鄭宗耀,陳智鵬,曾觀娣

(暨南大學 生命科學技術學院 腫瘤分子生物學教育部重點實驗室,廣東 廣州 510632)

肺癌仍是我國乃至世界發(fā)病率和死亡率最高的癌癥［1-2］。肺癌可分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌,其中非小細胞肺癌占80%～85%。目前已知肺癌發(fā)生主要與致癌基因(如EGFR及KRAS突變、ALK重排)的改變有關［3］。因此,驅(qū)動基因的鑒定與藥物開發(fā)是肺癌研究領域的重點［3］。盡管靶向療法在一些患者身上已取得了良好效果,但是仍有相當一部分患者對靶向藥物響應不佳或者產(chǎn)生耐藥。因此,肺癌的發(fā)病及耐藥產(chǎn)生的確切機理仍需闡明。

肺癌異質(zhì)性是當前治療未響應及耐藥產(chǎn)生的潛在原因［4-5］。癌癥干細胞(cancer stem cells,CSCs),除了有活躍的端粒酶活性,可能導致基因不穩(wěn)定,發(fā)生癌變;還有無限制且高效的增殖能力,其所在的組織、器官等部位自我更新率越快,腫瘤的發(fā)生率也越高;并且與腫瘤起始、惡性發(fā)展、耐藥有關［6-7］,是引起實體瘤異質(zhì)性的重要原因。近年來研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉變(epithelial-mesenchymal transition,EMT)可促進癌細胞干性和腫瘤起始能力,因此被認為是CSCs的來源之一［8-9］。另外,EMT賦予癌細胞遷移、侵襲、抗凋亡和耐藥的能力,增加了治療難度［8］。

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是EMT主要調(diào)控因子,主要通過經(jīng)典Smad依賴通路和非經(jīng)典Smad通路,激活EMT相關的轉錄因子和miRNAs,改變表觀遺傳特征,誘導上皮細胞EMT,獲得干性和耐藥能力［10-14］。另外,TGF-β信號受到Smad7蛋白、mRNA可變剪切和翻譯后修飾等調(diào)控［11］。而且TGF-β在腫瘤中與相關的免疫微環(huán)境息息相關,影響分化淋巴前體的命運和腫瘤內(nèi)多個白細胞亞群的活性［15］。由此可見,TGF-β的分化信號涉及多個通路的相互協(xié)調(diào)作用。因此,在此過程中仍存在未知的調(diào)控機制。

線粒體是細胞物質(zhì)能量代謝和信號中心,參與調(diào)控包括代謝、增殖、分化等多個細胞進程［16］。另外,線粒體形態(tài)和質(zhì)量控制與其不同功能和活性的發(fā)揮有密切聯(lián)系［17］。在癌癥中,生長因子和線粒體基因突變等因素可引起線粒體代謝功能的重編程,而線粒體所反饋的信號可調(diào)控相應的信號通路,影響染色質(zhì)結構、轉錄和翻譯,促進癌細胞惡性發(fā)展,并且線粒體控制生物體能量代謝,其功能受損容易導致高乳酸環(huán)境產(chǎn)生,促進癌癥進展［16,18］。目前線粒體與癌細胞EMT的關系尚不清楚,本研究基于TGF-β誘導的肺癌A549細胞EMT模型,探索線粒體在細胞接受分化信號時的變化和線粒體對細胞發(fā)生EMT的影響,并闡明其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

A549細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC。HEK293T細胞購自中國科學院上海細胞庫。包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G、pLKO-tet-puro購自Addgene。pLVX-TetOne-Puro質(zhì)粒來源于Clontech。pGL3、Renilla熒光素酶表達質(zhì)粒和pRL-TK海參熒光素酶表達質(zhì)粒來源于實驗室自保存。購買的其他試劑包括:兔抗人Smad2和E-cadherin單克隆抗體(CST);鼠抗人vimentin(Santa)和β-actin(Sigma)單克隆抗體;鼠和兔HRP二抗(sigma);Dual-Luciferase? Reporter Assay System(Promega);Trizol(Invitrogen);TGF-β抑制劑SB431542(MCE);PI3K 抑制劑LY294002(MCE);AKT抑制劑MK-2206(MCE);RT試劑盒(愛柏夢);SYBR green核酸染料(Monad);Lipofectamine 3 000(Invitrogene);胎牛血清(Gibco);RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Gibco);PBS磷酸鹽緩沖液(Servicebio);蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Biotech Roche);RIPA蛋白裂解液(碧云天);線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)(碧云天);四環(huán)素(DOX,Solarbio);BCA試劑盒(Thermo Fisher Scientific);Western blot PVDF膜(Millipore);青鏈霉素抗生素(Gibco);胰酶(Gibco);嘌呤霉素(Sigma);ECL超敏化學發(fā)光試劑(Millipore)。

主要儀器:凝膠成像儀(FUSION FX);熒光定量PCR儀(Bio-Rad);流式細胞分析儀(BD)。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

實驗所用細胞系均用新配制的RPMI-1640完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素抗生素)重懸細胞,經(jīng)吹打混勻后接種于培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。待貼壁細胞完全生長匯合后,用0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化傳代,待細胞擴增至一定數(shù)量后,收獲細胞進行相關實驗。HEK293細胞用新配制的DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素抗生素)培養(yǎng)。

1.2.2 載體構建

PGC-1α啟動子表達質(zhì)粒和DOX誘導表達的Smad2或PGC-1α敲低質(zhì)粒按照基因表達載體標準構建方法構建。其中所用到的shRNA序列信息來源于Sigma Mission shRNA文庫shPPARGC1A (TRCN0000364085和TRCN0000364084),shSMAD2(TRCN0000040035和TRCN0000040036),構建pLVX-tet-PPARGC1A-3XFLAG。所用引物序列為前引物:5’-TCCTACCCTCGTAAAGAATTCATGGA-TGAGACCTCCCCAAGG-3’;后引物:5’-GTCTTTG-TAGTCAGGCGCGCCCCTGCGCAAGCTTCTCTGAG-3’。

PGC-1α報告基因質(zhì)粒構建,根據(jù)軟件預測,人PGC-1α轉錄本1的轉錄起始位點前2 000 bp有2個潛在的SEB結合位點,因此通過PCR擴增其轉錄起始位點前2 000 bp序列并構建到pGL3載體。所用引物序列為前引物:5’-TTTCTCTATCGATAGGTACCATGTGTTAGGGCAA-ATAACCATGT-3’;后引物:5’-AGTACCGGAAT-GCCAAGCTTCTGAATGACGCCAGTCAAGC-3’。

1.2.3 慢病毒感染

將兩種包裝質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)和pLKO-tet-puro對照或相同用于表達PGC-1α或shSmad2、shPGC-1α分別一起轉染HEK293細胞。24 h后,細胞再換新培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。收集上述含有慢病毒的培養(yǎng)液上清,0.45 μm濾膜過濾,病毒上清和A549細胞懸混液以體積比1∶1混合感染,期間添加polybrene(8 μg/mL)增加慢病毒感染效率。感染后的細胞經(jīng)嘌呤霉素(0.5 μg/mL)篩選7 d,隨后驗證構建好的細胞穩(wěn)轉株中目的蛋白表達情況。

1.2.4 JC-1染色檢測細胞膜電位

收集經(jīng)藥物處理后的細胞計數(shù)后,取(1～6)×105個細胞,重懸于0.5 mL細胞培養(yǎng)液中,加入0.5 mL JC-1染色工作液,顛倒數(shù)次混勻。細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min。孵育結束后,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細胞。棄上清,用預冷的JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次:加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細胞,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細胞,棄上清。再加入1 mL JC-1染色緩沖液(1×)重懸細胞,1 200 r/min 4 ℃離心3～4 min,沉淀細胞,棄上清。再用適量JC-1染色緩沖液(1×)重懸后,進行流式細胞術分析。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測細胞ROS水平

按照VDCFH-DA∶V無血清培養(yǎng)液=1∶1 000的比例稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmoL/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中,細胞密度為(1～20)×107/mL,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下,使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次,以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA,隨后進行流式細胞術分析。

1.2.6 RT-PCR檢測mRNA表達情況

使用Trizol試劑提取總RNA,并逆轉錄為cDNA,于-80 ℃保存。后續(xù)進行熒光實時PCR分析以測量指定基因的mRNA水平,qPCR的反應條件為①激活:50 ℃,持續(xù)2 min;②預浸泡:95 ℃ 10 min;③變性:95 ℃ 15 s;退火:60 ℃ 1 min;④熔解曲線:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。數(shù)據(jù)所示的是標準化為β-Actin的相對mRNA表達水平?；蛱禺愋砸镄蛄幸姳?。采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 The sequences of the primers for RT-qPCR

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達情況

全細胞裂解物通過使用RIPA裂解緩沖液裂解,其中各加入100×蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(Roche),蛋白質(zhì)量濃度通過BCA試劑盒測定。易溶蛋白(30～40 μg)經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,而后轉移至PVDF膜,快速封閉液室溫封閉1 h,經(jīng)TBST(含0.1%吐溫-20,下同)洗滌1次后分別4 ℃孵育一抗過夜,第2天TBST洗滌5次,5 min/次,再室溫孵育二抗(V二抗∶V抗稀釋液=1∶5 000)1 h,最后用ECL超敏化學發(fā)光試劑顯影,凝膠成像儀曝光成像并分析灰度值。

1.2.8 報告基因?qū)嶒?/p>

將HEK293細胞提前鋪于6孔板,待細胞完全貼好后轉染基于pGL3構建的PGC1啟動子表達質(zhì)粒2 μg,同時也轉染50 ng pRL-TK載體作為轉染效率控制。24 h后將細胞分為對照組和實驗組接種于12孔板,對照組和實驗組分別進行DMSO和TGF-β處理,最后用雙熒光發(fā)光試劑盒和酶標儀檢測。

1.2.9 劃痕損傷修復實驗

將細胞接種6孔板培養(yǎng)至單層匯合狀態(tài),用200 μL吸頭尖每孔劃平齊的橫線,PBS洗去未貼壁細胞,加入含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,對照組不給予DOX誘導,實驗組進行1 μg/mL DOX誘導,于培養(yǎng)0 h和48 h鏡下觀察并拍照,ImageJ 8.0軟件分析劃痕愈合程度。

1.2.10 Transwell遷移實驗

將Transwell小室置于24孔板,細胞消化后用含0.5% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸,取2×104個細胞接種于Transwell小室的上室,體積為200 μL。在Transwell小室的下室中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 μL,對照組不給予DOX誘導,實驗組進行1 μg/mL DOX誘導,置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)結束后取出小室并用4%中性甲醛固定15 min,0.1%結晶紫液染色5 min,用棉簽小心擦除小室上室面細胞,PBS洗滌后在顯微鏡鏡下觀察并拍照。以穿膜的細胞數(shù)差異代表細胞運動能力的改變。每張膜選2個典型視野,每組重復3孔。

1.2.11 CCK-8實驗

取提前準備好的生長狀況良好的細胞,將其用胰酶消化,培養(yǎng)基重懸,制成單細胞懸液。細胞計數(shù)之后,將其平均分配到96孔白色透明板中。將細胞分為對照組及DOX組,DOX組中加入1 μg/mL DOX。每孔1 000個細胞、100 μL的培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),每孔加入10 μL CCK-8試劑后孵育1 h,酶標儀讀取各孔吸光度D(450 nm),此后每24 h按此法檢測1次,每組設3復孔,取均值。實驗設置天數(shù)為6 d。

1.2.12 Sphere實驗

取提前準備好的生長狀況良好的細胞,將其用胰酶消化,培養(yǎng)基重懸,制成單細胞懸液。細胞計數(shù)之后,將細胞按照實驗需要進行分組,并且按照300個/孔接種到低貼附性的6孔板中,6孔板中需要提前加入配置好的sphere培養(yǎng)(DMEM/F12 培養(yǎng)基,20 μL/mL B27,20 ng/mL FGF和20 ng/mL EGF),放置在37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周,期間每5 d添加相應的sphere培養(yǎng)基和DOX(1 μg/mL),每組實驗設置3個復孔。待到球體長成后,輕輕搖勻培養(yǎng)皿將球體聚攏到中央,然后將其置于顯微鏡下拍照記錄,其中取球體直徑到達200 nm以上的細胞為計數(shù)標準。

1.3 統(tǒng)計學分析

用GraphPad prism6統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)代表3個獨立實驗并且是通過非配對t檢驗分析或者One-way ANOVA分析,誤差條表示SEM。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TGF-β在誘導A549細胞EMT過程中對線粒體表型的影響

基于所報道過的TGF-β誘導A549細胞EMT的模型［19］,開展實驗以評價TGF-β處理對A549細胞線粒體表型的影響。結果顯示,TGF-β可顯著促進線粒體膜電位增加(P<0.05,圖1A)。另外,細胞ROS水平也顯著增加(P<0.01,圖1B),過量ROS反過來會對線粒體造成損傷。進一步通過RT-PCR檢測線粒體基因的表達,同樣發(fā)現(xiàn)TGF-β顯著抑制這些基因的表達(P<0.01,圖1C)。上述實驗結果證明TGF-β處理引起A549細胞線粒體表型改變,對線粒體的功能具有抑制作用。

A:TGF-β刺激與否線粒體膜電位的比較;B:TGF-β刺激與否線粒體ROS水平的比較;C:TGF-β刺激與否線粒體基因表達的比較。1) P<0.05

2.2 TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路對線粒體表型的影響

為了確定TGF-β是通過Smad通路引起線粒體表型改變的,分別通過TGF-β受體抑制劑和Smad2敲低的方法對此現(xiàn)象進行驗證。結果發(fā)現(xiàn)SB431542可顯著抑制TGF-β引起的細胞ROS水平增加(P<0.01,圖2A)。本研究構建了Smad2可誘導敲低的A549細胞株,在DOX誘導下可顯著敲低A549細胞中的Smad2表達(P<0.001,圖2B)。利用此細胞株,發(fā)現(xiàn)Smad2敲低后,可抑制TGF-β引起的細胞ROS水平增加(P<0.05,圖2C)。進一步檢測細胞線粒體基因的表達發(fā)現(xiàn),Smad2敲低可恢復TGF-β引起的線粒體基因表達下調(diào)(P<0.01,圖2D)。綜上所述,TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路引起A549細胞線粒體表型改變。

A:各組線粒體ROS水平比較;B:蛋白質(zhì)印跡評估構建的 A549-tet-shSmad2 細胞中的 Smad2 敲低效率;C:各組線粒體基因表達比較。1)P<0.05。SB:TGFBR抑制劑 SB431542

2.3 TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路對PGC-1α轉錄的影響

PGC-1α是調(diào)控線粒體功能及線粒體基因表達的一個重要基因,通過對mRNA水平的檢測,發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制PGC-1α的表達(P<0.01,圖3A)。利用本研究所構建的PGC-1α報告基因,發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制其轉錄活性(P<0.01,圖3B)。進一步通過多個抑制劑的分析,發(fā)現(xiàn)PGC-1α的轉錄表達受經(jīng)典Smad通路調(diào)控(圖3C)。上述結果說明TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路抑制PGC-1α的轉錄表達而發(fā)揮作用。

2.4 PGC-1α恢復TGF-β引起的線粒體基因表達下調(diào)

為驗證TGF-β是否可通過PGC-1α影響線粒體基因的表達,構建了PCG-1α可誘導表達的A549細胞株,結果顯示DOX可顯著促進PGC-1α表達增加(P<0.001,圖4A)。在此細胞株中,當誘導PCG-1α表達時,可恢復TGF-β引起的線粒體基因表達下調(diào)(圖4B)。以上實驗結果說明TGF-β造成的細胞線粒體功能改變是通過影響下游效應分子PGC-1α的表達所致。

A:TGF-β處理與否的A549 PGC-1α mRNA水平比較;B:通過PGC-1α啟動子報告基因測定評估PGC-1α在TGF-β處理中的轉錄活性;C:各組PGC-1α mRNA的表達比較。1) P<0.05.SB:TGFBR抑制劑SB431542,LY:PI3K 抑制劑 LY294002,MK:AKT 抑制劑MK-2206

A:通過RT-PCR評估構建的A549-tet- PGC-1α細胞中PGC-1α的表達;B:A549-tet-PGC-1α細胞中相應處理后各組間線粒體基因表達比較 1) P<0.05

2.5 PGC-1α敲低對A549細胞EMT的影響

為驗證TGF-β抑制PGC-1α表達是促進A549細胞EMT的機制之一,構建了PCG-1α可誘導敲低的A549細胞株模擬TGF-β抑制PGC-1α表達的作用。首先,DOX可顯著誘導PCG-1α表達下調(diào)(P<0.01,圖5A)。通過免疫印跡實驗,發(fā)現(xiàn)PCG-1α誘導敲低后引起細胞上皮標記物E-cadherin表達顯著下調(diào)(P<0.01),而間質(zhì)標志物Vimentin表達上調(diào)(圖5B)。劃痕損傷修復和Transwell遷移實驗結果顯示,PGC-1α敲低增加了細胞損傷修復能力(圖5C-D)。CCK-8實驗結果顯示PGC-1α敲低并未明顯改變細胞的生長速率(圖5E),因此可排除細胞增殖導致的可能性。PGC-1α敲低除了可以促進細胞損傷修復能力之外,對腫瘤細胞的干性能力也起到了促進作用(圖5F)。綜上所述,TGF-β通過經(jīng)典的Smad通路抑制PGC-1α的轉錄表達,進而影響線粒體的功能,癌細胞為了改善生存條件及獲取更為充分的營養(yǎng),一方面趨向于向干細胞樣轉化,另一方面也趨向于EMT途徑。

A:評估構建的 A549-tet-shPGC-1α細胞中PGC-1α的敲低效率;B:A549-tet-shPGC-1α細胞中E-cadherin、Vimentin和β-actin的檢測及定量結果;C:劃痕試驗的代表性圖像和定量結果(×100);D:Transwell 遷移分析的代表性圖像和定量結果 (×100);E:CCK-8實驗結果;F:Sphere分析的代表性圖像和定量結果 (×100)。1) P<0.05

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β可通過經(jīng)典的Smad通路改變肺癌細胞線粒體的表型與功能。進一步的機制探索發(fā)現(xiàn),TGF-β調(diào)控負責線粒體生物合成及代謝的轉錄共調(diào)控因子PGC-1α的表達,改變線粒體的表型和功能。反過來,線粒體的改變促進肺癌細胞EMT表型的增加。

EMT是發(fā)育的逆分化過程,即在EMT期間,通過相關的金屬基質(zhì)酶將細胞-細胞連續(xù)嵌入的非運動、極化上皮細胞形成的細胞集合溶解并轉化為單個的、非極化、運動和侵入性間充質(zhì)細胞［20-22］。在病理情況下,如腫瘤中EMT可使分化細胞向干細胞樣細胞轉變,促進癌細胞遷移、侵襲、轉移和耐藥［10-11］。TGF-β是其中重要的調(diào)控因子之一,目前已報道TGF-β在多種癌癥中通過EMT促進腫瘤的惡性進展,包括乳腺癌、肝癌、胰腺癌及肺癌等［23-27］。TGF-β與其受體TGFBR1/2結合,主要通過經(jīng)典Smad和非經(jīng)典Smad信號通路調(diào)控細胞EMT［11］。有研究報道FOXA1和PGC-1α響應TGF-β參與EMT［28］及PGC-1α介導脂肪酸氧化促進鼻咽癌細胞EMT［29］,但其并未詳細研究肺癌患者線粒體功能在此過程中扮演什么角色。作為細胞的能量工廠,線粒體的表型和功能改變與干細胞分化或成體細胞逆分化有著密切關系［16］。此過程涉及多個生物進程的調(diào)控,仍有許多未知的新機制有待闡明。本研究首先驗證TGF-β對線粒體表型和功能的影響。利用TGF-β誘導肺癌A549細胞EMT的模型,通過流式檢測評價線粒體膜電位和ROS水平的變化,結果顯示TGF-β顯著地促進線粒體膜電位和ROS的增加［19］。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)線粒體生成和氧化磷酸化功能相關基因在TGF-β處理后顯著下調(diào),這些表型改變提示TGF-β抑制線粒體的功能。進一步通過TGF-β受體抑制劑和Smad2可誘導敲低的方式抑制TGF-β信號激活,可以顯著恢復線粒體功能和線粒體相關基因的表達。這些結果表明TGF-β對線粒體的作用是通過經(jīng)典的Smad信號通路調(diào)控的。

代謝重編程是癌細胞的特征,線粒體的功能和代謝網(wǎng)絡發(fā)生改變,細胞ATP的合成方式由氧化磷酸化轉變成以有氧糖酵解途徑為主,即所謂的“瓦勃效應”,從而也增加營養(yǎng)攝取和生物原料合成,并反饋影響細胞轉錄和翻譯,促進腫瘤生長和惡性發(fā)展［30-31］。PGC-1α是線粒體生成和代謝調(diào)控的共轉錄因子,PGC-1α的表達促進細胞的代謝功能,抑制癌細胞的發(fā)生發(fā)展［29,32］。在本研究中,為探討TGF-β對線粒體的作用,利用RT-PCR檢測TGF-β對PGC-1α表達的影響,結果發(fā)現(xiàn)TGF-β可顯著抑制PGC-1α的mRNA水平?；蚪Y果也顯示TGF-β可抑制PGC-1α的轉錄活性。TGFBR抑制劑可恢復TGF-β對PGC-1α的抑制作用,這與敲低Smad2抑制TGF-β信號通路可恢復線粒體相關基因表達的結果一致。另外,為證明PGC-1α對線粒體代謝功能的影響,構建可誘導PGC-1α過表達的A549細胞系,當PGC-1α過表達,可顯著恢復由于TGF-β引起的線粒體代謝相關基因的表達下調(diào)。實驗表明,TGF-β在誘導A549細胞EMT過程中,通過抑制Smad通路抑制PGC-1α的表達,從而影響線粒體代謝功能。

目前Torrano等［32］發(fā)現(xiàn)PGC-1α在多個癌種中表達下調(diào),而且其下調(diào)可促進癌細胞的轉移,且有研究表明在胸主動脈瘤中TGF-β信號傳導參與PGC-1α調(diào)節(jié)［33］。為驗證PGC-1α下調(diào)在TGF-β誘導的EMT模型中的作用,本研究利用PGC-1α可誘導敲低的A549細胞系來模擬TGF-β引起的PGC-1α表達下調(diào)的效果。當PGC-1α誘導敲低后,細胞的上皮標志物E-cadherin表達下調(diào),而間質(zhì)標志物Vimentin表達上調(diào)。另外,通過細胞的損傷修復和遷移實驗證明了PGC-1α的敲低可顯著增加細胞的遷移能力,這是癌細胞發(fā)生轉移的前提。由此表明,PGC-1α下調(diào)促進細胞的EMT表型。

綜上,本研究的結果表明TGF-β能夠抑制線粒體的代謝功能,反過來由于線粒體的代謝功能受到抑制,細胞為了能夠獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì)及改善生存條件,進而促進了細胞EMT。本研究在細胞水平上揭示了TGF-β信號通過線粒體調(diào)控細胞EMT的新機制,為理解腫瘤細胞EMT這種逆分化現(xiàn)象提供了新思路,并為此通路的靶向治療提供理論基礎。

作者貢獻聲明

鄭宗耀:提出研究思路和框架,修改論文;陳智鵬:實驗和數(shù)據(jù)分析指導;曾觀娣:設計實驗、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù),撰寫論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助,不存在潛在利益沖突。