田海軍，任勝杰，楊鐵柱，楊治國(guó)

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051）

十二烷基苯磺酸鈉（SDBS）因其高效去污性能，較強(qiáng)耐酸堿能力，不受水中的鈣、鎂等離子影響，分散、抗靜電性能優(yōu)良[1-3]，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)及日常生活中，隨工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水和日常生活污水持續(xù)大量地排入水體環(huán)境。SDBS 在水環(huán)境中自然降解速度慢，且易在水面形成大量積聚不散的泡沫層，影響水體的氧氣交換，使水質(zhì)惡化，產(chǎn)生生物毒性[4-6]。近年來對(duì)凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus νannamei）[7]、安氏偽鏢水蚤（Pseudodiaptomus annandalei）[8]、黃河鯉（Cyprinus carpio）[9]、褐點(diǎn)石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）[10]、刺參（Apostichopus japonicus）[11]、雙小核草履蟲（Paramecium primaurelia）[12]、中華倒刺鲃（Spinibarbus sinensis）[13]、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）[14]等水生動(dòng)物開展了SDBS的毒性研究，主要集中于SDBS 的急性毒性及高濃度條件下的生理生化的影響，然而實(shí)際環(huán)境相關(guān)濃度下的SDBS對(duì)魚類的亞急性毒性效應(yīng)尤其是遺傳毒性相關(guān)研究報(bào)道則較少。

魚類尤其是稚魚對(duì)水環(huán)境變化較為敏感。水環(huán)境中殘留的有害物質(zhì)通常會(huì)導(dǎo)致魚類血細(xì)胞發(fā)生異常，如細(xì)胞核的染色體發(fā)生畸變，形成微核現(xiàn)象[15-20]。水體有機(jī)污染物長(zhǎng)期對(duì)魚類的暴露可能會(huì)誘發(fā)DNA 氧化損傷[21-26]，研究表明陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉對(duì)草魚的暴露會(huì)造成氧化損傷[27]。且在所有DNA 核堿基中鳥苷最易被氧化生成8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），因此8-羥基脫氧鳥苷成為DNA 氧化損傷的特異性產(chǎn)物[28]。黃顙魚（Pelteobagrus fulνidraco）肉質(zhì)鮮美深受人們喜愛，是我國(guó)的特種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一，開展水環(huán)境污染物對(duì)黃顙魚生理生化及遺傳毒性的研究具有現(xiàn)實(shí)意義。本研究將黃顙魚稚魚暴露于不同質(zhì)量濃度的SDBS 中，應(yīng)用微核實(shí)驗(yàn)技術(shù)和單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)測(cè)定不同暴露濃度條件下的黃顙魚稚魚的紅細(xì)胞微核率和細(xì)胞尾部DNA損傷率，測(cè)定稚魚組織中8-羥基脫氧鳥苷的含量，以期為黃顙魚的健康養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料，同時(shí)也為科學(xué)評(píng)估水體環(huán)境濃度的SDBS遺傳毒性效應(yīng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用黃顙魚親本來自湖北省武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所，親本雌雄比例為1∶1，雌魚體長(zhǎng)（171.3 ±9.0）mm，體質(zhì)量（101.4 ± 16.5）g；雄魚體長(zhǎng)（242.1 ±11.6）mm，體質(zhì)量（193.4±19.6）g。親本300 尾在學(xué)院實(shí)訓(xùn)基地水泥池中流水加曝氣方式培育，設(shè)棕櫚產(chǎn)卵巢，巢為半球形（直徑25 cm，深12 cm）；培育水溫為（24.5 ± 0.3）℃，pH 為7.0～7.5，溶氧為6.70～9.50 mg/L；光暗周期為12 h：12 h，每日投喂2 次黃顙魚專用飼料。

1.2 主要試劑與儀器

SDBS 為分析純（國(guó)藥集團(tuán)河南化學(xué)試劑有限公司）。熒光顯微鏡（Olympus-IX81，日本奧林巴斯），電泳儀（DYCZ-32C，北京六一），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf 5424R，德國(guó)艾本德），酶標(biāo)儀（DR200-BC，無錫德朗），8-羥基脫氧鳥苷試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 稚魚暴露實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)挑選孵化120 h 后發(fā)育正常、大小相近的黃顙魚稚魚進(jìn)行染毒暴露實(shí)驗(yàn)。參考地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)及前期水樣中陰離子表面活性劑檢測(cè)數(shù)據(jù)，設(shè)定SDBS 暴露質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/L，每24 h 更換新配制的暴露溶液，以保證濃度恒定。每個(gè)濃度處理設(shè)置3組平行，暴露實(shí)驗(yàn)容器采用12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔放置30尾稚魚。暴露期間水溫保持（24.5±0.3）℃，光暗周期設(shè)置為12 h:12 h。暴露96 h 后，進(jìn)行紅細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)和DNA損傷評(píng)價(jià)。

1.4 稚魚紅細(xì)胞微核率測(cè)定

每組隨機(jī)挑取暴露后的黃顙魚稚魚6尾送實(shí)驗(yàn)室斷尾取外周血常規(guī)涂片吉姆薩染色。每組計(jì)數(shù)5 000 個(gè)清晰、完整染色的有核紅細(xì)胞，計(jì)算微核率[17-20]。

1.5 稚魚全魚細(xì)胞DNA損傷評(píng)價(jià)

每組經(jīng)SDBS暴露后的8尾稚魚先用0.1 mol/L、pH 7.2 的磷酸鹽緩沖液沖洗，然后將稚魚的全魚制成單細(xì)胞懸液；配制好的黃顙魚稚魚單細(xì)胞懸液再經(jīng)過彗星實(shí)驗(yàn)步驟處理后，在熒光顯微鏡下觀察有無彗星及彗尾的長(zhǎng)度、亮度、出尾率等[29]。其中裂解時(shí)使用的細(xì)胞裂解液：2.5 mol/L NaCl，100 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA），10 mmol/L Tris，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%肌氨酸鈉，pH=10，用前加入1%體積的Triton X-100、10%體積二甲亞砜。解旋時(shí)使用的堿性電泳緩沖液：1 mmol/L Na2EDTA，300 mmol/L NaOH，pH=13。電泳電壓25 Ⅴ，電流300 mA，低溫避光，電泳20～40 min。頭（尾）部DNA是指彗星細(xì)胞頭（尾）部DNA 的熒光強(qiáng)度，頭（尾）部DNA 占比是指細(xì)胞頭（尾）部DNA 的熒光強(qiáng)度占所有細(xì)胞DNA 總熒光強(qiáng)度的百分比[29]。DNA 損傷率是細(xì)胞尾部DNA 占比在2%以上的所有細(xì)胞數(shù)之和除以被觀察的細(xì)胞總數(shù)，DNA 損傷分級(jí)按尾部DNA 占比判斷：0 級(jí)，＜5%；1 級(jí)，5%～20%；2 級(jí)，20%～40%；3 級(jí)，40%～95%；4 級(jí)，＞95%[30]。采用CASP彗星分析軟件對(duì)彗星圖像統(tǒng)計(jì)分析DNA損傷率[29]。

1.6 稚魚組織中8-羥基脫氧鳥苷質(zhì)量濃度測(cè)定

每組隨機(jī)取15尾稚魚放入2 mL離心管，以質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 加入磷酸緩沖液（pH=7），在冰上進(jìn)行勻漿，4 ℃、2 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液測(cè)定8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）質(zhì)量濃度。按照試劑盒說明書進(jìn)行，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)條件下測(cè)定光密度值。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異檢驗(yàn)，采用單因素方差分析(one-way ANOⅤA)和鄧肯檢驗(yàn)(Duncan's)來對(duì)組間多重差異顯著性進(jìn)行比較，P ＜0.05表示有顯著差異。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，使用GraphPad 6.0.1繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同暴露濃度下稚魚紅細(xì)胞微核率

表1 顯示，SDBS 暴露質(zhì)量濃度為0～0.8 mg/L時(shí)，黃顙魚稚魚紅細(xì)胞微核率變化范圍為（0.22% ±0.02%）～（0.59% ±0.03%）。隨著SDBS 暴露濃度的升高，對(duì)應(yīng)黃顙魚稚魚紅細(xì)胞微核率顯著增加(P ＜0.05)，且不同組間差異顯著(P ＜0.05)。

表1 SDBS暴露濃度對(duì)黃顙魚稚魚紅細(xì)胞微核率的影響Table 1 Erythrocyte micronuclei rate of juvenile Pelteobagrus fulvidraco exposed to different concentrations of SDBS

2.2 不同暴露濃度對(duì)稚魚細(xì)胞DNA損傷的影響

如表2 所示，隨著SDBS 暴露濃度的升高，稚魚細(xì)胞頭部DNA（正常DNA）熒光強(qiáng)度逐漸降低，且SDBS 質(zhì)量濃度為0.8 mg/L 時(shí)，頭部DNA 占比顯著低于對(duì)照組及其他SDBS濃度組(P ＜0.05)。稚魚細(xì)胞尾部DNA（斷裂損傷DNA）占比伴隨SDBS暴露濃度的升高依次從1.1%顯著升高到5.2%(P ＜0.05),說明暴露濃度的升高顯著增加了稚魚細(xì)胞DNA損傷，尾部DNA占比顯著增加。隨著SDBS暴露濃度的升高，尾長(zhǎng)增加，尾距增大。與對(duì)照組相比，其他暴露濃度組黃顙魚稚魚全魚細(xì)胞頭部DNA、尾部DNA、尾部DNA占比、尾長(zhǎng)和尾矩差異顯著(P ＜0.05)。

表2 SDBS暴露濃度對(duì)黃顙魚稚魚DNA損傷的影響Table 2 Effect of SDBS exposure concentration on the DNA content of juvenile Pelteobagrus fulvidraco

2.3 暴露濃度對(duì)黃顙魚稚魚細(xì)胞尾部DNA 含量的影響

SDBS 暴露濃度與黃顙魚稚魚細(xì)胞尾部DNA占比的關(guān)系如圖1 所示，在SDBS 質(zhì)量濃度為0～0.8 mg/L 時(shí)，暴露濃度與稚魚細(xì)胞尾部DNA 占比呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)關(guān)系，對(duì)應(yīng)的回歸方程為=4.6x+1.48（R2=0.939 6，n=24,P ＜0.05）。

圖1 暴露濃度對(duì)黃顙魚稚魚細(xì)胞尾部DNA占比的影響Fig.1 Effect of SDBS exposure concentration on tail DNA percentage in the cell of juvenile Pelteobagrus fulνidraco

2.4 不同暴露濃度下黃顙魚稚魚DNA 損傷率及損傷等級(jí)

表3所示，從DNA 損傷率來看，SDBS暴露對(duì)黃顙魚稚魚細(xì)胞均具有不同程度的遺傳損傷，在9.4%～24.7%之間。

表3 不同暴露濃度下稚魚DNA損傷率及損傷等級(jí)Table 3 DNA damage rate and damage grade of juvenile Pelteobagrus fulvidraco under different exposure concentrations

從損傷等級(jí)結(jié)果來看，0.2～0.6 mg/L 暴露質(zhì)量濃度的SDBS 對(duì)黃顙魚稚魚細(xì)胞的損傷程度均為1級(jí)，0.8 mg/L 暴露質(zhì)量濃度的SDBS對(duì)稚魚具有1級(jí)損傷和一定比例的2 級(jí)損傷，但1、2 級(jí)的損傷DNA都具有可恢復(fù)性，表明SDBS 暴露對(duì)黃顙魚稚魚的遺傳毒性為低毒性。

2.5 不同暴露濃度下黃顙魚稚魚組織中8-羥基脫氧鳥苷含量

如圖2所示，SDBS暴露質(zhì)量濃度為0～0.8 mg/L時(shí)，黃顙魚稚魚組織中8-羥基脫氧鳥質(zhì)量濃度為（1.7 ± 0.36）～（8.0 ± 0.58）μg/L。隨著SDBS 暴露濃度的升高，對(duì)應(yīng)黃顙魚稚魚組織中8-羥基脫氧鳥苷質(zhì)量濃度顯著增加(P ＜0.05)。

圖2 SDBS暴露濃度對(duì)黃顙魚稚魚組織8-羥基脫氧鳥苷含量的影響Fig.2 Effect of SDBS exposure concentration on the mass concentrationt of 8-hydroxydeoxyguanosine in juvenile Pelteobagrus fulνidraco tissues

3 討論

SDBS 可隨日常生活污水和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水等大量排入水體環(huán)境，因水體降解能力有限，SDBS 很容易在水面形成大量積聚不散的泡沫層，泡沫層會(huì)影響水體的氧氣交換，使水質(zhì)惡化，而且會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，產(chǎn)生生物毒性[4-6]。劉淑英等[31]研究表明，暴露在質(zhì)量濃度為25 mg/L 直鏈烷基苯磺酸鈉等洗滌劑中，鯽（Carassius auratus）鰓組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，膜通透性增大。同時(shí)，SDBS 能通過抑制機(jī)體的抗氧化作用從而造成細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷，影響DNA 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等[32]。產(chǎn)生遺傳毒性的原因可能是SDBS可顯著改變表(界)面的物理化學(xué)性質(zhì)，與細(xì)胞膜表面疏水部分結(jié)合，破壞了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[33-35]。陳清香等[8]研究表明，SDBS對(duì)不同發(fā)育期稚魚毒性效應(yīng)不同，對(duì)魚卵和仔稚魚或更小規(guī)格稚魚影響更大。楊代勤等[36]研究表明，小規(guī)格稚魚呼吸系統(tǒng)不完善，依靠皮膚等器官呼吸，接觸洗滌劑多；而大規(guī)格稚魚可游至水面吞噬空氣，因此吸入洗滌劑較少，導(dǎo)致其抗毒性增強(qiáng)。

魚類長(zhǎng)期生活在水中，尤其是稚魚對(duì)水環(huán)境污染物更為敏感，可通過檢測(cè)魚類紅細(xì)胞微核率指示水環(huán)境污染狀況[17-20]。水體表面活性劑暴露對(duì)魚類的紅細(xì)胞微核率影響的研究報(bào)道僅見于黃鱔(Monopterus albus)和麥穗魚(Pseudorasbora parνa)中。唐琳等[37]發(fā)現(xiàn)，洗衣粉對(duì)黃鱔紅細(xì)胞的損傷主要表現(xiàn)為微核率的增高，且在一定范圍內(nèi)，隨著洗衣粉濃度的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，微核率升高，洗衣粉75 mg/L 處理組的微核率達(dá)到顯著差異水平。張海艷等[38]研究十二烷基硫酸鈉在0～7.5 mg/L的濃度范圍對(duì)麥穗魚(P.parνa)仔魚微核的產(chǎn)生具有明顯的影響，且隨著濃度的升高而增加，微核率升高速率在4.3～5.6 mg/L 范圍內(nèi)變慢，可能是高濃度的十二烷基硫酸鈉除對(duì)細(xì)胞染色體有一定的損傷外，還對(duì)細(xì)胞分裂產(chǎn)生干擾，使微核的產(chǎn)生變得緩慢。本研究發(fā)現(xiàn)SDBS 暴露質(zhì)量濃度為0～0.8 mg/L 時(shí)，黃顙魚稚魚紅細(xì)胞微核率變化范圍為（0.22±0.02）%～（0.59±0.03）%。隨著SDBS 暴露濃度的升高，對(duì)應(yīng)黃顙魚稚魚紅細(xì)胞微核率也在顯著增加。以上結(jié)果說明SDBS等洗滌劑暴露能夠誘發(fā)魚類紅細(xì)胞染色體異常。

單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)可以靈敏地檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞遺傳物質(zhì)DNA損傷，在水環(huán)境污染監(jiān)測(cè)以及有機(jī)污染物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物機(jī)體的遺傳損害等方面有廣泛的應(yīng)用[21-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，SDBS 暴露對(duì)黃顙魚稚魚血細(xì)胞的DNA 損傷呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。王曉艷等[39]也發(fā)現(xiàn)石油烴濃度在0.08 mg/L 在短時(shí)間內(nèi)即可對(duì)櫛孔扇貝（Azumapecten farreri）血細(xì)胞DNA 造成損傷，扇貝DNA 損傷程度與石油烴濃度呈明顯的量效關(guān)系。周海龍等[40]的研究也表明，多氯聯(lián)苯、苯并[a]芘、滴滴涕等典型的持久性污染物對(duì)紫貽貝（Mytilus edulis）不同組織中DNA 損傷作用均存在較為明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。這說明暴露在不同濃度污染物下的水生生物組織中的DNA 損傷效應(yīng)隨著水污染暴露濃度的增加以及暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

DNA 氧化性損傷是最常見的遺傳物質(zhì)損傷之一，而8-羥基脫氧鳥苷是反應(yīng)DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物，定量檢測(cè)8-羥基脫氧鳥苷水平能夠反映DNA 氧化損傷的程度，對(duì)疾病的早期診斷和治療至關(guān)重要[41]。當(dāng)前通過檢測(cè)魚類8-羥基脫氧鳥苷水平來反應(yīng)DNA氧化損傷的程度僅見少量報(bào)道，大多數(shù)研究對(duì)象是面向職業(yè)暴露鎳、鉻、汞等方面的工人[42-45]或者小鼠等。劉思思等[46]研究鎘暴露導(dǎo)致錦鯉（Cyprinus carpio）腎臟8-羥基脫氧鳥苷水平明顯升高。王曉樂[47]研究發(fā)現(xiàn)啶磺草胺會(huì)引起斑馬魚（Danio rerio）胚胎和幼魚體內(nèi)8-羥基脫氧鳥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著升高，進(jìn)而對(duì)斑馬魚造成DNA 損傷，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著SDBS 暴露濃度的升高，對(duì)應(yīng)黃顙魚稚魚組織中8-羥基脫氧鳥苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)也在顯著增加，且不同組間差異顯著。結(jié)果提示0.2～0.8 mg/L 的SDBS 暴露造成了黃顙魚稚魚組織中DNA 氧化性損傷的生物標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷水平的顯著增加。SDBS 能通過抑制機(jī)體的抗氧化作用從而造成細(xì)胞遺傳物質(zhì)的損傷，影響DNA 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)等[32]。丁詩(shī)華等[27]研究結(jié)果表明，采用陰離子表面活性劑直鏈烷基苯磺酸鈉進(jìn)行草魚(Ctenopharyngodon idella)毒性試驗(yàn)時(shí)，可使草魚機(jī)體產(chǎn)生活性氧，體內(nèi)的抗氧化酶活性發(fā)生改變，從而造成氧化損傷。

本研究探討了不同暴露濃度的黃顙魚稚魚的紅細(xì)胞微核率和DNA 損傷率，分析了SDBS 對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的遺傳毒性影響的機(jī)制，但對(duì)黃顙魚遺傳毒性潛在的分子及代謝機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。