趙婷，張惠蘭，沈浩，馮杰，劉思明，王婷婷，李紅健，于魯海

伏立康唑（voriconazole）可用于預(yù)防接受異基因造血干細(xì)胞移植（hematopoietic stem cell，HSCT）的高危病人的侵襲性真菌感染［1-2］。伏立康唑具有非線性動力學(xué)特征［3］，血藥濃度治療窗狹窄（0.5～5.0 mg/L）［4］。目前，伏立康唑在維吾爾族異基因HSCT高危病兒中的治療藥物監(jiān)測數(shù)據(jù)有限。因此，我們采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatogra?phy-tandem mass spectrometry assay，LC-MS/MS）技術(shù)來靈敏、快速檢測伏立康唑穩(wěn)態(tài)血漿谷濃度，并探討伏立康唑血漿谷濃度在異基因HSCT 病兒中的分布特征。

1 方法

1.1 儀器、試劑和試藥高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（4500 型，上海AB SCIEX 分析儀器有限公司）；電子天平（BP221S型，德國賽多利斯公司）。伏立康唑和伏立康唑同位素內(nèi)標(biāo)均購自中國食品藥品檢定研究院（純度>98%）；色譜甲醇、甲酸（美國Fisher公司）。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件色譜條件：色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C18 柱（3.0×50 mm，2.5 μm），流動相A：0.1%的甲酸水溶液，流動相B：0.1%的甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0~0.2 min，A 95%~B 5%；0.2~1.2 min，A 70%，B 30%；1.2~2.4 min，A 30%，B 70%；2.4~1.3 min，A95%，B 95%）；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流速0.4 mL/min。

質(zhì)譜條件：正離子模式；離子噴射電壓：5 500 V；溫度：600 ℃；GSl：50；GS2：50；Curtain gas：30。伏立康唑離子對350.2/127.1，同位素內(nèi)標(biāo)離子對353.2/130.1，碰撞能量均為20 eV。

1.3 溶液的配置精密稱取伏立康唑內(nèi)標(biāo)10 mg和同位素內(nèi)標(biāo)1 mg，用甲醇配置成濃度為1 mg/L 儲備液和5 mg/L 內(nèi)標(biāo)溶液。再稀釋配制伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液（濃度為2、5、10、20、50、100、200 mg/L）。同時，以甲醇分別配置4 種具有代表性伏立康唑濃度水平的質(zhì)控樣品溶液，即定量下限（lower limit of quantification，LLOQ，2.0 mg/L）、低濃度質(zhì)控（low quality control，LQC，5.0 mg/L）、中濃度質(zhì)控（middle quality control，MQC，60.0 mg/L）和高濃度質(zhì)控（high quality control，HQC，150.0 mg/L）。

1.4 方法學(xué)考查

1.4.1專屬性考察 測定并記錄空白血漿、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)液、空白血漿+內(nèi)標(biāo)、空白血漿+伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)液+內(nèi)標(biāo)和病兒樣品色譜圖，具體見圖1。

圖1 伏立康唑和內(nèi)標(biāo)色譜圖：A為空白血漿；B為空白血漿+內(nèi)標(biāo)；C為空白血漿+伏立康唑；D為病兒血漿樣品

1.4.2線性關(guān)系考察和定量下限測定 在80 μL 空白血漿中分別加入伏立康唑標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液10μL 和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，得到0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本溶液后進(jìn)樣分析。以伏立康唑與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積比值為應(yīng)變量，濃度為自變量，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸分析。以信噪比S/N≥4 考察該藥物的檢測下限，信噪比S/N≥12考察該藥物的定量下限。

1.4.3方法精密度和準(zhǔn)確度 配制LLOQ（0.2 mg/L）、LQC（0.5 mg/L）、MQC（6.0 mg/L）和HQC（15.0 mg/L）4 個濃度的質(zhì)控生物樣品各5 份，每個濃度進(jìn)樣3 針，連續(xù)測定3 d，計算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度。

1.4.4提取回收率 配制LLOQ、LQC、MQC 和HQC 4 個濃度的伏立康唑質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)溶液和生物樣品各6份，進(jìn)樣分析，并計算提取回收率。

1.4.5穩(wěn)定性試驗 分別考察LQC 和HQC 的質(zhì)控生物樣品室溫穩(wěn)定性（室溫放置4 h）、短期穩(wěn)定性（-4 ℃，24 h）、長期穩(wěn)定性（-30 ℃，30 d）、凍融穩(wěn)定性（-24 ℃下反復(fù)凍融3次，每次至少間隔12 h）。穩(wěn)定性質(zhì)控樣品按上述條件分別放置一段時間后進(jìn)行色譜分析，比較其測定值與0 h 質(zhì)控樣品測定值的偏差。

1.5 病兒樣品測定及臨床資料收集收集204 例就診于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院血液科并規(guī)律服用伏立康唑的維吾爾族異基因HSCT 的病兒。所有病兒在測定當(dāng)日早晨空腹抽取靜脈血1~2 mL（3 500 r/min，-4 ℃離心5 min），分離血漿后精密吸取50 μL，加入內(nèi)標(biāo)10 μL，蛋白沉淀劑200 μL，混合離心（12 000 r/min，10 min）后過濾測定。收集并隨訪了所有入組病兒的一般資料（年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)、服藥劑量等）和穩(wěn)態(tài)血漿谷濃度。病人或其近親屬知情同意，本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)（批號XJS2021111809）。

2 結(jié)果

2.1 專屬性研究結(jié)果顯示：伏立康唑的離子對躍遷的離子對：350.2/127.1，同位素內(nèi)標(biāo)的離子對躍遷的離子對：353.2/130.1。圖1 顯示了伏立康唑和IS的離子對躍遷的代表性色譜圖。在伏立康唑的洗脫和無藥物空白人血漿中的IS 中未檢測到干擾峰。在LLOQ 樣品（圖1C）和給藥后產(chǎn)生的樣品（圖1D）中，伏立康唑和IS 保留時間均約1.84 min。此外，在定量樣品上限（20 mg/L）之后注入的空白血漿樣品的色譜圖中未檢測到殘留。

2.2 線性關(guān)系考察和定量下限測定伏立康唑血藥濃度在0.2~20 mg/L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（Y=1.107 2X-0.051 3，r2≥0.999 7），檢測下限為0.1 mg/L（S/N=4），定量下限為0.2 mg/L（S/N=12）。

2.3 方法精密度和準(zhǔn)確度伏立康唑測定的日內(nèi)和日間精密度使用四個水平的質(zhì)控樣品進(jìn)行評估，包括LLOQ、LQC、MQC 和HQC（見表1）。表1 結(jié)果表明：日內(nèi)和日間精密度的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）值不超過7.39%，準(zhǔn)確度的偏差（devia?tion from nominal value，Bias）范圍為- 1.11%~14.56%。

表1 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果（伏立康唑血藥濃度）

2.4 提取回收率伏立康唑的4 個質(zhì)控樣品（LLOQ、LQC、MQC 和HQC）的提取回收率分別為85.46%、90.78%、95.55%和94.11%，RSD 值均小于15.0%。IS的平均絕對值為86.41%。見表2。

表2 伏立康唑的提取回收率

2.5 穩(wěn)定性試驗穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，伏立康唑的2個質(zhì)控樣品（LQC和HQC）的未前處理和經(jīng)過前處理血漿樣品的短期、長期和凍融凍存穩(wěn)定性均較好（CV<5%；Bias 為-0.28%～12.29%；CV<10%；Bias為-3.56%～2.85%）。見表3。

表3 伏立康唑的穩(wěn)定性試驗結(jié)果

2.6 伏立康唑血漿藥物濃度測定結(jié)果分析病兒一般資料見表4。病兒平均年齡為10.13 歲；男性病兒比例為67.65%（n=138），伏立康唑平均給藥劑量為14.31 mg/d，血漿谷濃度為3.11 mg/L。

表4 規(guī)律服用伏立康唑的維吾爾族異基因造血干細(xì)胞移植（HSCT）病兒204例一般臨床資料

3 討論

本研究首次建立的測定伏立康唑血藥谷濃度的LC-MS/MS 方法基于臨床實踐病人樣本，提供了臨床環(huán)境的真實代表。

3.1 測定方法的優(yōu)缺點優(yōu)點：目前測定伏立康唑血藥濃度的高效液相色譜法［5-9］和LC-MS/MS 法［9-11］在樣品量、樣品制備方法、色譜柱等方面有所不同。有研究［12-15］使用了較為復(fù)雜的固相萃取、液-液萃取，或更昂貴的色譜設(shè)備。我們建立的LC-MS/MS方法使用了較為簡單的蛋白質(zhì)沉淀方法，可以將實驗操作過程減少到四個步驟，檢測人員可以快速輕松的完成相關(guān)操作，如15個伏立康唑血漿樣品可以在20 min 內(nèi)完成所有前處理過程。本研究建立的LC-MS/MS 法的分析速度快、靈敏度高，一次樣品的運(yùn)行時間在3 min 內(nèi)就可以完成，可及時為臨床個體化用藥提供依據(jù)。此外，該方法只需要50 μL 的血漿，這使得該方法可以更好的應(yīng)用于兒童病人。

缺點：由于該LC-MS/MS 法的靈敏度較高，故測定的各個環(huán)節(jié)對測定的干擾均較大，尤其是樣本前處理過程。其次，該儀器比較昂貴，不能廣泛應(yīng)用于新疆的邊遠(yuǎn)地區(qū)。

3.2 操作過程中的注意事項（1）本方法的流動相為0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，因此，采用有機(jī)相和水相相結(jié)合的混合膜。（2）流動相必須脫氣處理，否則會造成基線不穩(wěn)。（3）由于本研究測定的是生物樣本，樣本的前處理中的除蛋白過程對色譜系統(tǒng)的干擾較大，因此，樣本經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾后再進(jìn)樣測定。

3.3 研究意義目前，我院的伏立康唑樣品被送到其他實驗室進(jìn)行血藥濃度測定，其存在的主要問題是3～6 d 的周轉(zhuǎn)時間，使臨床調(diào)整其給藥劑量不及時。為了解決這個問題，我們開發(fā)并驗證了一種適用于兒科病人的快速、靈敏的LC-MS/MS 定量伏立康唑方法血漿谷濃度。此外，伏立康唑血漿谷濃度<1 mg/L 時治療效果較差［16-18］。伏立康唑谷濃度>5 mg/L 時易引發(fā)藥物的毒性反應(yīng)［19-20］。本研究結(jié)果顯示有9例病兒伏立康唑血漿谷濃度<0.5 mg/L導(dǎo)致療效較差，26 例伏立康唑谷濃度>6 mg/L 的病兒引發(fā)了谷丙和谷草轉(zhuǎn)氨酶升高。因此臨床及時進(jìn)行伏立康唑治療藥物監(jiān)測是非常有必要的。