蔣鵬，王澤祥，車亮，王由森，孫曉林

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

弓形蟲病是由弓形蟲寄生于哺乳動(dòng)物、鳥類、海洋哺乳動(dòng)物和人類而引起的一種原蟲病，分布于全球除南極以外的所有地區(qū)［1］。弓形蟲的生活史復(fù)雜，感染形式主要有3 種，分別是包含子孢子的卵囊、速殖子和包含緩殖子的包囊。包含緩殖子的包囊通常存在于慢性感染病例的腦組織、骨骼肌、內(nèi)臟，能夠逃避宿主的免疫系統(tǒng)、抵抗藥物作用、轉(zhuǎn)化為具有毒力的速殖子［2］。速殖子通常存在于慢性感染病例體內(nèi)，以內(nèi)出芽法在有核細(xì)胞內(nèi)生殖，在速殖子感染的細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成納蟲泡，速殖子在納蟲泡內(nèi)復(fù)制。納蟲泡能夠保護(hù)速殖子免受宿主細(xì)胞溶酶體的降解，對(duì)弓形蟲速殖子在細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)是必需的［2］。

弓形蟲速殖子的頂質(zhì)體主要由3個(gè)分泌性細(xì)胞器組成，分別是棒狀體、致密顆粒和微線體。棒狀體是頂復(fù)門原蟲共有的分泌性細(xì)胞器。弓形蟲棒狀體呈棒球狀，由前端的頸部和后端的球部構(gòu)成［3-4］。弓形蟲棒狀體占據(jù)整個(gè)蟲體細(xì)胞總體積的1%～30%，在速殖子入侵宿主細(xì)胞和納蟲泡的生物合成中發(fā)揮作用。棒狀體蛋白在弓形蟲多個(gè)階段蟲體入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，它們對(duì)于弓形蟲在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存是必需的［5-8］。學(xué)者對(duì)弓形蟲棒狀體蛋白質(zhì)組學(xué)的研究表明，弓形蟲棒狀體包含38個(gè)蛋白質(zhì)，目前發(fā)現(xiàn)11 個(gè)位于棒狀體球部、9 個(gè)位于棒狀體頸部［9-11］。許多棒狀體蛋白是弓形蟲的毒力因子，在弓形蟲的致病性方面發(fā)揮重要作用。ROP5、ROP16和ROP18 是棒狀體蛋白激酶，它們具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性，在弓形蟲蟲體入侵宿主細(xì)胞和調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4，12-14］。

ROP15 是經(jīng)過二維電泳鑒定出的一個(gè)弓形蟲棒狀體蛋白，該蛋白與人源抗弓形蟲速殖子血清和羊源抗弓形蟲速殖子血清具有良好的反應(yīng)性［15］。ROP15基因缺失的RH蟲株弓形蟲速殖子在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)細(xì)胞中的感染和增殖能力受到影響，但是ROP15缺失RH蟲株速殖子對(duì)小鼠的致病性無(wú)影響［16］。因此，ROP15具有作為弓形蟲病診斷抗原和疫苗免疫候選分子的潛在可能。本研究運(yùn)用RTPCR 技術(shù)克隆弓形蟲RH 蟲株速殖子ROP15基因，對(duì)弓形蟲RH蟲株速殖子ROP15進(jìn)行原核表達(dá)及純化，為進(jìn)一步研究ROP15在弓形蟲病診斷和疫苗免疫方面的作用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株、菌株、載體及試驗(yàn)動(dòng)物

弓形蟲RH蟲株速殖子由本實(shí)驗(yàn)室保存，系液氮中的長(zhǎng)期保種。原核表達(dá)載體pGEX-4T-1 和大腸桿菌（E.coil）DH5α、BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c 小鼠、新西蘭大白兔購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要儀器、試劑及耗材

DDY-31A型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、微型垂直電泳槽（北京六一廠），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）、超聲波破碎儀（浙江寧波新芝生物科技股份有限公司）、超凈工作臺(tái) （蘇凈集團(tuán)安泰公司）、電熱恒溫水浴鍋（北京長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）、脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司） 、低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo）、超微量紫外線分光光度計(jì)（杭州宏麟春科技有限公司）。限制性內(nèi)切酶BamH I、XhoI購(gòu)自NEB（北京）有限公司New England Biolabs （Beijing） LTD；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript? RT Master Mix、T4 DNA連接酶、高保真DNA聚合酶、dNTPs、質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA Marker、RNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen 公司；GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂為南京金斯瑞有限公司產(chǎn)品。離心管、移液器吸頭均購(gòu)自甘肅泰科生物科技有限公司。其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 弓形蟲RH蟲株速殖子收集及RNA提取

將液氮中保存的弓形蟲RH蟲株速殖子復(fù)蘇，腹腔接種小鼠，連續(xù)傳代3 代后無(wú)菌操作收集小鼠腹水，3 000 r/min 離心15 min，棄去上清，使用PBS 清洗3次，按試劑盒說(shuō)明書提取速殖子RNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)已發(fā)布的弓形蟲RH蟲株ROP15基因開放閱讀框（ORF）序列（NCBI 登錄號(hào) DQ096561.1），運(yùn)用軟件Oligo設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別引入BamHⅠ和XhoI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引物由上海生物工程有限公司合成。上游引物RP15-F：5’-CGGGAT CCATGCTGAAAACGACACCTGCATT-3’；下游引物RP15-R：5’-CCGCTCGAGGTCATAGA CTTACCCCGAGGGACT-3’。

1.5 ROP15基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的弓形蟲RH 蟲株速殖子RNA 為模板，對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，再以cDNA 為模板，用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為（50 μL）：RP15-F、RP15-R 各2 μL，cDNA 模板5 μL，PCR Green Mix 25 μL，滅菌蒸餾水16 μL。PCR 循環(huán)參數(shù)為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，68 ℃ 45 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

1.6 pMD-19T-ROP15 基因克隆載體的構(gòu)建和測(cè)序

將瓊脂糖凝膠電泳鑒定正確的PCR 產(chǎn)物應(yīng)用DNA 膠回收試劑盒回收純化，連接pMD-19-T 載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coil）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR 篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序分析，測(cè)序正確的單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 pGEX-4T-ROP15原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用BamH I和XhoI雙酶切pGEX-4T-1原核表達(dá)載體和ROP15基因，膠回收雙酶切后的載體片段和ROP15 基因。將純化后的載體片段和ROP15基因連接，16 ℃過夜，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌（E.coil）DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR篩選陽(yáng)性單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和XhoI雙酶切鑒定，雙酶切產(chǎn)物應(yīng)用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確的單菌落送至送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序分析，測(cè)序正確的單菌落用于后續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)。

1.8 重組ROP15的誘導(dǎo)表達(dá)

測(cè)序鑒定正確的單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒pGEX-4T-ROP15，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）中，挑取單菌落接種至含Ampr的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)，于D600達(dá)到0.6 時(shí)，加入IPTG （終濃度為1 mmol/L），而后于16 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，5 000 r/min離心收集菌體沉淀。使用PBS懸浮菌體沉淀，冰浴超聲破碎菌體沉淀（30 min，超聲5 s，間歇9 s）至溶液透明，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，分離上清與沉淀，以未誘導(dǎo)菌體作為對(duì)照，聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定重組ROP15在大腸桿菌BL21（DE3）中的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.9 原核表達(dá)ROP15的純化

收集誘導(dǎo)表達(dá)的ROP15重組蛋白上清液，運(yùn)用GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂純化可溶性ROP15 重組蛋白，操作步驟如下：GSTSep Glutathione Agarose Resin 谷胱甘肽瓊脂糖樹脂裝柱，0.7 cm×2.5 cm，柱床體積為1 mL；使用緩沖液Binding Buffer 平衡5 個(gè)床體積，流速為1 mL/min；使用10 mL ROP15 重組蛋白上清液0.45 μm 濾膜過濾后上樣，流速為 1 mL/min；使用Washing Buffer再洗10個(gè)床體積，流速為1 mL/min；使用Elution Buffer 洗脫，流速為 1 mL/min，收集洗脫峰。純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定其純度，于-20 ℃保存純化后的ROP15重組蛋白。

1.10 ROP15多克隆抗體的制備

應(yīng)用弗氏不完全佐劑將純化后的ROP15 重組蛋白后進(jìn)行乳化（體積比1∶1），對(duì)新西蘭大耳白兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫，在初次免疫后于第2、4、6、8 周應(yīng)用弗氏不完全佐劑乳化ROP15 重組蛋白，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。末次免疫前耳緣靜脈采集新西蘭大白兔血液，分離血清測(cè)定抗體效價(jià)，在第9周終止免疫，心臟采集新西蘭大白兔血液，4 000 r/min 離心20 min，分離血清，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 Western-blot

收集弓形蟲RH 株速殖子，提取總蛋白后，取ROP15 重組蛋白和總蛋白各15 μL 進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。轉(zhuǎn)膜、封閉后，應(yīng)用制備的多克隆抗體血清為一抗震蕩孵育2 h，TBST 緩沖液洗滌3 次，然后應(yīng)用HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 為二抗孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌3 次，最后加入ECL 顯色2 min，觀察分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 弓形蟲RH 蟲株速殖子ROP15 基因的RTPCR擴(kuò)增

以弓形蟲RH蟲株速殖子RNA為模板，經(jīng)RTPCR 擴(kuò)增后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得924 bp基因片段（圖1），與已發(fā)布的弓形蟲RH 蟲株ROP15 ORF 序列長(zhǎng)度一致。對(duì)pMD-19T-ROP15重組克隆載體測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與弓形蟲RH 蟲株ROP15 ORF序列一致。

圖1 RT-PCR克隆ROP15基因結(jié)果Figure 1 The result of cloning ROP15 gene by RT-PCR

2.2 pGEX-4T-ROP15原核表達(dá)載體的鑒定

提取pGEX-4T-ROP15 質(zhì)粒進(jìn)行BamH I 和XhoI 雙酶切鑒定，獲得大小約為4 969 bp 和924 bp的2個(gè)基因片段（圖2），與預(yù)期結(jié)果一致。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示插入的ROP15基因無(wú)缺失和突變，表明pGEX-4T-ROP15原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)ROP15誘導(dǎo)表達(dá)。

圖2 原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-ROP15雙酶切結(jié)果Figure 2 The result of pGEX-4T-ROP15 digested by EcoR I and BamH I

2.3 ROP15的可溶性原核表達(dá)

ROP15蛋白誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE 電泳鑒定，于相對(duì)分子量為59 ku處出現(xiàn)1條蛋白條帶，與GST-ROP15 重組蛋白預(yù)期分子質(zhì)量相符合，且在誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的上清液中存在大量的GST-ROP15重組蛋白（圖3）。

圖3 pGEX-4T-ROP15誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Figure 3 The analysis of induced expression products of pGEX-4T-ROP15

2.4 ROP15可溶性蛋白的純化

將純化產(chǎn)物應(yīng)用SDS-PAGE電泳鑒定其純度，結(jié)果顯示純化后的蛋白純度良好（圖4）。

圖4 純化重組蛋白的SDS-PAGE分析Figure 4 The analysis of purified ROP15

2.5 Western-blot鑒定

重組ROP15蛋白和弓形蟲RH株速殖子總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后，以制備的ROP15多克隆抗體血清為一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG 為二抗，應(yīng)用Western-blot 鑒定重組ROP15 蛋白和弓形蟲RH 株速殖子總蛋白與多克隆抗體的反應(yīng)性，結(jié)果顯示反應(yīng)性良好（圖5）。

圖5 ROP15多克隆抗體的Western-blot分析Figure 5 The Western-blot analysis of polyclonal antibody against ROP15

3 討論

弓形蟲棒狀體基因家族編碼的棒狀體蛋白的生物學(xué)功能在弓形蟲的蟲體毒力和致病性方面發(fā)揮重要作用，因此，棒狀體蛋白已經(jīng)成為近年來(lái)學(xué)者研究弓形蟲病免疫預(yù)防的潛在靶標(biāo)。已經(jīng)有多種類型的研究聚焦于弓形蟲免疫抗原的篩選，這些篩選出的抗原中就包括多個(gè)棒狀體蛋白，而且數(shù)個(gè)棒狀體蛋白對(duì)小鼠弓形蟲病免疫效果已得到評(píng)價(jià)，如ROP2、ROP16、ROP18 等［4］。基因克隆和原核表達(dá)技術(shù)已經(jīng)在弓形蟲棒狀體蛋白、羊口瘡病毒ORF19 基因，小反芻獸疫N5蛋白等研究中有所應(yīng)用［4，17-18］。

棒狀體蛋白15（ROP15）、烯醇化酶2（enolase 2）、棒狀體蛋白4（ROP4）、致密顆粒蛋白14（GRA14）、棒狀體蛋白9（ROP9）是同時(shí)被鑒定出的與人和羊陽(yáng)性血清反應(yīng)的弓形蟲抗原。ROP4是弓形蟲速殖子在分裂過程中分泌至細(xì)胞外的Ⅰ型跨膜蛋白，其與速殖子的納蟲泡膜相關(guān)，而且在感染細(xì)胞內(nèi)發(fā)生磷酸化［19］。ROP2 和ROP4 重組抗原免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較顯著的體液免疫反應(yīng)［19］。ROP4也被認(rèn)為是小鼠慢性弓形蟲病合適的候選抗原［20］。ROP9是弓形蟲與瘧原蟲中同源的一個(gè)棒狀體蛋白，大小約為38 ku，該棒狀體蛋白在3個(gè)基因型的弓形蟲速殖子中都表達(dá)，在速殖子入侵宿主細(xì)胞時(shí)由棒狀體分泌，繼而結(jié)合至擴(kuò)張的納蟲泡膜上［21-22］。ROP16在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞時(shí)分泌至細(xì)胞內(nèi)，激活宿主的轉(zhuǎn)錄因子STAT3和STAT6［23-24］。ROP47 從速殖子分泌后轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞核內(nèi)，ROP47和ROP48基因缺失對(duì)Ⅱ型蟲株速殖子在小鼠體內(nèi)和體外的生長(zhǎng)并無(wú)明顯影響［25］。ROP1在腦包囊生長(zhǎng)的小鼠體內(nèi)被鑒定出，ROP1重組蛋白被認(rèn)為是檢測(cè)人急性弓形蟲病患者體內(nèi)弓形蟲特異性IgG抗體的潛在靶標(biāo)［26-27］。

2017 年，國(guó)內(nèi)有學(xué)者運(yùn)用基因敲除技術(shù)構(gòu)建了弓形蟲Ⅰ型強(qiáng)毒株15個(gè)棒狀體蛋白的缺失株，評(píng)價(jià)了這些缺失株在小鼠體內(nèi)和體外的增殖能力，提示ROP15可能在弓形蟲的生活史中發(fā)揮作用［16］。本研究克隆弓形蟲強(qiáng)毒株RH 蟲株速殖子ROP15 基因，表達(dá)和純化ROP15重組蛋白，為進(jìn)一步研究弓形蟲診斷試劑和疫苗的研發(fā)以及ROP15 在弓形蟲入侵宿主細(xì)胞的作用提供準(zhǔn)備。

4 結(jié)論

研究成功克隆了弓形蟲RH蟲株速殖子ROP15基因，大小為924 bp，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-4T-ROP15，誘導(dǎo)表達(dá)獲得了約59 ku 的可溶性ROP15 蛋白，成功純化，獲得了純度較高的重組ROP15蛋白，并制備了多克隆抗體。