王蓉 林栩 吳昱升 唐志明 王晨 韋美理 黃慕源 張潔 徐璐瑤

【摘要】 目的 探討高糖（HG）誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中miR-155的表達(dá)變化及miR-155與足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系。

方法 體外培養(yǎng)人腎小球足細(xì)胞（AB8/13），用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激AB8/13 48 h作為HG組，同時(shí)以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細(xì)胞48 h作為正常對(duì)照（NC）組。用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA和miR-155的表達(dá)。Western blot法檢測(cè)nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin蛋白的表達(dá)。鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架變化。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)蛋白nephrin、synaptopodin。

結(jié)果 HG可抑制足細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞存活率（P<0.01）。HG作用的Ab8/13中的miR-155表達(dá)水平升高，nephrin、F-actin、synaptopodin、p-cadherin的mRNA與蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）。HG會(huì)導(dǎo)致足細(xì)胞骨架紊亂。

結(jié)論 HG作用的人足細(xì)胞中miR-155表達(dá)升高，miR-155表達(dá)與HG誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷有關(guān)，可作為足細(xì)胞損傷診斷和治療的靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 足細(xì)胞損傷；miR-155；高糖；足細(xì)胞相關(guān)蛋白

中圖分類號(hào)：R692.6?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2023.04.003

Expression of miR-155 in high glucose induced podocyte injury and its correlation with podocyte injury related protein expression

WANG Rong1，2， LIN Xu1，2， WU Yusheng1，2， TANG Zhiming1，2， WANG Chen1，2， WEI Meili1，2， HUANG Muyuan1，2， ZHANG Jie1，2， XU Luyao1，2

（1. Department of Nephrology， Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities， Baise 533000， Guangxi， China;2. Guangxi Key Laboratory of Basic Guarantee for Medical Research of Immune-related Diseases， Baise 533000， Guangxi， China）

【Abstract】 Objective To investigate the changes of expression of miR-155 in podocyte injury induced by high glucose （HG） and its relationship with podocyte injury related protein expression.

Methods Human glomerular podocytes （AB8/13） were cultured in vitro， AB8/13 stimulated with 30 mmol/L D-glucose solution for 48 h were selected as HG group， and cells treated with a final concentration of 5 mmol/L D-glucose solution for 48 h as normal control （NC） group. Cell proliferation activity was detected by CCK8. Real-time quantitative polymerase chain reaction （qRT-PCR） was used to detect nephrin， F-actin， synaptopodin， and the mRNA and miR-155 expressions of p-cadherin. Western blot was used to detect the protein expressions of nephrin， F-actin， synaptopodin and p-cadherin. Cytoskeleton changes were observed by phalloidin staining， and cellular immunofluorescence was used to detect protein nephrin and synaptopodin.

Results HG could inhibit podocyte proliferation and decrease cell survival rate （P<0.01）. The expression level of miR-155 in Ab8/13 induced by HG increased， while the mRNA and protein expression levels of nephrin， F-actin， synaptophodin， and p-cadherin decreased （P<0.05）， and HG could cause disorder of foot cytoskeleton.

Conclusion The expression of miR-155 in human podocytes induced by HG elevates， and miR-155 expression is associated with HG induced podocyte injury， which can be served as a target for the diagnosis and treatment of podocyte injury.

【Key words】 podocyte injury;miR-155;high glucose;podocyte-associated protein

足細(xì)胞（podocyte）是腎小球的終末分化細(xì)胞，是腎小球過濾屏障形成和維持的重要組成部分，發(fā)揮通過分子電荷和大小進(jìn)行選擇性過濾的功能［1］。足細(xì)胞損傷（podocyte injury）是導(dǎo)致蛋白尿從而促進(jìn)包括糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）、狼瘡腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎病等腎小球疾病進(jìn)展的重要始發(fā)環(huán)節(jié)［2］。避免和及時(shí)修復(fù)足細(xì)胞損傷對(duì)減少DKD等疾病的發(fā)生發(fā)展有重要意義。microRNA （miRNA） 是短（20～24 nt）非編碼 RNA，通過影響 mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯，參與多細(xì)胞生物中基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控［3］。miRNA在腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［4-5］。miR-155 （microRNA 155）是一種 RNA 基因，屬于 miRNA 類。miR-155能夠通過調(diào)節(jié)足細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)減弱DKD引起的腎損害［6-8］，miR-155與足細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［5，9］，提示miR-155在足細(xì)胞損傷中起關(guān)鍵作用。本研究通過高糖溶液刺激人腎臟足細(xì)胞構(gòu)建細(xì)胞損傷模型，從而研究高糖對(duì)足細(xì)胞損傷的影響及miR-155與高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷相關(guān)蛋白是否相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小球足細(xì)胞株AB8/13獲贈(zèng)于英國(guó)Bristol大學(xué)Moin A.Saleem教授；胎牛血清（Lonsera）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio）；CCK8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；4%多聚甲醛（absin）；TrixonX-100（absin）；CoraLite？倕

488標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（proteintech）；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）（Solarbio）；ＲIPA 蛋白裂解液（Solarbio）；5x蛋白上樣緩沖液（含巰基還原劑）（Solarbio）;（SDS-PAGE電泳液（碧云天）；western轉(zhuǎn)膜液（碧云天）；三色預(yù)染蛋白Marker（Affinity）；雙敏化學(xué)發(fā)光試劑（ECL Reagent）（Affinity）； Anti-nephrin antibody、Anti-F-actin antibody（abcam）；GAPDH Ab（Affinity）； HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（proteintech）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Qpcr Mix（Monad）；nephrin、p-cadherin、synaptopodin、GAPDH、F-actin、U6 PCR引物合成（武漢金開瑞生物工程有限公司），miR-155 PCR引物合成（上海生工生物工程股份有限公司），引物序列見表1。多功能酶標(biāo)儀（Thermo）；電泳儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統(tǒng)（Tanon）；激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 足細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理

體外培養(yǎng)AB8/13足細(xì)胞，足細(xì)胞復(fù)蘇后用含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)，每隔2～3 d 換液或傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞在不含血清的培養(yǎng)基條件下饑餓培養(yǎng)12 h后用終濃度為30 mmol/L的D-葡萄糖溶液刺激培養(yǎng)細(xì)胞48 h作為高糖（HG）組，同時(shí)以終濃度為5 mmol/L的D-葡萄糖溶液處理細(xì)胞作為正常對(duì)照（NC） 組［10］。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

設(shè)置As：實(shí)驗(yàn)孔（含有細(xì)胞、30 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ac：對(duì)照孔（含細(xì)胞、5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液、CCK8溶液），Ab：空白孔（含5 mmol/L 的D-葡萄糖溶液，不含細(xì)胞和CCK8溶液）。將各組細(xì)胞按5×103個(gè)/孔接種于96孔板，每孔的最終體積為100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，更換為無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h，向培養(yǎng)板內(nèi)各組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，在As、Ac組中的每孔內(nèi)加入10 μL的CCK8溶液，將培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的吸光度（OD）。細(xì)胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA及miR-155表達(dá)水平

用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260/280及RNA濃度。使用Monad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。按照Monad熒光定量PCR試劑盒使用說明配置反應(yīng)體系，使用LightCycler？倕

96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin、GAPDH、miR-155、U6的mRNA表達(dá)。每個(gè)樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，PCR的反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法來進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 Western blot檢測(cè)nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白表達(dá)

加入適量的RIPA裂解液充分裂解各組細(xì)胞，4 ℃，12 000 g離心10 min，收集蛋白上清液，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液，100 ℃煮10 min變性。吸取30～50 μg蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)膜至0.45 μm PVDF膜，用含5% BSA的TBST 搖床封閉1 h，1xTBST清洗3次，每次5 min，分別加入一抗稀釋液稀釋的nephrin（1∶1000）、F-actin（1∶1000）、p-cadherin（1∶1000）、synaptopodin（1∶1000）、GAPDH（1∶10 000）抗體，4 ℃搖床搖晃孵育過夜，第2天TBST洗膜3次，每次3 min后加入相應(yīng)的抗兔IgG-HRP（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入現(xiàn)配置的ECL 發(fā)光液，凝膠化學(xué)發(fā)光成像儀曝光，利用Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶分析，以目的條帶和GAPDH 條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。每個(gè)蛋白樣品重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞骨架變化

將各組細(xì)胞按2×103的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)皿內(nèi)的最終體積為500 μL，移入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，6 h后待細(xì)胞貼壁后，每個(gè)皿內(nèi)加入完全培養(yǎng)基至2 mL繼續(xù)培養(yǎng)、處理，按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞，至干預(yù)時(shí)間點(diǎn)后，吸棄舊培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入4%多聚甲醛溶液冰上固定細(xì)胞15 min，用PBS清洗細(xì)胞3次，用含0.2%Triton X-100的PBS溶液室溫透化細(xì)胞5 min，用PBS清洗細(xì)胞3次，分別加入200 μL 熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽儲(chǔ)液（稀釋比例為1∶100），室溫避光孵育20 min進(jìn)行染色，用PBS清洗細(xì)胞3次，每個(gè)皿內(nèi)分別滴加50 μL的抗熒光衰減封片劑（含DAPI），激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)

按實(shí)驗(yàn)分組干預(yù)足細(xì)胞，干預(yù)到時(shí)間點(diǎn)后，用PBS清洗3次，每次5 min，用4%多聚甲醛溶液冰上固定15 min，用PBS清洗3次，再加入PBS 溶液稀釋的0.2% Triton X-100，室溫孵育5 min 后，PBS清洗3次，向各孔中加入適量的5%正常山羊血清，常溫孵育1 h，吸水紙吸掉封閉山羊血清，PBST清洗3次，加入抗體稀釋液稀釋的nephrin（1∶500）、F-actin（1∶500），4 ℃孵育過夜，次日將一抗棄掉，PBST清洗3次，滴加稀釋好的熒光二抗（1∶500），室溫避光孵育1 h，PBST清洗3次，往各孔中滴加抗熒光衰減封片劑（含DAPI），在激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)? 果

2.1 觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征

在37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，使用相差顯微鏡觀察細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周邊有足突，細(xì)胞與細(xì)胞之間有足突間隙連接，一些細(xì)胞呈“樹枝狀”。見圖1。

2.2 nephrin、synaptopodin在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中的表達(dá)

免疫熒光法檢測(cè)腎小球足細(xì)胞的特異性蛋白nephrin、synaptopodin，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)過程中用的細(xì)胞熒光染色明顯，表達(dá)nephrin、synaptopodin蛋白。見圖2。nephrin蛋白是足細(xì)胞特異性蛋白，主要表達(dá)在細(xì)胞的胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核周。synaptopodin蛋白是反映足細(xì)胞分化成熟的特異性蛋白。所以，實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征符合人腎小球足細(xì)胞，且表達(dá)足細(xì)胞特異性nephrin、synaptopodin蛋白，因此，本實(shí)驗(yàn)用的細(xì)胞是人腎小球足細(xì)胞，可用于后續(xù)的試驗(yàn)。

2.3 HG干預(yù)對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小球足細(xì)胞增殖活性的影響

30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足細(xì)胞，干預(yù)時(shí)間為48 h，與正常對(duì)照組相比較，細(xì)胞增殖活性受到抑制，細(xì)胞活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖3。

2.4 HG誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷對(duì)miR-155表達(dá)的影響

正常對(duì)照組中miR-155的表達(dá)量較低，使用30 mmol/L的D-葡萄糖溶液作用于足細(xì)胞48 h，miR-155表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01） 。見表2。

2.5 HG誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷對(duì)nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin mRNA 表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組相比，HG干預(yù)足細(xì)胞48 h后，nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin 的mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)。見表2。

2.6 HG誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷對(duì)nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白的影響

Western blot 結(jié)果顯示，HG干預(yù)足細(xì)胞48 h后，HG組nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin蛋白與NC組相比較均明顯降低（P<0.05）。見圖4。

2.7 高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷細(xì)胞骨架變化

激光共聚焦顯微鏡觀察足細(xì)胞骨架顯示：NC組足細(xì)胞骨架排列有序，結(jié)構(gòu)清晰，沿細(xì)胞長(zhǎng)軸呈放射狀分布，足突明顯，熒光強(qiáng)度明亮，而HG組足細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，變圓鈍、皺縮，骨架結(jié)構(gòu)斷裂，排列紊亂，足突減少，與NC組相比較，熒光強(qiáng)度表達(dá)明顯暗淡。見圖5。

2.8 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)nephrin、synaptopodin蛋白

結(jié)果顯示，足細(xì)胞nephrin蛋白主要在胞膜、細(xì)胞質(zhì)及核周表達(dá)，呈顆?；蚓€狀分布，HG組nephrin蛋白熒光與NC組相比較，表達(dá)量減少，nephrin蛋白熒光減弱，蛋白表達(dá)趨勢(shì)與Western blot、qRT-PCR結(jié)果一致。synaptopodin只在分化成熟的足細(xì)胞中表達(dá)，主要分布在胞漿、周邊、次級(jí)突起，HG處理后的足細(xì)胞synaptopodin蛋白熒光減弱，部分向核周分布。synaptopodin蛋白的表達(dá)與Western blot、qRT-PCR結(jié)果一致。見圖6。

3 討? 論

DKD被認(rèn)為是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因［11］。盡管近年來關(guān)于DKD的研究已取得很大進(jìn)展，但其分子水平的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。足細(xì)胞是終末分化的腎小球內(nèi)臟上皮細(xì)胞，是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分。腎小球足細(xì)胞損傷是腎小球功能障礙的核心事件，可導(dǎo)致糖尿病介導(dǎo)的蛋白尿和腎臟疾?。?2］。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)糖尿病患者早期會(huì)有足細(xì)胞丟失和足細(xì)胞完整性受損［13］。足細(xì)胞在DKD中經(jīng)歷了一系列形態(tài)和功能變化，包括肥大、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、分化、脫落和凋亡［14］。足細(xì)胞損傷伴隨著細(xì)胞活力、炎癥、纖維化的降低和足細(xì)胞功能障礙的增加［15］，高血糖會(huì)誘導(dǎo)培養(yǎng)的足細(xì)胞凋亡并減少足細(xì)胞數(shù)量，加速足突消失和尿白蛋白排泄［16］。另外，高血糖和血管緊張素Ⅱ引起的足細(xì)胞損傷，如氧化應(yīng)激、足細(xì)胞死亡和線粒體功能障礙，已被證實(shí)與 DKD 中的 GFB 破壞和蛋白尿密切相關(guān)［17］。因此，腎小球足細(xì)胞損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致DKD的主要機(jī)制之一。然而，控制足細(xì)胞損傷的相關(guān)機(jī)制尚不清楚。因此，足細(xì)胞損傷相關(guān)機(jī)制的研究可為DKD發(fā)病機(jī)制的研究提供思路。

miRNA在人類細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)，參與了細(xì)胞增殖凋亡、人體病理生理以及疾病發(fā)展預(yù)后等過程。miR-155在多個(gè)層面參與生物控制，通過靶mRNA 的翻譯抑制或不穩(wěn)定來調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞發(fā)育和功能至關(guān)重要的基因表達(dá)［2］。已發(fā)現(xiàn) miR-155 在幾種活化的免疫細(xì)胞中明顯上調(diào)，包括 T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC）。在先天免疫反應(yīng)過程中，它被廣泛的炎癥介質(zhì)上調(diào)［5］。據(jù)報(bào)道，miR-155在某些細(xì)胞和動(dòng)物模型中抑制葡萄糖代謝［18］，由 miR-155調(diào)節(jié)影響葡萄糖和脂質(zhì)代謝的靶基因仍然未知。因此，深入研究miR-155調(diào)控糖尿病腎病的分子機(jī)制有利于進(jìn)一步闡明DKD足細(xì)胞損傷的發(fā)病機(jī)制。

nephrin 是一種重要的裂隙隔膜蛋白［19-20］，可協(xié)調(diào)足細(xì)胞中細(xì)胞連接和細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)之間的相互作用。其他裂孔隔膜蛋白p-cadherin和synaptopodin對(duì)穩(wěn)定足細(xì)胞的正常生理功能具有重要作用［20］。足細(xì)胞有著復(fù)雜的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，肌動(dòng)蛋白F-actin嚴(yán)格控制足突的形成過程［21］，因此，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與足細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。本研究證實(shí)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷模型中，足細(xì)胞的增殖活性受到抑制，足細(xì)胞相關(guān)蛋白因子nephrin、p-cadherin、synaptopodin、F-actin的mRNA和蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)回縮、斷裂，排列紊亂，最終導(dǎo)致足細(xì)胞足突融合、消失等。

本研究證實(shí)，在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷模型中，miR-155表達(dá)上調(diào)，表明miR-155參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷過程，為DKD的防治提供了新的思路，但 miR-155 在高血糖誘發(fā)的腎病中的作用仍不清楚，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步開展深入研究。

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（收稿日期：2022-08-12 修回日期：2022-10-08）

（編輯：梁明佩）