李丹，徐沙麗，陳喬

缺血性腦卒中是常見的腦血管病，可影響腦部血液循環(huán)，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能。調(diào)查顯示［1］，我國腦卒中的發(fā)病率約為0.4%，其中有60%~70%的病人屬于缺血性腦卒中。另有資料指出［2］，缺血性腦卒中病人并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險高，其中急性期有2%~33%的病人并發(fā)癲癇，恢復(fù)期及后遺癥期有3%~67%的病人并發(fā)癲癇。微小核糖核酸-181a（miR-181a）屬于miR-181 家族的重要成員，可表達(dá)于腦組織，且其異常表達(dá)與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，包括腦卒中、癲癇等［3］。有研究［4］指出，在急性缺血性腦卒中病人中血清miR-181a 表達(dá)高于健康對照人群，且可預(yù)測神經(jīng)功能缺損程度；另有資料［5］顯示，miR-181a高表達(dá)可影響海馬神經(jīng)元突觸生長和大腦中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸含量，參與癲癇的發(fā)生。根據(jù)上述報道推測血清miR-181a表達(dá)可能與缺血性腦卒中繼發(fā)癲癇的風(fēng)險有關(guān)，但尚需要進(jìn)一步研究證實該推測?；诖?，本研究選取149例缺血性腦卒中病人和149例健康體檢者進(jìn)行試驗探討上述問題，旨在為此類病人繼發(fā)癲癇的防治研究提供新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料樣本量計算方法：根據(jù)樣本量計算公式n=Z2×［P×（1-P）］/E2，其中置信區(qū)間為95%，Z取值1.96；E為誤差值（根據(jù)預(yù)實驗為0.071），P為概率值（根據(jù)預(yù)試驗為0.26），計算n=146，并根據(jù)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)失訪率約為2%，最終可得n取值149。健康對照樣本量與缺血性腦卒中病人相等。

參照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院2019 年3 月至2021 年3 月收治的149 例缺血性腦卒中病人和149 例健康體檢者，分別記為疾病組和健康組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①疾病組均確診為缺血性腦卒中［6］，健康組均為健康體檢者；②接受隨訪；③簽署本研究知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有原發(fā)性癲癇或其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的癲癇者；②有其它類型疾病影響miR-181a 表達(dá)者，如缺血性心肌病等；③有精神障礙者；④合并惡性腫瘤、肝腎功能不全等疾病者；⑤無法配合完成本研究者。疾病組男91 例、女58 例，年齡范圍為32~78歲，年齡（66.17±11.23）歲，合并癥：高血壓56例、2型糖尿病40 例、高脂血癥49 例，入院美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（national institutes ofhealth stroke scale，NIHSS）7~18 分，NIHSS（11.30±2.15）分；健康組男88 例、女61 例，年齡范圍為30~80 歲，年齡（66.45±10.37）歲。兩組性別、年齡均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.44，P=0.512；t=0.30，P=0.613）。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法血清miR-181a表達(dá)檢測：疾病組均于治療前抽取外周血3 mL、健康組均采用體檢剩余外周血檢測血清miR-181a表達(dá)。3 000 r/min 離心5 min，離心半徑10 cm、溫度4 ℃。取上清液采用Trizol 試劑盒提取總核糖核酸，鑒定純度。將總核糖核酸反轉(zhuǎn)錄，配置聚合酶鏈反應(yīng)體系。引物序列：miR-181a正向5′ -ATCTGAGATGCGAT-3′，反向5′ -TGC?TAGAGCTTAGAGC-3′，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長度210 bp；U6（內(nèi)參）正向5′-ATGCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-CTAGGATCTAGAGCTAG-3′，預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物長度186 bp。聚合酶鏈反應(yīng)流程：95 ℃、45 s 預(yù)變性、94 ℃、30 s變性、55 ℃、30 s退火、72 ℃、60 s延伸，共35個循環(huán)，最后72 ℃、5 min延伸完整。將擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳，繪制溶解曲線，計算2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參），ΔΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參）-［Ct（基準(zhǔn)樣品）-Ct（內(nèi)參）］。

治療、隨訪及癲癇判定：疾病組均參照《中國腦卒中防治報告》［7］進(jìn)行治療，通過電話、微信及復(fù)查等方式隨訪1年，并參照《臨床診療指南癲癇病分冊》［8］判定是否發(fā)生癲癇，具體：①有發(fā)作病史，并排除心源性暈厥、低血糖、低血鈣引起的抽搐及癔病等；②有肢體抽搐、無目的行走、自言自語、幻聽、幻視、幻嗅、肢體麻木或疼痛感覺等癲癇發(fā)作形式；③腦電圖檢查發(fā)現(xiàn)異常波；④常規(guī)頭顱影像學(xué)檢查排除腦內(nèi)異常結(jié)構(gòu)或畸形。將缺血性腦卒中發(fā)病后2周內(nèi)繼發(fā)癲癇者記為早發(fā)性癲癇，否則記為遲發(fā)性癲癇。將疾病組中繼發(fā)癲癇者記為癲癇組，否則記為無癲癇組。

1.3 觀察指標(biāo)比較疾病組與健康組血清miR-181a 表達(dá)；統(tǒng)計癲癇發(fā)生情況，比較癲癇組與無癲癇組血清miR-181a 表達(dá)；分析疾病組發(fā)生癲癇的影響因素，將性別、年齡、合并癥、吸煙史（有吸煙史定義為一生中連續(xù)或累積至少吸煙6個月者）、飲酒史（有飲酒史定義為每個月平均至少飲酒1 次且連續(xù)半年）、入院NIHSS 評分、卒中類型、卒中部位、血清miR-181a 表達(dá)、出血性轉(zhuǎn)化記為自變量，是否發(fā)生癲癇記為因變量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法選用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗P>0.05 證實符合正態(tài)分布，采用±s描述，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；計數(shù)資料例（%）組間比較采用χ2檢驗，若有單元格理論頻數(shù)<5 需對其校正；等級資料采用秩和檢驗；采用logistic 多元回歸分析確定疾病組發(fā)生癲癇的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疾病組與健康組血清miR-181a 表達(dá)比較疾病組隨訪期間有2例并發(fā)急性心肌梗死救治無效死亡、有1例失訪，均剔除本研究。

疾病組血清miR-181a 表達(dá)范圍為1.12~1.96，miR-181a表達(dá)為1.65±0.38；健康組血清miR-181a表達(dá)范圍為1，miR-181a 表達(dá)為1。疾病組高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.88，P<0.001）。

2.2 癲癇發(fā)生情況及癲癇組與無癲癇組血清miR-181a表達(dá)比較疾病組146例病人中共有39例發(fā)生癲癇，發(fā)生率為26.71%，其中15 例早發(fā)型癲癇（38.46%）、24 例遲發(fā)型癲癇（61.54%），單次發(fā)作17例（43.59%）、反復(fù)發(fā)作22例（56.41%）；癲癇類型：癲癇大發(fā)作25例（64.10%）、小發(fā)作4例（10.26%）、局灶性發(fā)作8例（20.51%）、精神運(yùn)動性發(fā)作2例（5.13%）。

癲癇組血清miR-181a表達(dá)為1.84±0.40，范圍為1.34~1.96；無癲癇組血清miR-181a表達(dá)為1.58±0.35，范圍為1.12~1.75。癲癇組高于無癲癇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.82，P<0.001）。

2.3 癲癇組與無癲癇組病人的一般資料比較癲癇組與無癲癇組性別、年齡、合并癥、吸煙史、飲酒史、卒中類型、卒中部位比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；癲癇組入院NIHSS評分、出血性轉(zhuǎn)化占比均高于無癲癇組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 缺血性腦卒中病人146例一般資料比較

2.4 疾病組發(fā)生癲癇的影響因素分析將單因素分析結(jié)果中P<0.05的因素作為自變量并納入logistic多元回歸分析模型，包括入院NIHSS 評分（否=0，是=1）、血清miR-181a表達(dá)（否=0，是=1）、出血性轉(zhuǎn)化（否=0，是=1），是否發(fā)生癲癇（否=0，是=1）作為因變量。采用逐步向前法篩選危險因素。logistic多元回歸分析顯示，入院NIHSS 評分、血清miR-181a 表達(dá)、出血性轉(zhuǎn)化均是疾病組發(fā)生癲癇的危險因素（OR=6.46、8.26、5.33，P=0.028、0.001、0.010），見表2。

表2 缺血性腦卒中病人146例發(fā)生癲癇的影響多因素分析

3 討論

本研究中疾病組癲癇的發(fā)生率為26.71%，與既往Raja 等［9］報道的30%接近，提示缺血性腦卒中繼發(fā)癲癇的風(fēng)險高。但本研究中癲癇的發(fā)生率高于邸丹丹等［10］報道的20.83%和張雅靜等［11］報道的14.29%，可能與所選病例病情、分期、臨床治療方案及治療依從性、隨訪時間等差異有關(guān)。此外，本研究中早發(fā)型癲癇與遲發(fā)型癲癇占比分別為38.46%、61.54%，單次發(fā)作、反復(fù)發(fā)作者占比分別為43.59%、56.41%，包括癲癇大發(fā)作、小發(fā)作、局灶性發(fā)作及精神運(yùn)動性發(fā)作，可知缺血性腦卒中繼發(fā)癲癇病人的時間不固定、發(fā)作頻率不一、發(fā)作類型復(fù)雜多樣，而分析此類病人發(fā)生癲癇的相關(guān)因素有利于加強(qiáng)預(yù)防，降低癲癇發(fā)生率，作用重大。

本研究結(jié)果中疾病組血清miR-181a表達(dá)高于健康組，提示缺血性腦卒中病人血清miR-181a高表達(dá)，這與既往Song等［12］的研究相符，推測可能是因為缺血性腦卒中的發(fā)生導(dǎo)致大腦神經(jīng)元損傷，機(jī)體miR-181a代償性升高以保護(hù)大腦神經(jīng)元，減輕認(rèn)知功能損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)癲癇組血清miR-181a表達(dá)水平高于無癲癇組，且該指標(biāo)是疾病組發(fā)生癲癇的危險因素，可知血清miR-181a表達(dá)升高可增加缺血性腦卒中病人發(fā)生癲癇的風(fēng)險。有研究［13］指出，miR-181a可通過調(diào)控Toll樣受體4、p63、核轉(zhuǎn)錄因子-κB等表達(dá)影響腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)元特異性烯醇化酶等因子水平，進(jìn)而影響缺血性腦卒中病人的中樞神經(jīng)功能缺損程度，且miR-181a高表達(dá)意味著病人神經(jīng)功能損傷嚴(yán)重，很可能與加重炎癥反應(yīng)引起的腦組織損傷，還可影響神經(jīng)生長因子的表達(dá)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)損傷，進(jìn)而增加癲癇、出血性轉(zhuǎn)化等并發(fā)癥的發(fā)生率有關(guān)。本研究結(jié)果與上述報道一致，這也說明了miR-181a高表達(dá)很可能是缺血性腦卒中后癲癇的危險因素。另有劉偉等［14］報道顯示，miR-181a模擬物原代海馬神經(jīng)元突觸長度和突觸分支數(shù)分別為（465.2±111.2）μm和3.84±0.68，miR-181a抑制物分別為（1585.3±145.3）μm和15.12±1.46，提示miR-181a可影響海馬神經(jīng)元突觸生長，其高表達(dá)可減輕神經(jīng)元損傷、減少神經(jīng)元凋亡及細(xì)胞漏出，對癲癇起保護(hù)作用，本研究結(jié)果與該報道不符，可能是因為miR-181a可通過多途徑參與癲癇發(fā)生，對癲癇發(fā)生同時具有促進(jìn)與拮抗雙重效應(yīng)；本研究為臨床試驗而上述報道為體外細(xì)胞實驗，可能不同環(huán)境miR-181a參與癲癇發(fā)生的機(jī)制也不相同。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)入院NIHSS評分、出血性轉(zhuǎn)化均是疾病組發(fā)生癲癇的危險因素，與既往相關(guān)報道［15-16］結(jié)果一致。邸丹丹等［10］研究指出，NIHSS評分>15分是腦梗死病人繼發(fā)癲癇的獨(dú)立危險因素［OR=5.95，95%CI：（1.96，18.12），P=0.002］，本研究結(jié)果與該報道相符，可能是因為入院NIHSS 評分越高表明病人神經(jīng)功能受損越嚴(yán)重，大腦神經(jīng)元損傷也越嚴(yán)重，可引起大腦神經(jīng)元異常放電，使得軸突直接聯(lián)系的神經(jīng)元產(chǎn)生較大的興奮性突觸后電位，引發(fā)癇樣放電的連續(xù)傳播，因而癲癇的發(fā)生風(fēng)險可顯著增高；出血性轉(zhuǎn)化可造成神經(jīng)元二次損傷，且出血部位會出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生導(dǎo)致神經(jīng)元異常放電，神經(jīng)系統(tǒng)興奮-抑制反饋機(jī)制受損，再加上出血性轉(zhuǎn)化可引起內(nèi)源性神經(jīng)元爆發(fā)放電，增強(qiáng)神經(jīng)元電壓依賴性鈣電流使得其出現(xiàn)彌漫同步棘-慢波活動，引起癲癇發(fā)作［17］。因此在臨床實踐中應(yīng)針對上述因素實施干預(yù)以降低缺血性腦卒中后癲癇的概率。另有相關(guān)研究［18-19］指出，年齡、合并基礎(chǔ)疾病均是出血性卒中后癲癇的危險因素，本研究結(jié)果與上述報道不符，可能與病人診療依從性、飲食及生活習(xí)慣等差異有關(guān)，在臨床實踐中建議引起重視。

綜上所述，缺血性卒中血清miR-181a 表達(dá)升高，且發(fā)生癲癇的病人該指標(biāo)表達(dá)更高，血清miR-181a 表達(dá)可能增加缺血性腦卒中癲癇的發(fā)生風(fēng)險，且入院NIHSS 評分、出血性轉(zhuǎn)化均是其危險因素，應(yīng)積極控制上述因素以降低癲癇發(fā)生率。然而miR-181a 參與癲癇發(fā)生的具體機(jī)制尚未完全清楚，后續(xù)仍需進(jìn)一步探討該問題。