吳雙，李家興，王雯澌，劉艷霞，徐巍巍，劉俊康

陸軍軍醫(yī)大學(xué)生藥學(xué)與中藥學(xué)教研室 重慶 400038

慢性腎小球腎炎（Chronic glomerulonephritis，CGN）大多起源于免疫介導(dǎo)的炎癥，以血尿、蛋白尿、水腫及高血壓為典型臨床表現(xiàn)，并且具有病程長、難以自愈特點(diǎn)，若治療不當(dāng)，最終可發(fā)展為慢性腎衰竭[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于慢性腎小球腎炎的治療，主要采取糾正高血壓、調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、抗血小板凝聚和積極控制感染等策略[2]，但是上述治療難以取得滿意效果。而中醫(yī)學(xué)在慢性腎小球腎炎的治療中具有巨大的潛力[3]。慢性腎小球腎炎在中醫(yī)古籍中并無明確病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其將歸為“水腫”“腰痛”“腎風(fēng)”等范疇[4]。張仲景的《金匱要略》曾記載：“虛勞腰痛，少腹拘急，小便不利者，八味腎氣丸主之”[5]。 腎主水，腎氣虧虛，水液代謝受阻，引發(fā)或加重水腫，腰為腎之府，腎氣虧虛腎府失榮，不榮則痛[6]。因其出自《金匱要略》，后世也常將文中的八味腎氣丸稱作金匱腎氣丸。而實(shí)際上，目前市場上中成藥金匱腎氣丸并非仲景金匱腎氣丸，則是接近添加了牛膝和車前子的濟(jì)生腎氣丸；接近仲景金匱腎氣丸的中成藥替代品當(dāng)屬桂附地黃丸[7]。

雖然目前傳統(tǒng)中醫(yī)藥已經(jīng)在治療腎臟慢性疾病上有顯著成效，但是仍缺乏一套完整的解釋理論和標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，能見其效，不見其因，以致很多人存懷疑態(tài)度。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種運(yùn)用現(xiàn)代網(wǎng)絡(luò)方法分析藥物與疾病和靶點(diǎn)之間“多成分、多靶點(diǎn)、多途徑”協(xié)同作用關(guān)系的藥理學(xué)方法[8]。本文運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，利用公開數(shù)據(jù)信息庫挖掘出目前臨床上較為常用于治療腎臟疾病的藥物——金匱腎氣丸和桂附地黃丸的有效成分、中藥靶標(biāo)、疾病靶標(biāo)，構(gòu)建“藥物-成分-靶標(biāo)-疾病”的拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)并比較金匱腎氣丸和桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎的作用差異，推測(cè)其可能存在的分子作用靶點(diǎn)和通路，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供理論支持[9]。

資料與方法

1 材料

TCMSP 數(shù)據(jù)庫是獲得藥物和靶點(diǎn)關(guān)系的中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)；Uniprot 數(shù)據(jù)庫是全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫。人類基因數(shù)據(jù)庫Genecard 和人類在線孟德爾遺傳平臺(tái)OMIM 是收集疾病相關(guān)的基因的數(shù)據(jù)庫。String 數(shù)據(jù)庫是檢索和圖像化已知蛋白和預(yù)測(cè)蛋白之間互作關(guān)系的系統(tǒng)。Cytoscape 是可以對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析的軟件。

2 方法

2.1 桂附地黃丸和金匱腎氣丸主要成分和靶點(diǎn)的檢索和篩選 登錄中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)TCMSP，根據(jù)2020 版《中國藥典》中所述，分別以肉桂、澤瀉、山茱萸、茯苓，附子、山藥、牡丹皮、熟地黃為關(guān)鍵詞[10]檢索桂附地黃丸中有效成分。將成分通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫的藥物口服利用度（OB）和類藥性（DL）等參數(shù)作為篩選條件。其中OB 是衡量藥物口服后，經(jīng)胃腸道被吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的指標(biāo)，DL 是衡量藥物臨床療效的指標(biāo)。在對(duì)中藥進(jìn)行研究的過程中將OB ≥30%和DL ≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[11]。使用同樣的方法，根據(jù)采用《中藥成方制劑》中所述，對(duì)今方金匱腎氣丸的主要成分（桂枝、山藥、附子、山茱萸、熟地黃、茯苓、澤瀉、牡丹皮、牛膝、車前子）[12]進(jìn)行查詢并篩選。并利用已發(fā)表的文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充與活性化合物相關(guān)的已知靶點(diǎn)。然后，將收集到的活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入到Uniprot 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定“Homo sapiens”（人屬）為關(guān)鍵詞，實(shí)現(xiàn)蛋白到基因名稱的轉(zhuǎn)化。

2.2 慢性腎小球腎炎相關(guān)靶點(diǎn)的查詢和匹配 在Genecards 數(shù)據(jù)庫和OMIM 數(shù)據(jù)庫以“慢性腎小球腎炎”的相關(guān)英文名稱“chronic glomerulonephritis”“chronic nephritis” “CGN”“CKD”等為關(guān)鍵詞檢索相關(guān)靶點(diǎn)蛋白，去除重復(fù)部分。將桂附地黃丸有效靶點(diǎn)與慢性腎小球腎炎相關(guān)靶點(diǎn)的關(guān)系進(jìn)行分別對(duì)應(yīng)，對(duì)比篩選出藥物和疾病共同的潛在靶點(diǎn)基因，并利用R語言及程序包VennDiagram 展示韋恩圖。并利用同樣方法繪制出金匱腎氣丸中靶點(diǎn)基因和疾病基因的交集。

2.3 Cytoscape 網(wǎng)絡(luò)的繪制 將上述查詢整理的藥物及有效成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape 軟件進(jìn)行處理使之可視化，構(gòu)建出藥物-有效成分-靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)。每一個(gè)節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)的直接作用數(shù)量由自由度來表示，即自由度與生物學(xué)功能和重要性呈正相關(guān)[13]。

2.4 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò) 將上述篩選出的交集靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫，以最低相互作用閾值等于0.4和“Human Sapiens”為蛋白質(zhì)種類篩選交集基因，去除沒有相關(guān)性的靶蛋白，建立PPI 網(wǎng)絡(luò)，用以描述桂附地黃丸有效成分與慢性腎小球腎炎靶點(diǎn)。同理構(gòu)建出金匱腎氣丸的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并統(tǒng)計(jì)兩者的前15 節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名。

2.5 KEGG 信號(hào)通路富集和GO 功能分析 使用KEGG 數(shù)據(jù)庫對(duì)重要靶點(diǎn)基因進(jìn)行富集分析，篩選出信號(hào)通路滿足P，Q ≤0.05，并運(yùn)用R 語言包進(jìn)行顯示。再利用R 語言中的BiocManager 包和enrichGO 包對(duì)慢性腎小球腎炎潛在靶點(diǎn)分別和桂附與金匱的有效成分進(jìn)行GO 分析，并以氣泡圖進(jìn)行描述。

結(jié) 果

1 篩選的活性成分和預(yù)測(cè)的靶標(biāo)

以上文對(duì)OB 和DL 值的限定，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫對(duì)桂附地黃丸和金匱腎氣丸進(jìn)行檢索，去重后得到核心活性成分，如圖1（a）（b）所示。

圖1 （a） 桂附地黃丸成分?jǐn)?shù)據(jù)

圖1 （b） 金匱腎氣丸成分?jǐn)?shù)據(jù)

2 藥物-疾病共同靶標(biāo)結(jié)果

桂附地黃丸和金匱腎氣丸的韋恩圖如圖2（a）（b）所示。其中慢性腎小球腎炎的靶標(biāo)基因?yàn)?849 個(gè)，桂附地黃丸和金匱腎氣丸的靶標(biāo)基因分別為137 個(gè)和230 個(gè)，取交集后，治療靶點(diǎn)為58 和111 個(gè)。

圖2 （a）

圖2 （b）

3 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖繪制結(jié)果

如圖3（a）（b）所示。每一個(gè)節(jié)點(diǎn)用不同顏色表示，紅色，綠色和藍(lán)色節(jié)點(diǎn)分別代表藥物，活性成分和作用靶點(diǎn)。點(diǎn)與點(diǎn)之間的連線代表了兩者之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。圖3（a）為桂附地黃丸的藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，包括7 個(gè)發(fā)揮作用的藥材，47 種藥材中的活性成分，137 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)和1 種相關(guān)疾病，共計(jì)192 個(gè)節(jié)點(diǎn)和500 條連線。圖3（b）為金匱腎氣丸的藥物-靶點(diǎn)-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)，包括10 個(gè)發(fā)揮作用的藥材，81 種藥材中的活性成分，232 個(gè)藥物作用靶點(diǎn)和1 種相關(guān)疾病，共計(jì)324 個(gè)節(jié)點(diǎn)和895 條連線。

圖3 （a）

圖3 （b）

4 共同靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析

根據(jù)STRING 網(wǎng)站對(duì)篩選出來的治療慢性腎小球腎炎靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分析得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖見圖4（a）（b）。如圖4（a）所示桂附地黃丸57 種共同靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，如圖4（b）所示金匱腎氣丸相互作用的110 個(gè)靶蛋白，節(jié)點(diǎn)和邊分別代表了靶蛋白和蛋白的互相關(guān)系，包括有既往實(shí)驗(yàn)證明、基因共表達(dá)、基因共現(xiàn)、蛋白質(zhì)同源、基因鄰接、基因融合等，桂附地黃丸和金匱腎氣丸的前15 節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名見于圖5（a）（b）。

圖4 （a）

圖4 （b）

圖5 （a） 桂附地黃丸靶蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名（示前15）

圖5 （b） 金匱腎氣丸靶蛋白節(jié)點(diǎn)數(shù)目排名（示前15）

5 共同靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析和GO 功能富集

根據(jù)KEGG 分析結(jié)果桂附地黃丸和金匱腎氣丸抗慢性腎小球腎炎預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的通路分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別有150 條和167 條KEGG 代謝通路參與其中，圖6（a）（b）列舉了排在前面的15 條通路。以動(dòng)脈粥樣硬化與脂質(zhì)相關(guān)的信號(hào)通路為例，示桂附腎氣丸和金匱地黃丸主要作用靶點(diǎn)的具體機(jī)制見圖7（a）（b）。

圖6 （a） 金匱腎氣丸KEGG 信號(hào)通路分析

圖6 （a） 桂附地黃丸KEGG 信號(hào)通路分析

圖7 （a）

圖7 （b）

圖8（a）（b）展示GO 分析氣泡圖。生物過程由縱坐標(biāo)表示，基因數(shù)量由橫坐標(biāo)和氣泡的面積大小共同決定。P 值越小，氣泡紅色越深。

圖8 （a）

圖8 （a）

討 論

通過藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)可發(fā)現(xiàn)，桂附地黃丸的網(wǎng)絡(luò)中，自由度較高的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，提示這些成分可能是桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的物質(zhì)基礎(chǔ)；自由度較高的靶點(diǎn)是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、NR3C2、HSP90、ADRA1B，提示這些靶點(diǎn)可能是桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。而在金匱腎氣丸的網(wǎng)絡(luò)中，作用靶點(diǎn)較多的活性成分是kaempferol、beta-sitosterol、Stigmasterol、Tetrahydroalstonine、Kadsurenone，連接活性成分和通路較多的靶點(diǎn)是NCOA2、PTGS2、PTGS1、PGR、HSP90、NR3C2、ADRA1B。通過對(duì)比兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)圖，可以初步發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸和桂附地黃丸在主要作用的活性成分和潛在靶點(diǎn)上效果基本類似。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)中可見，在桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎中，可能是作用于TNF、AKT1、VEGFA、PPARG、CASP3、PTGS2、JUN 等核心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。而在金匱腎氣丸治療慢性腎小球腎炎中，可能是作用于TNF、ATK1、IL-6、VEGFA、IL1-β、JUN、CASP3等核心靶點(diǎn)發(fā)揮作用。其中兩者都包括的相互作用較為密切的蛋白有TNF、AKT1、VEGFA、PPARG 和CASP3 等。其中，TNF 可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，在自身免疫疾病和炎癥中發(fā)揮重要作用[14]，通過調(diào)控TNF-α可以保護(hù)腎臟[15]；VEGFA 可以抑制細(xì)胞凋亡，參與血管通透性調(diào)節(jié)[16]；PPARG 在參與激活某種受體，進(jìn)而促進(jìn)過氧化物酶體增殖中發(fā)揮重要作用[17]；CASP3 參與負(fù)責(zé)凋亡執(zhí)行的半胱天冬酶的激活級(jí)聯(lián)[18]。兩者藥物的靶點(diǎn)都主要涉及炎癥物質(zhì)產(chǎn)生，細(xì)胞生長與凋亡，脂質(zhì)代謝，下游基因轉(zhuǎn)錄等方面，由此我們可以推測(cè)兩種藥方可能通過抑制細(xì)胞凋亡，降低炎癥反應(yīng)，改善腎血管通透性等方面來減輕腎臟損傷。

在GO 富集和KEGG 通路富集中，兩者排名較前且有分子作用價(jià)值的通路都有脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路、AGE-RAGE、乙肝、化學(xué)致癌受體激活、PI3K/Akt、EB 病毒感染、人乳頭瘤病毒感染、HIF-1、TNF 等信號(hào)通路。通過介導(dǎo)AGE-RAGE、TNF、PI3K/AKT、HIF-1 等這些信號(hào)通路，桂附地黃丸和金匱腎氣丸參與了機(jī)體脂質(zhì)和糖類代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、營養(yǎng)水平、抗細(xì)菌病毒、抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程以發(fā)揮其治療效果。綜合兩者的蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)和KEGG 通路富集分析中可見，慢性腎小球腎炎的發(fā)生存在眾多的核心靶基因，其中與TNF、AKT1、VEGFA、CASP3、JUN 等關(guān)系最為密切，其發(fā)病信號(hào)通路主要包括AGE-RAGE、TNF、PI3K/Akt、HIF-1 通路等。對(duì)比金匱腎氣丸的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，我們不難發(fā)現(xiàn)不論是金匱腎氣丸，還是桂附地黃丸，在調(diào)節(jié)血脂異常，抑制動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊形成、抑制細(xì)胞異常凋亡、調(diào)節(jié)腎臟對(duì)尿糖的過濾和重吸收，防止腎性糖尿病的發(fā)生、防止抗原免疫復(fù)合物在腎小球的沉積發(fā)揮了相同的作用。

但是，仔細(xì)對(duì)比兩者KEGG 通路可以發(fā)現(xiàn)，一方面金匱腎氣丸作用的靶蛋白和通路較桂附地黃丸更多，這一方面是由于金匱腎氣丸比桂附地黃丸多了牛膝和車前子兩味藥，因此擁有更多的活性成分。另一方面，金匱腎氣丸將古方中的肉桂替換成桂枝，有文章表明在桂枝皮部的有效成分更高，且直徑與皮部含量成負(fù)相關(guān)[19]。這也就不難理解，為什么桂枝相較于肉桂的活性成分會(huì)有明顯的增加。另一方面作為同樣的靶點(diǎn)，金匱腎氣丸作用的更集中于通路下游，以圖7（a）（b）脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路為例。金匱腎氣丸和桂附地黃丸均可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞上的基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1），調(diào)控下游PI3K-AKT途徑，進(jìn)而抑制eNOS、Bax 的產(chǎn)生，減少細(xì)胞凋亡，同時(shí)可以通過下調(diào)JNK-AP-1 途徑抑制炎癥因子的產(chǎn)生以及單核巨噬細(xì)胞的粘附和趨化，減少粥樣斑塊的破裂，改善血管硬化。但在對(duì)比桂附地黃丸和金匱腎氣丸通路圖時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)金匱腎氣丸更多作用于通路下游的單核細(xì)胞粘附趨化因子，炎癥因子等，直接調(diào)控這些趨化因子發(fā)揮作用。除此外，金匱腎氣丸還可以調(diào)控apoB 和apoB100，調(diào)控低密度脂蛋白運(yùn)輸，進(jìn)而改善脂質(zhì)血管沉積。

綜上所述，有多種核心靶基因及其相關(guān)的信號(hào)通路牽涉到了慢性腎小球腎炎的發(fā)病機(jī)制中[20]。我們通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)比較了金匱腎氣丸和桂附地黃丸在治療慢性腎小球腎炎的活性成分和信號(hào)通路，一分子對(duì)應(yīng)多靶點(diǎn)，且一靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)多通路[21]，揭示了兩種中成藥在抗慢性腎小球腎炎這一自身免疫性疾病過程中多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，并比較兩種藥在治療過程中的相同和不同之處，為后續(xù)課題組在抗慢性腎小球腎炎實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化和具體機(jī)制闡述提供了數(shù)據(jù)參考。但受限于當(dāng)前中藥的數(shù)據(jù)庫仍存在數(shù)據(jù)資源不足的問題，使得所探究的中藥化學(xué)成分及靶點(diǎn)可能與實(shí)際存在出入，因此關(guān)于金匱腎氣丸在慢性腎小球腎炎治療方面是否較桂附地黃丸有更好的效果，仍需要依靠文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證等方式進(jìn)一步證實(shí)金匱腎氣丸和桂附地黃丸治療慢性腎小球腎炎的作用機(jī)制差異。同時(shí)在KEGG 通路富集分析中，二者除了在治療慢性腎小球腎炎外，還在肝炎、化學(xué)物質(zhì)致癌、EB 病毒感染、卡波氏肉瘤等通路發(fā)揮作用，可以考慮通過尋找二者共同作用的免疫學(xué)相關(guān)的靶點(diǎn)和相關(guān)機(jī)制來加以具體解釋，為后續(xù)相關(guān)疾病的治療提供理論支持。