武潔　陳彥　陶然　費(fèi)文婷　王金鳳　張建軍　張悅　田世民　鄭立新　王林元

摘要 目的：以常潤(rùn)茶為例研究蒽醌類物質(zhì)的加水量及浸泡次數(shù)等服用方法對(duì)有效成分溶出及通便作用的影響。方法：利用紫外分光光度法建立總蒽醌的含量測(cè)定方法，利用高效液相色譜法建立番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量測(cè)定方法，考察不同浸泡次數(shù)、加水量下常潤(rùn)茶水浸液中有效物質(zhì)的含量變化。利用洛哌丁胺復(fù)制便秘模型進(jìn)行通便作用的驗(yàn)證并探究常潤(rùn)茶對(duì)腸動(dòng)力及黏液分泌的影響，觀察不同浸泡次數(shù)、加水量對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率、首粒排黑便時(shí)間、5 h黑便粒數(shù)、糞便含水量以及結(jié)腸胃動(dòng)素（MTL）、促胃液素（GAS）、生長(zhǎng)抑素（SS）、P物質(zhì)（SP）的影響。結(jié)果：加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，加水60～100倍蒽醌類物質(zhì)溶出差異不大；浸泡1次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，從第2次浸泡開始，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量均明顯減小。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示加水倍數(shù)為40倍、60倍、100倍時(shí)，常潤(rùn)茶均可有通便作用，未出現(xiàn)腹瀉等不良反應(yīng)，60倍、100倍水量通便作用顯著。加水100倍，反復(fù)沖泡多次通便作用不優(yōu)于浸泡1次。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)為產(chǎn)品的精準(zhǔn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于規(guī)范蒽醌類產(chǎn)品具有積極意義。

關(guān)鍵詞 常潤(rùn)茶；通便；蒽醌；高效液相色譜法；紫外分光光度法；番瀉苷A；番瀉苷B；大黃酸

Effect of Taking Methods of Besunyen Detox Tea on Dissolution of Anthraquinones and Laxation

WU Jie1，CHEN Yan1，TAO Ran1，F(xiàn)EI Wenting1，WANG Jinfeng1，ZHANG Jianjun2，ZHANG Yue3，Tian Shimin3，4，ZHENG Lixin3，4，WANG Linyuan1

（1 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 School of Traditional Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 3 Chinese Academy of Inspection and Quarantine Comprehensive Test Center，Beijing 100123，China; 4 CAIQTEST（Beijing） Co.，Ltd.，Beijing 100176，China）

Abstract Objective：To observe the effect of taking methods of Besunyen Detox Tea（water addition and soaking times） on dissolution of anthraquinones and laxation.Methods：The content determination method of total anthraquinone was established by ultraviolet spectrophotometry（UV），and that of sennoside A，sennoside B and rhein was established by high-performance liquid chromatography（HPLC），to investigate the content variation of effective substances in Besunyen Detox Tea under different soaking times and water addition.The constipation model was constructed by loperamide to verify the laxative effect of Besunyen Detox Tea and explore its effect on intestinal motility and mucus secretion.The influence of different soaking times and water addition on propulsion rate of mouse small intestine，first melena time，melena times within 5 h，fecal water content，and colon motilin（MTL），gastrin（GAS），somatostatin（SS） and substance（SP） was also investigated.Results：Water addition was proportional to the dissolution of anthraquinones，and there was little difference in the dissolution of anthraquinones when the water addition was 60～100 times.Most anthraquinones were dissolved by soaking once，and from the second soaking，the contents of total anthraquinone，sennoside A，sennoside B and rhein were decreased significantly.The animal experiments revealed that when the water addition was 40 times，60 times and 100 times，Besunyen Detox Tea produced a laxative effect，and no adverse reactions such as diarrhea occurred.The laxative effect of Besunyen Detox Tea added with water of 60 times and 100 times was obvious.Moreover，water addition of 100 times and repeated brewing failed to be better than soaking once in laxative effect.Conclusion：This experiment provided a basis for precise application of the product and had positive significance for the standardization of anthraquinone products.

Keywords Besunyen Detox Tea; Laxation; Anthraquinone; High-performance liquid chromatography（HPLC）; Ultraviolet spectrophotometry（UV）; Sennoside A; Sennoside B; Rhein

中圖分類號(hào)：R256.35文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.005

便秘是臨床常見(jiàn)腸道疾病，蒽醌類中藥如番瀉葉、蘆薈、決明子等由于其作用強(qiáng)、起效快被廣泛應(yīng)用。臨床研究與現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，長(zhǎng)期使用蒽醌類中藥可能會(huì)造成消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的毒性，引起結(jié)直腸黑變病、藥物性肝損傷、藥物性腎損傷等不良反應(yīng)，蒽醌類物質(zhì)的安全性也引起了關(guān)注和爭(zhēng)議。

蒽醌類物質(zhì)既是發(fā)揮通便功能的有效成分，也是引起爭(zhēng)議的潛在毒性成分［1］?；诖?，本研究以含有番瀉葉、決明子等藥味的常潤(rùn)茶為例，建立常潤(rùn)茶水浸液中蒽醌類總成分及番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸單一成分含量測(cè)定方法，將藥學(xué)實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合優(yōu)化服用方式，探討中藥復(fù)方蒽醌類成分與通便作用及機(jī)制的關(guān)聯(lián)，為含蒽醌類中藥復(fù)方的精準(zhǔn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級(jí)4～6周齡健康雄性昆明小鼠，體質(zhì)量20～22 g，采購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011，飼養(yǎng)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院綜合檢測(cè)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水，動(dòng)物房室溫為20～22 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，12 h燈照、黑暗模擬晝夜交替。實(shí)驗(yàn)符合相關(guān)倫理要求（倫理審批號(hào)：2021-FD-003）。

1.1.2 藥物 常潤(rùn)茶（北京澳特舒爾保健品研究公司，批號(hào)：01200703）；洛哌丁胺膠囊（西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：LFJ8473）。

1.1.3 試劑與儀器 番瀉苷A對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號(hào)：J09J12T136760）、番瀉苷B對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號(hào)：Y21A11Y121808）、大黃酸對(duì)照品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）（批號(hào)：T06J10F92311）、1，8-二羥基蒽醌（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%）（批號(hào)：M21GB149395），以上均采購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；小鼠胃動(dòng)素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：20220301-20682A）、小鼠生長(zhǎng)抑素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：20220301-20618A）、小鼠P物質(zhì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：20220301-20732A）、小鼠促胃液素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒（批號(hào)：20220301-20684A），以上試劑盒均采購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；總蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20210301-95871C）；Waters高效液相色譜儀（Waters公司，美國(guó)，型號(hào)：Waters E2695型），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)：T6新世紀(jì)型），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：101-1AB型），電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：SYG-A2-6型），電子天平（慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司，型號(hào)：SB5002型），精密電子天平（上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司，型號(hào)：BSA224S型）等。

1.2 方法

1.2.1 總蒽醌的含量測(cè)定

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：精密稱取1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品5.00 mg（精確至0.01 mg），置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成0.2 mg/mL的溶液。

1.2.1.2 供試品溶液的制備 稱取常潤(rùn)茶內(nèi)容物1.0 g，置空白包裝袋中，加水100 mL，于90 ℃水浴鍋上浸提15 min，提取液置水浴鍋上蒸干，加入甲醇-鹽酸（10∶1）混合溶液25 mL，稱重，在80 ℃水浴中加熱回流30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液15 mL至分液漏斗中，加水25 mL，用二氯甲烷萃取3次（50 mL、40 mL、30 mL），合并提取液，用水洗滌3次，每次40 mL，洗至中性，棄去水洗液，二氯甲烷層移至蒸發(fā)皿中水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻。

1.2.1.3 顯色與測(cè)定 精密量取供試品溶液2 mL，置于25 mL容量瓶中，加混合堿溶液稀釋并定容至刻度，混勻，作為待測(cè)液。該溶液于暗處放置30 min顯色，顯色結(jié)束后用0.45 μm微孔濾過(guò)濾，以混合堿溶液作空白對(duì)照，測(cè)定吸光度并計(jì)算總蒽醌含量。

1.2.2 番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測(cè)定

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Diamonsil-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序：0～5 min，40%A；5～25 min，40%～45%A；25～32 min，45%～80%A；32～47 min，80%～100%A；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.2.2.2 溶液制備 1）供試品溶液配制：取常潤(rùn)茶內(nèi)容物，混合均勻后精密稱重1.0 g，置于空白包裝袋中，加水100 mL置90 ℃水浴鍋中浸提15 min，濃縮，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。2）混合對(duì)照品溶液配制：精密稱取大黃酸對(duì)照品5.13 mg，置于50 mL容量瓶中，加0.1%NaHCO3水溶液溶解并定容至刻度，即得大黃酸對(duì)照品溶液。另精密稱取番瀉苷A 9.21 mg、番瀉苷B 6.19 mg，置于10 mL容量瓶中，精密移取4 mL大黃酸對(duì)照品溶液，0.1%NaHCO3水溶液溶解并稀釋至刻度，作為混合對(duì)照品溶液。3）陰性對(duì)照品溶液配制：按照常潤(rùn)茶處方比例稱取除番瀉葉、決明子之外的其他藥材，依照常潤(rùn)茶制備工藝及供試品溶液的制備方法，制成陰性對(duì)照品溶液。

1.2.3 不同浸泡水量對(duì)常潤(rùn)茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 取出同一批次的常潤(rùn)茶樣品，拆開包裝將其混勻后等分，從每一份中精密稱取1.0 g，重新封入干凈的茶包。分別用10 mL、20 mL、40 mL、60 mL、80 mL、100 mL純凈水于90 ℃水浴加熱15 min，提取1次，分別得10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍浸泡水量的常潤(rùn)茶水浸液，同一加水量平行操作2份，繼續(xù)按照上述方法制備供試品溶液，測(cè)定水浸液中總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量。

1.2.4 不同浸泡次數(shù)對(duì)常潤(rùn)茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 取出同一批次的常潤(rùn)茶樣品，拆開包裝后將其混勻后等分，從每一份中精密稱取1.0 g，重新封入干凈的茶包。用100 mL純凈水于90 ℃水浴加熱15 min，分別提取1次、2次、3次、4次，得不同浸泡次數(shù)的常潤(rùn)茶水浸液，同一浸泡次數(shù)平行操作2份，繼續(xù)按照上述方法制備供試品溶液，測(cè)定水浸液中總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量。

1.2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

1.2.5.1 藥物配制 不同浸泡水量常潤(rùn)茶受試物的制備：取1 g樣品于常壓條件下，分別加水40 mL、60 mL、100 mL于95 ℃水浸泡15 min，提取1次，配制成濃度為0.008 3 g/mL的藥液（常潤(rùn)茶規(guī)格為2.5 g/袋，2袋/d，以人體推薦10倍用量為小鼠等效劑量，人體質(zhì)量以60 kg計(jì)，小鼠日服用量為0.083 3 g/kg體質(zhì)量），分別為40倍、60倍、100倍浸泡水量的常潤(rùn)茶受試液，4 ℃冷藏，備用。不同浸泡次數(shù)常潤(rùn)茶受試物的制備：取1 g樣品于常壓條件下，加100 mL水（100倍浸泡水量）浸泡15 min，分別提取1次、2次、4次，將提取液合并，蒸發(fā)濃縮至一定體積，配制成濃度為0.008 3 g/mL的藥液，即得不同浸泡次數(shù)的常潤(rùn)茶受試液，4 ℃冷藏，備用。洛哌丁胺混懸液的制備：將洛哌丁胺膠囊溶于水，超聲加熱使其混合均勻，分別配制成濃度為0.4 mg/mL、0.7 mg/mL的混懸液。4 ℃冷藏，用前搖勻。

1.2.5.2 分組與模型制備 雄性昆明小鼠112只，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后隨機(jī)分為7組，即空白組、便秘模型組（模型組）、常潤(rùn)茶40倍水量組（常40組）、常潤(rùn)茶60倍水量組（常60組）、常潤(rùn)茶100倍水量浸泡1次組（常100組）、常潤(rùn)茶浸泡2次組（常2次組）、常潤(rùn)茶浸泡4次組（常4次組），每組16只。造模方法：末次灌胃后每組隨機(jī)選擇8只小鼠禁食不禁水20 h，除空白組外各組一次性灌胃洛哌丁胺混懸液7 mg/kg，觀察小鼠首粒排黑便時(shí)間和5 h黑便粒數(shù)，剩余小鼠禁食不禁水16 h，除空白組外各組一次性灌胃洛哌丁胺混懸液4 mg/kg，空白組給蒸餾水，測(cè)定小鼠小腸推進(jìn)率及結(jié)腸胃腸激素相關(guān)指標(biāo)。灌胃體積為0.01 mL/g。

1.2.5.3 給藥方法 各給藥雄性昆明小鼠每天上午灌胃常潤(rùn)茶水浸液，以常潤(rùn)茶40倍水量（常40組）、常潤(rùn)茶60倍水量（常60組）、常潤(rùn)茶100倍水量浸泡1次（常100組）、常潤(rùn)茶浸泡2次（常2次組）、常潤(rùn)茶浸泡4次進(jìn)行給藥，空白組和模型組小鼠每天灌胃等體積蒸餾水，灌胃體積為0.01 mL/g，連續(xù)給藥7 d。

1.2.5.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 1）一般狀態(tài)觀察及小鼠體質(zhì)量：每天觀察各組小鼠皮毛色澤、自主活動(dòng)及精神狀態(tài)，分別在給藥第0天、第4天、第7天上午記錄各組小鼠體質(zhì)量的變化。2）首粒排黑便時(shí)間、5 h黑便粒數(shù)：灌胃洛哌丁胺0.5 h后，空白組和模型組小鼠用墨汁灌胃，常潤(rùn)茶各劑量小鼠給予含受試樣品的墨汁，從灌胃墨汁開始記錄每只動(dòng)物首粒排黑便時(shí)間、5 h內(nèi)排黑便粒數(shù)，動(dòng)物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進(jìn)食。3）小腸推進(jìn)率：灌胃洛哌丁胺后0.5 h后，各劑量小鼠分別給予含相應(yīng)受試樣品的墨汁，空白組和模型組用墨汁灌胃。25 min后摘眼球取血后立即脫頸椎處死動(dòng)物，測(cè)定小腸推進(jìn)率。小腸推進(jìn)率（%）=墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度（cm）/小腸總長(zhǎng)度（cm）×100%。4）糞便含水量：于給藥第7天上午灌胃后將每組小鼠單獨(dú)置于飼養(yǎng)籠中，禁食禁水20 min，避開被水或者小鼠尿液浸泡的糞便，選取新鮮糞便置于離心管中，稱取糞便濕重并記錄，放入恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，迅速取出樣品稱取干重，計(jì)算糞便含水量。糞便含水量（g）=（糞便濕重-糞便干重）/糞便濕重。5）結(jié)腸胃腸激素指標(biāo)檢測(cè)：小鼠脫頸處死后，在結(jié)腸處取1～3 cm長(zhǎng)的腸組織，立即液氮凍存。按組織∶生理鹽水=1∶9比例冰上勻漿，以3 000 r/min，離心半徑6 cm，低溫離心15 min，取上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)胃動(dòng)素（Motilin，MTL）、促胃液素（Gastrin，GAS）、生長(zhǎng)抑素（Somatostatin，SS）、P物質(zhì)（Substance P，SP）。

1.2.5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較方差齊性采用最小顯著性差異（LSD）法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；方差不齊性采用Dunnett′s T3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 分析與結(jié)果

2.1 總蒽醌的含量測(cè)定

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 按照“1.2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品并按照“1.2.1.3”項(xiàng)下方法顯色，在400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品和對(duì)照品顯色后的溶液進(jìn)行掃描。見(jiàn)圖1。標(biāo)品溶液在（524±2）nm范圍有最大吸收波長(zhǎng)，供試品溶液在522 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，混合堿液在400～800 nm范圍無(wú)干擾，最終選擇522 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.1.2 方法學(xué)考察 分別精密吸取1，8-二羥基蒽醌標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL于25 mL容量瓶中，制備供試品并測(cè)定吸光度。以濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.018 4X，r=0.999 2，在0～0.016 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

制備供試品并顯色，分別于0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、90 min進(jìn)行測(cè)定吸光度，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為2.81%，提示供試品在90 min內(nèi)顯色穩(wěn)定性良好。取對(duì)照品溶液，連續(xù)6次測(cè)定吸光度，RSD為0.21%，說(shuō)明該檢測(cè)儀器精密度良好。稱取樣品6份，每份約1 g，制備供試品并計(jì)算總蒽醌含量?？傒祯骄繛?.48 mg/g，6份樣品含量所得RSD為2.61%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。取常潤(rùn)茶樣品9份，稱量每份樣品500 mg，分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對(duì)照品溶液并制備供試品，計(jì)算總蒽醌含量，結(jié)果顯示總蒽醌整體加樣回收率范圍在96.22%～102.06%之間，RSD小于3%。

2.2 番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測(cè)定 分別精密吸取“1.2.2.2”項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按照“1.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸分離度良好，在3種成分對(duì)應(yīng)色譜峰附近沒(méi)有其他物質(zhì)色譜峰的干擾，說(shuō)明該方法專屬性良好。見(jiàn)圖2。

精密量取對(duì)照品溶液各0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL，分別置于2 mL容量瓶中，加0.1%NaHCO3水溶液定容。分別以番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，番瀉苷A的回歸方程分別為Y=684 483 X（r=0.999 4），在0.460 5～9.210 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。番瀉苷B的回歸方程為Y=1 430 954 X（r=0.999 6），在0.309 5～6.190 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。大黃酸的回歸方程為Y=2 003 984 X（r=0.999 7），在0.020 52～0.410 40 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密稱量樣品約1.0 g，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h測(cè)定，番瀉苷A峰面積的RSD為1.56%，番瀉苷B峰面積的RSD為1.78%，大黃酸峰面積的RSD為0.76%，供試品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，6次所得番瀉苷A峰面積的RSD為0.46%，番瀉苷B峰面積的RSD為0.48%，大黃酸峰面積的RSD為0.43%，該檢測(cè)儀器精密度良好。稱量樣品約1.0 g，制備樣品6份并進(jìn)行測(cè)定，番瀉苷A平均含量為4.41 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.98%，番瀉苷B平均含量為2.49 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.70%，大黃酸平均含量為0.23 mg/g，6份樣品含量的RSD為2.84%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。取常潤(rùn)茶樣品9份，精密稱量每份樣品500 mg，分別以1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入對(duì)照品溶液適量，制備樣品并進(jìn)行檢測(cè)，番瀉苷A加樣回收率范圍在96.28～101.96%之間，RSD小于3%，番瀉苷B加樣回收率范圍在96.70～102.13%之間，RSD小于3%，大黃酸加樣回收率范圍在98.13～103.42%之間，RSD小于3%。

2.3 不同浸泡水量對(duì)常潤(rùn)茶中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 含量測(cè)定結(jié)果顯示，加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，隨著加水量的增加，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸含量逐漸升高，加水量為40倍時(shí)，總蒽醌及番瀉苷A、B的含量曲線趨于平緩，加水量為60倍時(shí)，大黃酸的含量曲線趨于平緩。

2.4 不同浸泡次數(shù)對(duì)常潤(rùn)茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 含量測(cè)定結(jié)果顯示，浸泡1次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，從第2次浸泡開始，總蒽醌、番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸的含量均顯著減小。

2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.3.1 一般狀態(tài)觀察及小鼠體質(zhì)量 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠未出現(xiàn)腹瀉的情況。各組之間小鼠皮毛色澤、精神狀態(tài)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第1天，各組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。實(shí)驗(yàn)第7天，與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），與模型組比較，常2次組和常4次組體質(zhì)量顯著降低（P<0.05，P<0.05）。見(jiàn)圖5。

2.3.2 首粒排黑便時(shí)間、5 h黑便粒數(shù) 與空白組比較，模型組小鼠首粒排黑便時(shí)間顯著增加（P<0.001），5 h黑便粒數(shù)顯著降低（P<0.001）。與模型組比較，各常潤(rùn)茶給藥組小鼠首粒排黑便時(shí)間顯著降低（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；5 h黑便粒數(shù)顯著增加（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.01）。與常100組比較，常40組、常60組、常4次組5 h黑便粒數(shù)顯著降低（P<0.01，P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)圖6。

2.3.3 小腸推進(jìn)率 與空白組比較，模型組小鼠炭末推進(jìn)距離，小腸推進(jìn)率顯著降低（P<0.001，P<0.001）。與模型組比較，各常潤(rùn)茶給藥組小鼠炭末推進(jìn)距離均顯著升高（P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；與模型組比較，除常40組外，其余各常潤(rùn)茶給藥組小鼠炭末推進(jìn)率顯著升高（P<0.05，P<0.001，P<0.001，P<0.01）。見(jiàn)圖7。

2.3.4 糞便含水量 與空白組比較，模型組小鼠第7天時(shí)糞便含水量降低但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，除常40組外其余組小鼠糞便含水量均顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001，P<0.001）。與常100組比較，常4次組小鼠糞便含水量顯著升高（P<0.01）。見(jiàn)圖8。

2.3.5 結(jié)腸胃腸激素指標(biāo)檢測(cè) 與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸MTL、GAS、SP顯著降低（P<0.05，P<0.001，P<0.001），SS顯著升高（P<0.001）。與模型組比較，除常40組外，各常潤(rùn)茶給藥組MTL水平顯著升高（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）；除常4次組外，各常潤(rùn)茶給藥組GAS水平顯著升高（P<0.05，P<0.01，P<0.01，P<0.01）；各

常潤(rùn)茶給藥組SP水平顯著升高（P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001，P<0.001）；各常潤(rùn)茶給藥組SS水平顯著降低（P<0.01，P<0.01，P<0.001，P<0.001，P<0.001）。與常100組比較，常4次組SP水平顯著降低（P<0.05）；常2次、常4次組SS水平顯著降低（P<0.05，P<0.01）。見(jiàn)圖9。

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選擇及含量測(cè)定方法的建立 常潤(rùn)茶組方君藥番瀉葉、臣藥決明子可瀉熱行滯，是常潤(rùn)茶發(fā)揮潤(rùn)腸通便作用的主要中藥，蒽醌類物質(zhì)是番瀉葉和決明子主要成分也是其瀉下的活性成分［2-3］。蒽醌以結(jié)合型及游離型2種形式存在，常潤(rùn)茶中結(jié)合型蒽醌主要為番瀉苷A、番瀉苷B、大黃酸-8-葡萄糖苷、蘆薈大黃素-8-葡萄糖苷等，游離蒽醌以大黃素型蒽醌為主，包括大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、橙黃決明素等。番瀉苷A、B一般分子量較大，結(jié)構(gòu)中的葡萄糖可以保護(hù)苷元不被胃腸水解和破壞，進(jìn)入結(jié)腸后經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮，發(fā)揮瀉下功效［4-6］。大黃酸生物利用度高，較為穩(wěn)定，經(jīng)腸道菌群同樣轉(zhuǎn)化為大黃酸蒽酮發(fā)揮瀉下功效［7］，研究表明大黃酸可顯著改善便秘小鼠的腸道傳輸功能，降低便秘小鼠結(jié)腸黏膜AQP3的表達(dá)，緩解便秘［8-10］。本研究選擇番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸作為指標(biāo)成分［11-13］，經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察，專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，適用于常潤(rùn)茶水浸出液中蒽醌類物質(zhì)的含量測(cè)定。

3.2 浸泡水量及浸泡次數(shù)對(duì)常潤(rùn)茶水浸液中蒽醌類物質(zhì)溶出的影響 根據(jù)每日用量設(shè)置加水倍數(shù)為10倍、20倍、40倍、60倍、80倍、100倍。含量測(cè)定結(jié)果顯示，加水量與蒽醌類物質(zhì)的溶出正相關(guān)，加水倍量為60倍時(shí)，蒽醌類物質(zhì)的含量曲線趨于平緩。因此在實(shí)際服用過(guò)程中，每袋常潤(rùn)茶（2.5 g/袋）用150～250 mL熱水浸泡，蒽醌類物質(zhì)溶出較穩(wěn)定。設(shè)置浸泡次數(shù)為1次、2次、3次、4次，研究浸泡次數(shù)對(duì)蒽醌類物質(zhì)溶出的影響。含量測(cè)定結(jié)果顯示，浸泡一次可將大部分蒽醌類物質(zhì)溶出，第2次、第3次、第4次蒽醌類物質(zhì)的含量均明顯降低，因此在實(shí)際服用過(guò)程中，浸泡1次即可。

3.3 便秘模型的建立及常潤(rùn)茶通便作用驗(yàn)證 洛哌丁胺是動(dòng)物便秘模型建立中應(yīng)用最多也較為穩(wěn)定的造模藥物［14］，本研究選擇洛哌丁胺為造模藥。便秘是以排便次數(shù)減少、糞便干硬、排便費(fèi)力等為主要表現(xiàn)的消化系統(tǒng)常見(jiàn)疾病，排便情況的觀察和胃腸傳輸速率是對(duì)便秘動(dòng)物模型最直觀、最常用的評(píng)價(jià)方法。與空白組比較，模型組小鼠小腸推進(jìn)率及5 h黑便粒數(shù)顯著降低，首粒排黑便時(shí)間顯著延長(zhǎng)，可判定便秘模型建立成功。

與模型組比較，各常潤(rùn)茶給藥組小鼠小腸推進(jìn)率及5 h黑便粒數(shù)顯著升高，首粒排黑便時(shí)間顯著縮短，初步判斷常潤(rùn)茶可潤(rùn)腸通便。其中常100組小鼠5 h黑便粒數(shù)顯著高于常40組、常4次組，與模型組比較，常40組炭末推進(jìn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可知，浸泡水量與常潤(rùn)茶通便作用正相關(guān)，浸泡水量為60～100倍時(shí)通便作用顯著。常潤(rùn)茶反復(fù)沖泡通便作用不優(yōu)于浸泡1次，故沒(méi)有必要多次浸泡。

3.4 不同浸泡次數(shù)及水量常潤(rùn)茶對(duì)便秘小鼠腸道動(dòng)力與黏液的影響 便秘的發(fā)生與腸系神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸激素關(guān)系密切［15-16］，其中GAS、MTL、SP屬于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，各常潤(rùn)茶給藥組小鼠GAS、MTL、SP含量升高，胃排空速率增加，結(jié)腸蠕動(dòng)能力加快，GAS與SP為腦腸肽，作用于結(jié)腸平滑肌的同時(shí)可通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)促進(jìn)胃酸分泌，減少胃腸道對(duì)水分的吸收，增加糞便含水量，縮短糞便在腸道內(nèi)停留時(shí)間，促進(jìn)排便。SS屬于抑制性胃腸激素，給藥小鼠SS含量降低，也可有效抑制腸道蠕動(dòng)、增加腸液及多肽類激素分泌、加快腸道血流量，促進(jìn)排便。常潤(rùn)茶可通過(guò)調(diào)節(jié)胃腸激素，促進(jìn)腸液分泌，增加糞便含水量，產(chǎn)生排便作用。

番瀉葉可改變腸道蠕動(dòng)功能，研究表明低濃度番瀉葉瀉下作用溫和，長(zhǎng)期應(yīng)用對(duì)大鼠體質(zhì)量無(wú)影響［17］，隨著浸泡水量增加，常潤(rùn)茶中蒽醌類物質(zhì)溶出增加，常潤(rùn)茶通便功能增強(qiáng)，小鼠體質(zhì)量未出現(xiàn)顯著變化。而高濃度番瀉葉瀉下作用峻猛，可顯著減緩體質(zhì)量增長(zhǎng)，出現(xiàn)腹瀉等癥狀，可能與腸道SS水平降低及小腸黏膜活性變化有關(guān)［18］，同時(shí)臨床不良反應(yīng)報(bào)道提示，蒽醌類中藥疊加使用，升高了蒽醌類制劑的安全風(fēng)險(xiǎn)，常潤(rùn)茶中番瀉葉與決明子協(xié)同發(fā)揮作用，隨著浸泡次數(shù)的增加，小鼠體質(zhì)量比較于空白組顯著降低，糞便含水量顯著升高，瀉下功能降低，考慮可能與SS水平顯著降低，腸道內(nèi)水分大量流失有關(guān)。

4 總結(jié)

蒽醌類物質(zhì)的不良反應(yīng)大多與其長(zhǎng)期大劑量使用有關(guān)，有效物質(zhì)溶出受到加水量及浸泡次數(shù)的影響。本研究以問(wèn)題為導(dǎo)向建立了常潤(rùn)茶水浸液中主要功效成分總蒽醌比色法以及番瀉苷A、番瀉苷B及大黃酸的含量測(cè)定方法，并考察了不同浸泡次數(shù)及水量對(duì)其溶出的影響，明確了常潤(rùn)茶通便的物質(zhì)基礎(chǔ)。常潤(rùn)茶規(guī)格為2.5 g/袋，從有效成分溶出的角度確定2袋/d，建議浸泡水量為150～250 mL（60～100倍），浸泡1次服用即可，無(wú)須反復(fù)沖泡。本研究進(jìn)一步結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究浸泡次數(shù)及水量與其通便作用的量效關(guān)系，從有效性方面證實(shí)了通過(guò)體外測(cè)定有效成分含量確定的常潤(rùn)茶服用方法，并深入研究了其通便作用機(jī)制，表明常潤(rùn)茶可調(diào)節(jié)MTL促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，增加胃腸傳輸功能，調(diào)節(jié)GAS、SP、SS促進(jìn)腸液分泌，增加糞便含水量。此外蒽醌類物質(zhì)協(xié)同作用致使腸道水分大量流失，提示反復(fù)沖泡可能引起小鼠體質(zhì)量降低。

本研究綜合應(yīng)用藥學(xué)及藥理學(xué)方法對(duì)蒽醌類物質(zhì)的溶出及其通便作用進(jìn)行考察，為含蒽醌類成分的中藥復(fù)方精準(zhǔn)應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突聲明：無(wú)。

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（2022-11-15收稿 本文編輯：吳珊）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFC1706803）作者簡(jiǎn)介：武潔（1999.07—），女，碩士，研究方向：中藥開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，E-mail：wj18811382122@163.com通信作者：王林元（1961.10—），男，碩士，教授，研究方向：中藥開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，E-mail：wanglinyuan110@vip.163.com；鄭立新（1980.08—），女，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：毒理學(xué)及保健食品功能，E-mail：594782086@qq.com