)顯示,四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程中,伴隨肝纖維化的加重,造模不同時(shí)間(2周、4周、6周、8周)大鼠纖維化肝組織中表達(dá)SHP2的活化HSC占總的活化HSC的百分比(54%±3%、 62%±2%、73%±4%、 86%±3%)逐漸升高(P<0.05,見圖3)。

A1、A2、D1、D2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝組織的SHP2陽性表達(dá)(綠色熒光斑點(diǎn));B1、B2、E1、E2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝組織的α-SMA陽性表達(dá)(紅色熒光斑點(diǎn));C1、C2、F1、F2: 造模2周、4周、6周、8周大鼠肝組織的SHP2和α-SMA共表達(dá)(黃色熒光斑點(diǎn),即在體活化HSC的SHP2表達(dá))

四、大鼠肝組織的SHP2表達(dá)

造模不同時(shí)間(2周、4周、6周、8周)大鼠纖維化肝組織的SHP2陽性表達(dá)IOD較對(duì)照組顯著增加(P<0.05),且逐漸升高,P<0.05(圖4、表1)。

A: 對(duì)照組;B: 造模2周; C:造模4周;D: 造模6周;E: 造模8周

五、SHP2表達(dá)與在體HSC活化及增殖的相關(guān)性分析

Pearson’s相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中,不僅肝組織的SHP2免疫組織化學(xué)染色結(jié)果與肝組織的α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果呈顯著正相關(guān)(r值為0.952,P<0.05),而且肝組織中表達(dá)SHP2的活化HSC占總的活化HSC的百分比也與肝組織的α-SMA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果呈顯著正相關(guān)(r值為0.953,P<0.05)。如上所述,α-SMA為活化HSC的標(biāo)志,肝組織的α-SMA表達(dá)水平間接反映在體HSC的活化及增殖。故上述分析結(jié)果提示,在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中,肝組織及在體HSC的SHP2表達(dá)均與在體HSC的活化及增殖呈顯著正相關(guān)。

討 論

SHP2是具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶[5],其在多種惡性腫瘤,如宮頸癌、乳腺癌、口腔癌及肺癌組織中過表達(dá),并可通過促進(jìn)這些腫瘤細(xì)胞的增殖參與上述腫瘤的形成與發(fā)展[9-14]。而對(duì)于SHP2在一些非腫瘤性疾病病理過程的表達(dá)變化及其作用,有研究發(fā)現(xiàn),SHP2過表達(dá)可促進(jìn)在心肌纖維化中起重要作用的心肌成纖維細(xì)胞增殖,這提示SHP2過表達(dá)可能參與了心肌纖維化[15];另有研究顯示,體外活化大鼠HSC的SHP2表達(dá)下調(diào)可使其增殖受到明顯抑制[7],而HSC是參與肝纖維化的最重要細(xì)胞,這提示SHP2可能通過影響HSC增殖參與肝纖維化。本研究顯示,四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織的SHP2表達(dá)隨著肝纖維化的加重逐漸升高。這表明SHP2不僅在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)升高,在纖維化肝組織中表達(dá)也明顯升高,其表達(dá)水平與肝纖維化程度一致。但在肝纖維化過程中隨著纖維化程度的加重,作為肝臟主要固有細(xì)胞的肝細(xì)胞的數(shù)量由于其不斷的變性壞死而逐漸減少,這提示纖維化肝組織中SHP2表達(dá)逐漸升高可能與肝纖維化過程中HSC的SHP2表達(dá)變化有關(guān)。由于α-SMA為活化HSC的標(biāo)志,本研究應(yīng)用SHP2與α-SMA免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)大鼠纖維化肝組織中在體活化肝星狀細(xì)胞的SHP2表達(dá)。通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在大鼠肝纖維化過程中伴隨肝纖維化的進(jìn)展,纖維化肝組織中表達(dá)SHP2的活化HSC占總的活化HSC百分比逐漸升高。這提示在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中,肝組織的SHP2表達(dá)逐漸升高與表達(dá)SHP2的活化HSC逐漸增多有關(guān)。

如上所述,α-SMA 為HSC的活化標(biāo)志,檢測(cè)肝組織的α-SMA表達(dá)水平可間接反映肝組織的在體HSC活化及增殖。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了大鼠纖維化肝組織中α-SMA的表達(dá)變化,結(jié)果顯示,肝組織的α-SMA表達(dá)隨著肝纖維化的進(jìn)展逐漸升高,即隨著肝纖維化程度加重大鼠肝組織中在體HSC的活化及增殖逐漸加快。通過Pearson’s相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中,肝組織及在體HSC的SHP2表達(dá)均與在體HSC的活化及增殖呈顯著正相關(guān)。結(jié)合SHP2在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[9-14],以及已有研究發(fā)現(xiàn),體外活化大鼠HSC的SHP2表達(dá)下調(diào)其增殖受到顯著抑制[7],本研究提示,肝組織及在體HSC的SHP2表達(dá)升高可能通過使HSC的活化及增殖加快參與了肝纖維化病理過程。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。