鄧雨萌 岑蕊言 王利群 何詠磬 楊桂紅 鄧軍 趙艷 唐輝 雷霞

（Keloid fibroblasts，KFB）中叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（Forkhead-like transcription factor 3，F(xiàn)OXP3）對真皮膠原蛋白沉積及纖維化的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：免疫組化檢測瘢痕疙瘩組織中I型膠原蛋白（Collagen type I，COL1）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen type Ⅲ，COL3）、IL-6、TGF-β1、FOXP3的表達(dá)。體外分離培養(yǎng)KFB，并采用腺病毒過表達(dá)FOXP3或給予TGF-β1抑制劑處理。通過Western blot檢測對照組、過表達(dá)組以及對照組和抑制劑組的COL1、COL3的表達(dá)，ELISA檢測TGF-β1、IL-6的表達(dá)，Masson染色觀察膠原沉積情況。結(jié)果：與對照組相比，實驗組中的COL1、COL3、IL-6、TGF-β1蛋白水平升高，F(xiàn)OXP3蛋白水平降低。經(jīng)過表達(dá)FOXP3或TGF-β1抑制劑處理后，KFB的TGF-β1和IL-6表達(dá)降低，膠原蛋白沉積減少。結(jié)論：在KFB中FOXP3可能通過抑制TGF-β1的表達(dá)，減少組織纖維化和膠原蛋白沉積。

[關(guān)鍵詞]瘢痕疙瘩；成纖維細(xì)胞；叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；膠原沉積

[中圖分類號]R751.05? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2023）05-0090-05

A Preliminary Investigation on the Reduction of Collagen Secretion by FOXP3 in Keloid Fibroblasts and Related Mechanisms

DENG Yumeng1，CEN Ruiyan1，WANG Liqun1，HE Yongqing1，YANG Guihong1，DENG Jun2，

ZHAO Yan3，TANG Hui1，LEI Xia1

（1.Department of Dermatology，Daping Hospital Army Medical University，Chongqing 400042，China; 2.Department of Dermatology，Chongqing MINE Medical Beauty Hospital，Chongqing 401121，China; 3.Department of Army Occupational Disease，Daping Hospital，Army Medical University，Chongqing 400042，China）

Abstract： Objective? To investigate the effect of Forkhead-like transcription factor 3 （FOXP3） on dermal collagen deposition and fibrosis in keloid fibroblasts（KFB）and related mechanisms. Methods? Immunohistochemistry was performed to detect the expression of Collagen type I （COL1）， Collagen type III （COL3）， IL-6， TGF-β1， and FOXP3 in keloid tissues. KFB were isolated and cultured in vitro and treated with adenoviral overexpression of FOXP3 or given TGF-β1 inhibitors. The expression of COL1 and COL3 in control and overexpression groups as well as control and inhibitor groups were detected by Western blot， TGF-β1 and IL-6 by ELISA， and collagen deposition was observed by Masson staining. Results? Compared with the control group， the levels of COL1， COL3， IL-6， and TGF-β1 proteins were increased and FOXP3 protein levels were decreased in the experimental group. After treatment with expression of FOXP3 or TGF-β1 inhibitor， TGF-β1 and IL-6 expression in KFB was decreased and collagen deposition was reduced. Conclusion? In KFB FOXP3 may reduce tissue fibrosis and collagen deposition by inhibiting the expression of TGF-β1.

Key words： keloid; fibroblast; forkhead-like transcription factor 3; transforming growth factor β1; collagen deposition

瘢痕疙瘩系皮膚損傷后結(jié)締組織高度增生引起的疾病，病理特征為真皮層膠原蛋白過度沉積和持續(xù)的局部炎癥[1]。該病復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。成纖維細(xì)胞通過分泌COL1和COL3等來促進(jìn)組織修復(fù)，但過度分泌的膠原蛋白是組織纖維化的一個重要因素。此外，慢性炎癥與免疫失調(diào)也能導(dǎo)致組織纖維化的發(fā)生[2]，如：炎癥指標(biāo)IL-6的表達(dá)與纖維化成正比[4]。

既往研究表明，瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞基本處于未成熟狀態(tài)，能高度增殖[4]，并分泌過多的膠原蛋白，且TGF-β/SMAD（轉(zhuǎn)化生長因子-β/白細(xì)胞抑制因子信號通路）通路被過度激活。TGF-β1代表纖維化的程度，由Treg（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）和成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生[5]。與此同時，Treg分泌的FOXP3可通過介導(dǎo)Treg的抑制功能來調(diào)控TGF-β1的表達(dá)[6]。FOXP3可由多種細(xì)胞分泌，如Treg細(xì)胞、腫瘤組織細(xì)胞、非造血干細(xì)胞等[7]，但KFB是否表達(dá)并未見報道。不同組織FOXP3的分泌量也不盡相同。比較特別的是，在瘢痕疙瘩組織中，由于局部免疫失調(diào)，F(xiàn)OXP3的分泌量明顯降低[8]。在瘢痕疙瘩的既往研究中發(fā)現(xiàn)[9]將KFB與含35%Treg細(xì)胞的混合T細(xì)胞群共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)膠原合成明顯減少。本研究擬探索KFB中FOXP3的表達(dá)情況，并通過在KFB中過表達(dá)FOXP3來探討其對真皮膠原蛋白沉積及纖維化的影響及相關(guān)機(jī)制。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料

1.1.1 實驗組：組織標(biāo)本均來源于2018年9月-2022年8月在重慶市瑪恩皮膚醫(yī)院就診并行手術(shù)治療的30例瘢痕疙瘩患者，其中男11例，女19例，平均年齡（29.43±10.12）歲，病程1～5年。納入標(biāo)準(zhǔn)為1992年Darzi診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，年齡20～50歲。以上組織均由HE染色并診斷。

1.1.2 對照組：選擇30例在重慶市瑪恩皮膚醫(yī)院因外傷切除的正常皮膚組織以及行包皮環(huán)切術(shù)后的正常包皮組織患者，其中男11例，女19例，平均年齡（35.46±10.12）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)為無其他系統(tǒng)疾病以及未患其他皮膚病的成年患者，年齡20～50歲。所有患者均簽署知情同意書，且本實驗已通過倫理委員會審批，原則符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑：免疫組化試劑盒、DAB顯色液（北京中杉金橋生物）；cck-8試劑、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白檢測試劑盒、青霉素、鏈霉素（上海碧云天生物）；FBS（胎牛血清）（VivaCell，中國上海）；COL1、COL3、TGF-β1、FOXP3、IL-6、GAPDH（三磷酸甘油醛脫氫酶）一抗（Abcom，美國）；vimentin一抗（CST，美國）；Masson三色染色試劑盒（北京索萊寶科技）；Ad-FOXP3（FOXP3過表達(dá)腺病毒）（上海漢恒生物）；ly2157299，APExBIO；IL-6、TGF-β1因子ELISA試劑盒（武漢博士德生物）；水凝膠原液（陸軍特色醫(yī)學(xué)中心口腔科配置并惠贈）。

1.2.2 KFB細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定：術(shù)后的瘢痕疙瘩組織經(jīng)75%酒精消毒、PBS清洗后剪成0.1 cm2左右的組織塊，在5 mg/ml的中性蛋白酶中4℃消化過夜，次日剝離組織表皮，剪碎剩余的真皮組織，再加入3 mg/ml的I型膠原酶消化2 h，1 500 rpm，離心5 min，將細(xì)胞沉淀用高糖DMEM（含10%FBS+青霉素、鏈霉素）培養(yǎng)基重懸并接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每3 d換液，細(xì)胞融合率達(dá)90%左右傳代[11]。2～5代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。KFB采用波形蛋白（Vimentin）進(jìn)行鑒定。

1.2.3 免疫組化實驗：①組織免疫組化：手術(shù)取得的瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，按常規(guī)方法制成石蠟塊，隨后切片，參照SP法進(jìn)行[12]免疫組化檢測，檢測抗體為COL1、COL3、IL-6、TGF-β1、FOXP3；②KFB細(xì)胞免疫組化：細(xì)胞常規(guī)消化后計數(shù)，以2×105/ml的密度接種到12孔板中行細(xì)胞爬片，24 h后4%多聚甲醛固定48 h，后續(xù)按上述SP法進(jìn)行，檢測抗體為Vimentin、TGF-β1、FOXP3。

1.2.4 Western blot：探索Ad-FOXP3的最佳MOI（感染復(fù)數(shù)）值以及TGF-β抑制劑ly2157299的最佳抑制濃度，分別處理后，提取細(xì)胞蛋白行Western blot實驗，測得處理后的KFB中的FOXP3、COL1、COL3蛋白表達(dá)，結(jié)果經(jīng)Image J軟件分析計算蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 IL-6、TGF-β1因子ELISA實驗：Ad-FOXP3和ly2157299分別處理KFB后，收集上清液，按照準(zhǔn)備樣品、抗體反應(yīng)、洗板、顯色、終止反應(yīng)的步驟行ELISA實驗，觀察IL-6、TGF-β1的表達(dá)情況。

1.2.6 Masson三色染色：Ad-FOXP3和ly2157299分別處理KFB，以5×105的細(xì)胞密度接種到水凝膠中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，常規(guī)方法制作成蠟塊，切片行Masson染色。觀察處理前后膠原蛋白的表達(dá)分泌。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GraphPad Prism 8軟件畫圖，計量資料用（x?±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析，如數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性及方差齊性，則使用非參數(shù)檢驗。P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 兩組組織中膠原蛋白和IL-6的表達(dá)：免疫組化染色顯示，COL1、COL3與IL-6均表達(dá)于瘢痕疙瘩的真皮層，且實驗組COL1、COL3與IL-6的陽性率分別為（29.53±3.52）%、（17.67±3.14）%、（15.80±3.32）%，均顯著高于對照組的（13.39±2.04）%、（5.06±1.34）%、（4.80±1.66）%，差異均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。表明瘢痕疙瘩組真皮組織中COL1、COL3與IL-6表達(dá)明顯升高。見圖1。

2.2 瘢痕疙瘩組織和KFB中FOXP3和TGF-β1的表達(dá)：TGF-β1和FOXP3在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)情況如圖2A、B所示，TGF-β1、FOXP3均在瘢痕疙瘩組織的真皮層顯示陽性。與對照組相比，實驗組的TGF-β1的陽性率為（15.94±2.83）%，顯著高于對照組（4.67±1.44）%，差異均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。而FOXP3實驗組的陽性率為（1.84±0.44）%，顯著低于對照組（8.45±0.87）%，差異均具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.0001）。體外培養(yǎng)的KFB行Vimentin染色后，所有的細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)陽性，證明所提取的KFB為成纖維細(xì)胞（見圖2C）。TGF-β1和FOXP3在KFB中的表達(dá)情況如圖2D所示，TGF-β1、FOXP3在KFB的胞質(zhì)中均呈陽性，表明KFB中有TGF-β1和FOXP3表達(dá)。

2.3 過表達(dá)FOXP3后KFB中膠原蛋白、TGF-β1和IL-6的表達(dá)：采用腺病毒感染KFB使其過表達(dá)FOXP3并使用免疫熒光探的最佳MOI值（見圖3A），然后用ELISA檢測TGF-β1、IL-6的表達(dá)情況如圖3B所示，過表達(dá)組TGF-β1的含量為（366.50±118.20）pg/ml、IL-6的含量為（26.21±4.38）pg/ml，均顯著低于對照組的TGF-β1含量（670.30±112.70）pg/ml、IL-6含量（47.93±7.82）pg/ml，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。證實TGF-β1、IL-6的分泌下降。過表達(dá)FOXP3后KFB的膠原蛋白表達(dá)情況如圖3C、D所示，過表達(dá)組中兩種膠原蛋白的表達(dá)量均顯著低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。將過表達(dá)處理后的KFB制作成水凝膠后行Masson染色，從圖3E、F可見，過表達(dá)組中顯示膠原纖維的藍(lán)色區(qū)域較對照組明顯減少，進(jìn)一步驗證了Western blot的實驗結(jié)果。

2.4 ly2157299抑制TGF-β1后KFB中IL-6以及膠原蛋白的表達(dá)：在KFB中加入TGF-β1抑制劑ly2157299，先用CCK-8探的不同抑制濃度下的細(xì)胞的存活（見圖4A）。ELISA檢測結(jié)果顯示，TGF-β1、IL-6隨著抑制劑濃度增加表達(dá)量逐漸下降，TGF-β1在KFB、1μM抑制劑組、2μM抑制劑組、3μM抑制劑組的表達(dá)量分別為（245.20±23.16）pg/ml、（209.30±52.18）pg/ml、（208.20±37.36）pg/ml、（132.30±24.41）pg/ml；IL-6在KFB、1μM抑制劑組、2μM抑制劑組、3μM抑制劑組的表達(dá)量分別為（666.20±24.34）pg/ml、（640.70±11.74）pg/ml、（585.70±41.64）pg/ml、（133.00±25.44）pg/ml（見圖4D）。Western blot證實膠原蛋白的表達(dá)下降（見圖4B、C），水凝膠Masson染色實驗中觀察結(jié)果膠原蛋白的沉積，藍(lán)色區(qū)域即膠原纖維隨著抑制劑濃度的增加逐步減少，與Western blot結(jié)果一致（見圖4E、F）。

3? 討論

瘢痕疙瘩作為一種復(fù)發(fā)率高的疾病，在給患者生活帶來影響的同時也造成了心理負(fù)擔(dān)。其形成的作用機(jī)制主要是TGF-β/SAMD通路的過度活化，促進(jìn)了纖維化及膠原蛋白的沉積[13]。此外，瘢痕疙瘩中慢性炎癥的持續(xù)存在也促進(jìn)了該病持續(xù)不斷的纖維化和膠原蛋白沉積[14]，同時累及周圍正常皮膚表現(xiàn)出“瘢痕疙瘩化”現(xiàn)象[15]。

FOXP3作為Treg細(xì)胞的一個重要分泌蛋白，在瘢痕疙瘩中的表達(dá)顯著下降，這種異常的低表達(dá)提示其在發(fā)病中可能發(fā)揮重要作用，值得進(jìn)一步研究。FOXP3可以調(diào)節(jié)許多免疫效應(yīng)，當(dāng)它的表達(dá)下降時會抑制Treg細(xì)胞的分化[16]，這種異常作用的Treg細(xì)胞會進(jìn)一步激活成纖維細(xì)胞使其過度增殖[17]。所以我們推測，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的過度增殖可能與Treg細(xì)胞分泌的FOXP3含量相關(guān)。且前文也提到FOXP3能夠調(diào)控TGF-β1的分泌，那么在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中是否也有同樣的調(diào)控作用，這需要進(jìn)一步研究來進(jìn)行證實。從組織的免疫組化實驗結(jié)果可知，瘢痕疙瘩中FOXP3的表達(dá)是明顯下降的，故而進(jìn)一步推斷，F(xiàn)OXP3的低表達(dá)可能是影響成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白的原因之一。從分子層面上來講，在瘢痕形成中作為重要因子的TGF-β1主要由成纖維細(xì)胞分泌，過度增殖的成纖維細(xì)胞會產(chǎn)生較多的TGF-β1因子，在激活炎癥反應(yīng)的同時也以自分泌的方式產(chǎn)生更多的TGF-β1[18]，同時炎癥反應(yīng)的激活也能夠進(jìn)一步導(dǎo)致纖維化的產(chǎn)生，成為瘢痕疙瘩持續(xù)存在的一個原因。從發(fā)病機(jī)制上來說，TGF-β1的不斷產(chǎn)生，也使得其過度活化，導(dǎo)致局部免疫失調(diào)，在TGF-β/SMAD信號通路上不斷傳導(dǎo)TGF-β1的信號以產(chǎn)生更多的膠原蛋白[19]。抑制TGF-β1的不斷產(chǎn)生則可以抑制成纖維細(xì)胞的膠原分泌，從本次實驗結(jié)果中可知，過表達(dá)FOXP3可以抑制TGF-β1因子的過度活化，并抑制炎癥因子IL-6的產(chǎn)生，阻止KFB過多地分泌膠原蛋白，從而抑制纖維化。

綜上，通過本研究證實，過表達(dá)FOXP3很可能通過抑制TGF-β1通路活化從而減少膠原蛋白沉積和炎癥因子IL-6的表達(dá)，但是是否能作用于TGF-β/SAMD通路，并影響SMAD相關(guān)因子的表達(dá)，則需要進(jìn)一步進(jìn)行研究，同時該實驗的發(fā)現(xiàn)為治療瘢痕疙瘩提供一個思路，在局部過表達(dá)FOXP3后可以減少瘢痕疙瘩內(nèi)膠原蛋白的沉積以及炎癥因子的表達(dá)，這在以后的治療中可能會成為一個新的靶點。

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[收稿日期]2022-09-21

本文引用格式：鄧雨萌，岑蕊言，王利群，等.FOXP3減少瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的膠原分泌及相關(guān)機(jī)制初探[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2023，32（5）：90-95.