陳諾，金華，呼琴，王億平，劉敏，張葉青

1 安徽中醫(yī)藥大學研究生院 安徽合肥 230012

2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為一個嚴重威脅人類健康的重要疾病。CKD 的病理基礎(chǔ)是腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF），最終導致終末期腎臟?。‥nd-stage renal disease，ESRD）的出現(xiàn)。氧化應(yīng)激在CKD 病情進展中扮演十分重要的角色，是RIF 發(fā)生的重要病理機制[1]。Nrf2/ARE 信號通路在抗炎、抗氧化、抑制細胞死亡和促進血管生成中發(fā)揮重要作用，是體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的活性通路，有望為腎病的診斷和治療提供新的靶標[2]。

中醫(yī)藥在治療慢性腎衰竭等慢性疾病方面具有顯著療效，可有效延緩其進展[1]。清腎顆粒是安徽省名中醫(yī)、安徽省中醫(yī)藥領(lǐng)軍人才王億平教授的臨床基礎(chǔ)經(jīng)驗方。前期臨床研究已證實[1，3]，CKD 濕熱證患者體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增強，清腎顆粒不但具有清熱化濕祛瘀功效，而且可以抑制CKD 患者的氧化應(yīng)激，增強抗氧化能力，進而延緩腎纖維化的進展。為進一步了解清腎顆粒在腎纖維化中的作用，本研究通過腺嘌呤誘導大鼠腎纖維化，通過Nrf2/ARE 途徑闡明其作用機理。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 2 月齡SPF 級雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（200±10）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCKX（京）2019-0010，NO.110324210103597984。動物相關(guān)處置均符合《中華人民共和國實驗動物管理條例》要求。

1.2 實驗藥物與試劑 清腎顆粒由生大黃、茵陳、黃連、白花蛇舌草、丹參、澤瀉等藥物組成，由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑（皖藥制字BZ20080011），10g/袋（約含生藥34g）。

1.3 主要試劑 腺嘌呤購自Solarbio；SCr、BUN、UA試劑盒均購自南京建成生物工程研究院；PBS 試劑購自Hyclone；ROS 購自碧云天；兔抗Nrf-2 抗體購自Bioss；GAPDH 購自Zsbio；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG 購自Zsbio。

2 方法

2.1 造模 選用SPF 級SD 大鼠50 只，在7d 內(nèi)進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，將其隨機分為正常組、模型組、清腎顆粒低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組之外，其他各組大鼠均建立腺嘌呤腎纖維化模型。在100ml 生理鹽水中加入2.5g 的腺嘌呤，制成濃度為2.5%懸浮液，灌胃給藥，劑量為200mg·kg-1·d-1（即0.8mL·100g-1·d-1）。腺嘌呤容易沉淀，所以在灌胃操作中，一定要將腺嘌呤懸濁液混合均勻，以備隨時使用。正常組大鼠連續(xù)28d 每日給予相同劑量生理鹽水灌胃1 次。

2.2 分組及給藥 從造模后第1 天開始，每天以4mL給藥1 次，持續(xù)12 周。清腎顆粒高、中、低劑量組分別 按16.0g·kg-1·d-1、8.0g·kg-1·d-1、4.0g·kg-1·d-1的 劑量灌胃，而正常組和模型組則給予同等劑量的生理鹽水。

2.3 動物取材方法 在最后1 次給藥12h 后，每組大鼠用2.5mL·kg-12%戊巴比妥鈉麻醉，并將其置于手術(shù)臺上，打開腹腔，于腹主動脈無菌采血，離心并分離血清，取血清，于-80℃下貯存，測定SCr，BUN，UA 等各項指標。切除大鼠雙腎并記錄重量，修剪組織，并于0.9%的生理鹽水中清洗，分離后一部分腎組織并迅速放入液氮中，隨后移至-80℃的冰箱中保存，蛋白含量通過Western blot 測定。剩余腎臟置于4%多聚甲醛內(nèi)保存，做好病理學檢查的準備。采集各組大鼠標本后，處死并放于醫(yī)療垃圾袋中，將其送交安徽中醫(yī)藥大學科研實驗中心進行集中處置。

2.4 腎臟組織病理學檢查 由專業(yè)技術(shù)人員指導制備腎臟組織石蠟切片，根據(jù) HE、MASSON 的試劑盒說明書進行染色。封片后，用光學顯微鏡觀察腎臟組織的病理變化程度。

2.5 血生化相關(guān)指標檢測 取出血清，檢測SCr、BUN、UA 等的含量，操作嚴格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2.6 腎臟相關(guān)指標檢測

2.6.1 ROS（活性氧含量）檢測 取腎組織細胞，根據(jù)活性氧檢測試劑盒的說明，用流式細胞術(shù)測定活性氧水平。

2.6.2 Western Blot 法檢測 稱取定量大鼠腎組織，用RIPA 裂解液提取總蛋白。運用BCA 法檢測蛋白濃度。主要步驟如下：首先，通過分離凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)模完畢之后，加入Western 封閉液（5%脫脂奶粉）室溫封閉2h；隨后加入一抗Nrf2（1∶1000 稀釋）、HO-1（1∶500 稀釋）、4℃孵育過夜，TBST 洗滌3 次后，室溫孵育HRP 標記的兔二抗（1∶20000 稀釋）1.2h；使用ECL 發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。采用Image J 軟件進行膠片條帶的分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理運用SPSS23.0 進行分析。計量資料用（±s）表示；2 組之間使用t 檢驗進行比較；運用單因素方差分析進行多組間比較；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則進行非參數(shù)檢驗；采用卡方檢驗或Fisher 精確概率法對計數(shù)資料進行統(tǒng)計。P＜0.05 被視為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠一般情況

實驗過程中由于灌胃不當出血致死2 只，1 只因麻醉藥物過量而死亡，1 只死因不明。最終正常組有10 只大鼠、模型組存活8 只、清腎顆粒高劑量組存活9 只、中劑量組有10 只大鼠、低劑量組還剩下9 只。正常組大鼠狀態(tài)良好，飲食正常，活動好，反應(yīng)靈敏，體毛光滑有光澤，體重、飲食量以及飲水量正常。正常組大鼠精神、進食、活動、體重、飲食及飲水量均正常、反應(yīng)敏捷、體毛光亮。模型組大鼠較正常組大鼠精神、進食、活動、體重、飲食及飲水量均不佳，反應(yīng)遲鈍，體毛雜亂黯淡。各治療組大鼠精神、活動、皮毛狀態(tài)較模型組大鼠均有明顯的改善。

2 各組大鼠腎功能指標的變化

與正常組比較，模型組大鼠BUN、Scr 和UA 濃度均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒低、中、高劑量組大鼠BUN、Scr 和UA 濃度均顯著下降（P＜0.05）；且清腎顆粒高劑量組的BUN、Scr 和UA濃度顯著低于中、低劑量組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠BUN、Scr 和UA 比較（±s）

表1 各組大鼠BUN、Scr 和UA 比較（±s）

組別 只數(shù) Scr/μmol·L-1 BUN/mmol·L-1 UA/μmol·L-1正常組 10 30.29±2.32 5.96±0.23 59.12±4.43模型組 8 99.82±4.30 13.04±0.22 110.10±3.98清腎顆粒低劑量組 9 88.30±2.75 9.19±0.26 97.35±3.45清腎顆粒中劑量組 10 82.29±2.69 8.60±0.28 90.38±2.93清腎顆粒高劑量組 9 78.14±2.90 7.11±0.24 84.89±4.44

3 各組大鼠腎組織中ROS 含量的比較

與正常組比較，模型組大鼠腎組織ROS 含量升高（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒低、中、高劑量組ROS 含量均顯著下降（P＜0.05）；且清腎顆粒高劑量組的ROS 含量顯著低于中、低劑量組（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 各組細胞ROS 平均熒光強度比較（±s）相關(guān)柱狀

表2 各組細胞ROS 平均熒光強度比較（±s）

表2 各組細胞ROS 平均熒光強度比較（±s）

組別 只數(shù) ROS（平均熒光強度）正常組 10 27528.00±725.34模型組 8 70046.00±998.25清腎顆粒低劑量組 9 63924.67±689.77清腎顆粒中劑量組 10 48261.33±1750.50清腎顆粒高劑量組 9 35113.00±1065.53

4 各組大鼠腎組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達比較

與正常組比較，模型組大鼠的Nrf2、HO-1 蛋白表達均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，清腎顆粒低、中、高劑量組大鼠Nrf2、HO-1 蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）；且清腎顆粒高劑量組的Nrf2、HO-1 蛋白表達程度顯著高于中、低劑量組（P＜0.05）。見表3，圖2。

圖2 各組大鼠蛋白電泳

表3 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠腎組織Nrf2、HO-1 蛋白表達比較（±s）

分組 只數(shù) Nrf2 HO-1正常組 10 1.13±0.18 1.04±0.05模型組 8 0.11±0.02 0.25±0.13清腎顆粒低劑量組 9 0.21±0.07 0.36±0.13清腎顆粒中劑量組 10 0.40±0.10 0.57±0.05清腎顆粒高劑量組 9 0.60±0.16 0.72±0.01

5 各組大鼠的腎臟病理改變

正常組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見異常。模型組正常腎小球數(shù)目明顯下降數(shù)量顯著減少，腎小球內(nèi)可見系膜基質(zhì)增多和系膜細胞增生，伴有部分腎小球萎縮或代償性肥大；腎小管萎縮，小管上皮細胞腫脹、脫落，部分管腔有明顯擴張，內(nèi)可見棕褐色腺嘌呤結(jié)晶沉積；腎間質(zhì)增寬，成纖維細胞及膠原纖維增多，單核、淋巴細胞明顯浸潤，藍染膠原纖維分布于纖維化區(qū)域。各治療組與模型組比較，上述病理改變有所減輕。見圖3。

圖3 A 各組大鼠的腎臟病理改變

圖3 B 各組大鼠的腎臟病理改變

討 論

慢性腎衰竭在中國古代文獻中并無與之相適應(yīng)的病名，近代醫(yī)學文獻將其納入“水腫”“關(guān)格”“癃閉”“虛勞”等范疇[4]。諸多醫(yī)家均把濕熱郁滯作為腎病的主因，是慢性腎病的始動因素，因此在治療中應(yīng)突出清利濕熱[5]。王億平教授根據(jù)慢性腎衰的病機特征自擬“清腎顆?！保渥饔檬乔鍩峄瘽?，活血祛瘀[6]。本方中，生大黃瀉熱逐瘀，蕩滌胃腸濕熱瘀毒，為君藥；白花蛇舌草清熱解毒利濕，茵陳清利濕熱，黃連清熱燥濕，瀉火解毒，三藥合用共為臣藥；佐以茯苓、白術(shù)、白豆蔻、薏苡仁、扁豆、豬苓、澤瀉、車前草健脾益氣、利水滲濕消腫;并輔以益母草和丹參活血化瘀。這些藥物合用，具有清熱化濕祛瘀之功。

本研究所選擇的腺嘌呤誘導CRF 大鼠模型是實驗中常用的CRF 動物模型，大鼠長期給予腺嘌呤灌胃可沉積于腎小管及間質(zhì)引起堵塞，產(chǎn)生類似人類CRF代謝異常，在生物化學和形態(tài)學上都與人類CRF 相似，與單側(cè)輸尿管梗阻、馬兜鈴酸腎病等其他腎間質(zhì)纖維化模型相比較，腺嘌呤大鼠的腎小管損傷更為嚴重。因此腺嘌呤CRF 模型對腎間質(zhì)纖維化、慢性間質(zhì)性腎炎和局灶節(jié)段性腎小球硬化的研究有一定的參考價值[7]。血肌酐、尿素氮、尿酸這些腎臟損害的指標在腎功能受損的情況下會在血液中蓄積[8]。在腺嘌呤灌胃后，模型組大鼠血液Scr、BUN 和UA 濃度升高，并且腎組織出現(xiàn)了腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化、炎性細胞浸潤等病理學變化，提示造模成功。在予不同濃度清腎顆粒后，大鼠血液中Scr、BUN 和UA 明顯降低，腎臟組織病理學變化得到改善，表明清腎顆粒具有抗腎臟纖維化作用，與其他研究結(jié)論一致［9］。

氧化應(yīng)激（oxdative stress），指氧化劑（活性氧（ROS）、活性氮（RNS）、自由基）與抗氧化劑之間的氧化還原平衡失衡[10]。體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)在正常情況下維持著動態(tài)平衡。但是這種平衡狀態(tài)在機體發(fā)生病變時被打破[11]。Patricia Tomás-Simó 等[12]研究發(fā)現(xiàn)與健康個體相比，CKD 患者表現(xiàn)出明顯更高的氧化應(yīng)激水平，并且隨著eGFR 的下降，這些變化加劇，在CKD 分期之間具有顯著差異，并隨著病情惡化而增加，同時抗氧化能力下降。前期研究證實[13-14]，活性氧（ROS）通過氧化應(yīng)激反應(yīng)介導NF-κB 活化，進而激活炎癥因子，誘導人腎小管上皮細胞（HK-2）轉(zhuǎn)分化和加速腎纖維化大鼠的RIF 進程；清腎顆粒能夠通過抗氧化機制，減輕腎小管損傷，抑制腎小管EMT，延緩RIF 進展。

Nrf2-ARE 信號通路是抗氧化應(yīng)激的經(jīng)典信號通路。在基礎(chǔ)條件下，Nrf2 通過結(jié)合其主要抑制劑Keap-1 而保持轉(zhuǎn)錄活性，Keap-1 針對Nrf2 進行蛋白酶體降解，維持在細胞質(zhì)中。在氧化應(yīng)激環(huán)境中，Nrf2與Keap1 從細胞質(zhì)中分離并向核內(nèi)遷移，并與Maf 形成異源二聚體（ARE）共同作用，激活Nrf2-ARE 信號途徑，從而激活下游的許多保護基因（如血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）、對氧磷酶（PON）-1等）的轉(zhuǎn)錄，進而抵御各種刺激引起的氧化應(yīng)激損害[15-17]。此次研究發(fā)現(xiàn)，腺嘌呤慢性腎衰竭大鼠腎組織中的總Nrf2、核Nrf2、HO-1 等蛋白表達水平顯著降低，考慮Nrf2 激活及其下游抗氧化分子在慢性腎衰竭腎組織中的反常減少。這可能與尿毒癥動物對氧化應(yīng)激和炎癥的生物反應(yīng)能力受損，以及它們對殘腎的破壞性后果，這與前期研究結(jié)果一致[18-21]。

本研究結(jié)果表明，清腎顆?？山档拖汆堰誓I纖維化大鼠血清中SCr、BUN、UA 含量，減輕腎組織病理損傷；并且還可以顯著增加腺嘌呤腎纖維化大鼠腎組織中Nrf2、HO-1 蛋白表達量，提示清腎顆粒具有抗氧化應(yīng)激的能力，其作用機制可能與Nrf2/ARE 信號通路的激活有關(guān)，從而保護腎臟并延緩腎纖維化進程。這為清腎顆粒治療慢性腎衰竭的臨床應(yīng)用提供科學理論依據(jù)。