曹宸，楊瑩，孫秋悅，嚴(yán)志新，楊細(xì)虎

黑色素瘤（melanoma，MM）是常見(jiàn)的軟組織惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率不斷上升［1-2］。皮膚黑色素瘤惡性程度高，早期易發(fā)生擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。當(dāng)前治療手段仍然有限，臨床上常采用手術(shù)切除、放療、化療和一些姑息性治療等常規(guī)治療方式，但存在預(yù)后差等問(wèn)題。隨著皮膚黑色素瘤的免疫治療、靶向治療［3］等方法取得顯著進(jìn)展，病人的預(yù)后有了一定的改善，但腫瘤過(guò)早發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及生存率低等問(wèn)題依舊沒(méi)有得到有效的解決。此外，由于皮膚黑色素瘤的異質(zhì)性和分子水平上的個(gè)體差異，仍有部分病人存在抗腫瘤藥物無(wú)效、腫瘤細(xì)胞耐藥以及腫瘤靶向治療費(fèi)用偏高等問(wèn)題［4］，因此繼續(xù)探索其他有效的治療方案在臨床上具有重要意義。

近年來(lái)，多種研究表明淋巴管再生在腫瘤的增殖和進(jìn)展中起著非常重要的作用［5-6］。隨著淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物平足蛋白（podoplanin）、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1（lymphatic vessel endo?thelial hyaluronic acid receptor-1，LYVE-1）及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3（VEGFR-3）等蛋白的發(fā)現(xiàn)，淋巴管再生在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的重要作用日益明朗［7-10］。研究表明淋巴管轉(zhuǎn)移是皮膚黑色素瘤的主要轉(zhuǎn)移方式［11-12］，黑色素瘤癌巢及間質(zhì)中的淋巴管新生是腫瘤轉(zhuǎn)移的前提。因此，通過(guò)抑制瘤體內(nèi)及腫瘤周?chē)牧馨凸苄律?，減少瘤體內(nèi)和腫瘤周?chē)牧馨凸軘?shù)量，理論上可以推遲、延緩腫瘤經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移，從而延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間?，F(xiàn)有證據(jù)表明，黑色素瘤細(xì)胞與其所在微環(huán)境中的其他細(xì)胞及細(xì)胞間產(chǎn)物相互作用，導(dǎo)致了淋巴管的新生及腫瘤轉(zhuǎn)移［13］，其中涉及到復(fù)雜的細(xì)胞間信號(hào)傳遞。然而，黑色素瘤如何調(diào)控淋巴管新生及其如何通過(guò)淋巴管轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍不清楚［14-15］。

在腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中，誘導(dǎo)腫瘤旁間質(zhì)生成新的淋巴管是極為重要的一步。最新的文獻(xiàn)報(bào)道，一種被稱(chēng)作為外泌體的細(xì)胞外囊泡可通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)傳遞來(lái)影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。這些外泌體內(nèi)包含的信號(hào)因子可調(diào)節(jié)受體細(xì)胞的增殖、分化、免疫功能等生理活動(dòng)。這些外泌體被腫瘤細(xì)胞釋放在細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)細(xì)胞的胞吞、胞吐和受體介導(dǎo)及彌散等一系列的方式作用于靶細(xì)胞發(fā)揮其重要功能。

Prox-1 是淋巴管生成的關(guān)鍵性調(diào)控因子［16］。該信號(hào)不僅參與淋巴管的再生及塑形過(guò)程，也參與調(diào)控腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的過(guò)程［17］。已有文獻(xiàn)報(bào)道Prox-1及其下游信號(hào)叉頭框C2 蛋白（FoxC2）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）等參與消化道腫瘤、子宮內(nèi)膜癌及宮頸癌的淋巴轉(zhuǎn)移［18-20］，但在黑色素瘤淋巴轉(zhuǎn)移中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究提出黑色素瘤外泌體攜帶的Prox-1 在調(diào)控淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移以及生成具有轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞功能的病理性淋巴管過(guò)程中具有重要作用。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco，美國(guó)）；A375 人源黑色素瘤細(xì)胞系（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，中國(guó)）；LECs 淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，中國(guó)）；磷酸鹽緩沖液（Biofroxx，德國(guó)）；BCA 蛋白定量試劑盒、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 和HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）（碧云天生物有限公司，中國(guó)）；RQT100 羊抗鼠/兔IgG 聚合物（即用型）、GADPH 抗體、Prox-1 抗體、p-Akt 抗體、FoxC2 抗體（Abcam，美國(guó)）；外泌體試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司，中國(guó)）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Sanyo，日本）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)）；化學(xué)發(fā)光成像儀（Tan?non，中國(guó)）。

1.2 一般資料樣本選自2015 年9 月至2021 年4月在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的32 例原發(fā)性黑色素瘤病人。篩選條件：①病人行黑色素瘤切除手術(shù)；②腫瘤原發(fā)灶蠟塊保存完整；③病歷資料及臨床病理材料完整。共選取32 例病人，其中：男性18 例，女性14 例。年齡范圍40～90 歲。32 例病人病理學(xué)顯示：癌癥早期病人（Ⅰ期和Ⅱ期）8 例，癌癥晚期病人（Ⅲ期和Ⅳ期）24 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16 例，未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者16 例。選取2 例正常皮膚組織的臨床病理資料作為對(duì)照。本研究獲得江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)KY2022K120 5），病人及近親屬對(duì)研究方案了解并簽署知情同意書(shū)。

1.3 免疫組化試劑兔抗人Prox-1 單抗（即用型）、兔抗人LYVE-1 單抗（即用型）、RQT100 羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型）、DAB顯色液。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LECs），于內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基（EGM-2；Cambrex）中培養(yǎng)。A375 黑色素瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所，于DMEM中培養(yǎng)。所有細(xì)胞均保持在37 ℃，5%二氧化碳條件下。DMEM 中添加10%FBS。所有的給藥實(shí)驗(yàn)均為細(xì)胞穩(wěn)定傳代3代以上。

1.4.2 Prox-1 的慢病毒敲除根據(jù)吉?jiǎng)P基因慢病毒使用說(shuō)明手冊(cè)，設(shè)置梯度MOI 進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本次感染采用MOI 為50。接種105個(gè)細(xì)胞于6 孔板中，分別加入以下病毒：shProx-1、GFP 50×105TUI 病毒。按上述方法感染細(xì)胞，24 h 后更換為完全培養(yǎng)基。于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細(xì)胞密度至80%~90%時(shí)，提取蛋白或傳代至培養(yǎng)瓶中。采用免疫熒光法檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率。制備Prox-1修飾的MM-ex和MM-exshProx-1，將轉(zhuǎn)染慢病毒的MM 在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，分離出MM-ex/MM-exshProx-1用于進(jìn)一步研究。

1.4.3 外泌體鑒定

1.4.3.1透射電子顯微鏡法 通過(guò)透射電子顯微鏡（FEI Tecnai 12，飛利浦，荷蘭）分析MM-ex 的形態(tài)和大小。將10 μL 的黑色素瘤在涂有甲醛/碳的銅網(wǎng)格上，吸附10 min，用10 μL 的1%磷酸在25 ℃下染色5 min，并用透射電子顯微鏡檢查。透射電鏡得到了揚(yáng)州大學(xué)檢測(cè)中心的技術(shù)支持。

1.4.3.2原子力顯微鏡成像 對(duì)MM-ex進(jìn)行原子力顯微鏡（AFM）成像。將0.25 g MSC-ex 溶解于10μL PBS 中，沉積在云母片上。在室溫干燥后，采用多模式第八代SPM（德國(guó)布魯克）掃描樣品，并使用納米顯微鏡進(jìn)行分析。

1.4.3.3納米光追蹤分析 通過(guò)納米光追蹤分析（NTA）測(cè)量MM-ex的數(shù)量和大小分布。將MM-ex在PBS中稀釋?zhuān)⒆⑸涞絃M10裝置的樣品室中。每個(gè)樣本記錄30 s或60 s，使用納米NTA 3.1軟件對(duì)視頻進(jìn)行分析。根據(jù)總量和稀釋因子計(jì)算相對(duì)濃度。

1.4.4 細(xì)胞遷移、增殖

1.4.4.1細(xì)胞增殖 采用CCK-8 試驗(yàn)評(píng)估淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖。96 孔板中以每孔103個(gè)細(xì)胞的密度接種細(xì)胞，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。吸棄培養(yǎng)基后，采取PBS（n=5）、MM-ex（50 或100 μg/孔，n=5）處理LECs 48 h。采用PBS 制備陰性對(duì)照。類(lèi)似地，將MM-exshProx-1（每孔50 μg，n=5）處理36 h。加入WST-8，測(cè)定細(xì)胞增殖（450 nm）。

1.4.4.2細(xì)胞遷移 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)觀察MM-ex轉(zhuǎn)運(yùn)的Prox-1 對(duì)LECs 遷移的影響。實(shí)驗(yàn)分三組：PBS 組、MM-ex 組、MM-exshProx-1組（外泌體溶解在PBS中）。選取外泌體的使用劑量為50 mg/L。細(xì)胞接種培養(yǎng)方法同細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。六孔或十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板配套的8 μm 孔徑細(xì)胞培養(yǎng)池纖維連接蛋白鋪底（40 mg/L）干燥，置入六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種細(xì)胞，并按分組加入不同的等容積的刺激因子，置于37 ℃，5%二氧化碳條件下培養(yǎng)16 h 后取出細(xì)胞培養(yǎng)池行Giemsa 染色：PBS 浸洗細(xì)胞培養(yǎng)池1 min×3次，甲醇固定20 min，自然干燥，用Giemsa 染液染色10 min，蒸餾水浸洗。在倒置相差顯微鏡下每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)池隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)膜上、下的細(xì)胞，以及遷移到膜下的細(xì)胞數(shù)除以膜上下細(xì)胞總數(shù)計(jì)算細(xì)胞的遷移率。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)黑色素相關(guān)蛋白表達(dá)選取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行處理。裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，總蛋白質(zhì)（40 μg）在SDS-PAGE 凝膠上分離，使用電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。將膜在常溫下用含有5%脫脂奶粉的TBST 封閉1.5 h。4 ℃下與抗體一起孵育過(guò)夜。二抗在常溫下孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)，檢查特征蛋白表達(dá)及其下游信號(hào)通路激活情況。

1.6 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)分三組：PBS 組、MM-ex組、MM-exshProx-1組（外泌體溶解在PBS 中）。每組各24 個(gè)培養(yǎng)孔。外泌體使用劑量為50 mg/L。細(xì)胞傳代時(shí)，換用1%BSA 的EGM-2-MV 培養(yǎng)基及上述分組不同的等容積的刺激因子，LECs 培養(yǎng)2～3 代后細(xì)胞爬片，用PBS沖洗后，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS 漂洗3 次，分別滴加兔抗小鼠一抗Prox-1、CD9、VEGFR-3、抗體滴度為1∶500。置濕盒內(nèi)4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。PBS漂洗3次，滴加羊抗兔FITC 或PE 熒光二抗，置濕盒內(nèi)37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗3 次，蒸餾水漂洗2 次，熒光顯微鏡下檢測(cè)染色結(jié)果，用Hoechst進(jìn)行細(xì)胞核襯染照相。

吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS 洗滌兩次，4%PFA 室溫固定。PBS洗滌一次，0.1%Triton通透工作液室溫通透10 min。吸棄Triton 通透工作液，5%BSA 室溫封閉60 min。加一抗，2～8 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌后，DAPI封片染核，室溫避光孵育5 min，使用熒光共聚顯微鏡觀察

1.7 免疫組化染色所取全部標(biāo)本中Prox-1、LYVE-1的水平選用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟如下：選用4%中性甲醛溶液（NBF）固定（25 ℃，24 h），以乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），0.1 mol，（pH 8.0）為抗原修復(fù)液對(duì)抗原組織進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)時(shí)間為噴氣計(jì)時(shí)2 min 30 s，使用3%雙氧水滅活。Prox-1、LYVE-1一抗均采用PBS依據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)? ℃條件下孵育過(guò)夜。二抗選擇RQT100羊抗鼠/兔IgG聚合物（即用型），于25 ℃條件下孵育20 min，選用DAB顯色液，顯色5 min。蘇木精復(fù)染30 s，脫水，中性樹(shù)脂封片。用共聚焦激光掃描顯微鏡檢測(cè)載玻片。

1.8 免疫組化結(jié)果判定使用MLVD 計(jì)數(shù)法表示LYVE-1，計(jì)數(shù)方式為［21］：在顯微鏡下對(duì)淋巴管進(jìn)行觀察，單個(gè)淋巴管為單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞簇，呈棕黃色。在低倍鏡（40 倍鏡）視野下選擇淋巴管高密度區(qū)，然后在高倍鏡（200倍鏡）視野下隨機(jī)選擇5個(gè)視野內(nèi)淋巴管進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算平均值。Prox-1主要為胞核染色。使用低倍鏡（40倍鏡）觀察全片，確定腫瘤浸潤(rùn)的組織邊緣，然后選擇5個(gè)高倍鏡（400 倍鏡）視野下的細(xì)胞對(duì)其染色強(qiáng)度及所占百分比進(jìn)行綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度判分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未著色為0 分（-）、淺黃色為1 分（+）、棕黃色為2 分（++）、棕褐色為3 分（+++）。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比判分標(biāo)準(zhǔn)［22］：陽(yáng)性細(xì)胞<1%為0 分；1%～10%為1分、10%～30%為2 分；30%～60%為3 分；>60%為4分。以細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分之和作為染色結(jié)果的判定，陰性或低表達(dá)：0～3 分；高表達(dá)：≥4 分。0～3 分為低表達(dá)組，≥4 分為高表達(dá)組。見(jiàn)圖1。

圖1 Prospero同源異形盒蛋白1（Prox-1）、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞透明質(zhì)酸受體-1（LYVE-1）在黑色瘤切除標(biāo)本的皮膚組織中的表達(dá)：1A為正常皮膚組織組織中Prox-1陰性表達(dá)（IHC染色×100）；1B為L(zhǎng)YVE-1在黑色素瘤淋巴管中陽(yáng)性表達(dá)，用微淋巴管密度表示（IHC染色×400）;1C為Prox-1陰性染色（?）（IHC染色×400）；1D為Prox-1弱陽(yáng)性染色（+）（IHC染色×400）；1E為Prox-1中陽(yáng)性染色（++）（IHC染色×400）；1F為Prox-1強(qiáng)陽(yáng)性染色（+++）（IHC染色×400） 圖2 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染黑色素瘤細(xì)胞圖（免疫熒光顯色法×4） 圖5 黑色素瘤外泌體粒徑表征 圖6 黑色素瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞淋巴管生成有劑量依賴(lài)性影響：6A為免疫熒光法觀察外泌體與LECs細(xì)胞共培養(yǎng)36 h的影響（免疫熒光染色法×100）；6B為驗(yàn)證MM-ex/MM-exshProx-1對(duì)LECs遷移的影響（Transwell法×10）；6C為L(zhǎng)ECs在MM-ex/MM-exshProx-1的作用下，淋巴管標(biāo)志物VEGFR-3的熒光表達(dá)（免疫熒光染色法×20） 圖9 人來(lái)源的CD9陽(yáng)性MM-ex/MM-exshProx-1定位于LECs的細(xì)胞質(zhì)中（免疫熒光染色法×20）

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究的數(shù)據(jù)采用SPSS 進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05 表明數(shù)據(jù)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用費(fèi)希爾精確檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)Prox-1 的表達(dá)高低與病人臨床病理特征的關(guān)系。應(yīng)用MLVD 表示LYVE-1的表達(dá)水平，探究MLVD 值與病人臨床病理特征的關(guān)系，兩組樣本間比較符合正態(tài)分布且方差齊者采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，若不符則采用秩和檢驗(yàn)。三組樣本間比較先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊且符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，反之則采用Krus?kal-WallisH檢驗(yàn)。Prox-1 和LYVE-1 的表達(dá)的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 黑色素瘤外泌體敲減Prox-1 基因如圖1 所示，我們用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染黑色素瘤細(xì)胞（圖2）敲減Prox-1 基因，得到不含有Prox-1 基因的黑色素瘤外泌體（圖3）。采用試劑盒法提取兩種外泌體：MM-ex、MM-exshProx-1。

圖3 黑色素瘤外泌體慢病毒敲減后提取出不含Prox-1信號(hào)的外泌體

2.2 黑色素瘤外泌體表征對(duì)黑色素瘤外泌體進(jìn)行表征如圖4 所示，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果證實(shí)了外泌體標(biāo)記CD9、CD63和腫瘤易感基因101（TSG 101）在MM-ex 中的表達(dá)。與黑色素瘤相比，上述蛋白在黑色素瘤外泌體中的表達(dá)明顯增高（圖4A）。透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）顯示MM-ex的球體形狀（圖4B）。采用納米粒子跟蹤分析（NTA），表明所得MM-ex 的平均粒徑約為130 nm（圖5）。

圖4 黑色素瘤外泌體表征：A為外泌體標(biāo)記CD9、CD63和TSG101在MM、MM-ex中的表達(dá)；B為外泌體電鏡表征

2.3 黑色素瘤外泌體對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞淋巴管生成的影響為了探究MM-ex 是否對(duì)淋巴管生成產(chǎn)生直接影響，將LECs 與所得外泌體共同孵育36 h。共聚焦成像結(jié)果顯示，標(biāo)記的MM-ex 在孵育12 h 后主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核周?chē)?，且?shù)量隨著時(shí)間的推移而增加（圖6）。為探討MM-ex 對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞淋巴管生成的影響，將LECs 與不同劑量的MMex、MM-exshProx-1共同孵育24 h。結(jié)果表明，MM-ex 以劑量依賴(lài)性方式促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖（圖7）、遷移（圖6）。MM-exshProx-1對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移無(wú)明顯影響。LECs在MM-ex的作用下，標(biāo)志物VEGFR-3 表達(dá)明顯升高，提示LECs 增生活躍（圖6），MM-exshProx-1作用的LECs 卻沒(méi)有。這些結(jié)果表明，含Prox-1 的MM-ex 可以劑量依賴(lài)性促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞生成淋巴管。

圖7 CCK8法驗(yàn)證MM-ex/MM-exshProx-1對(duì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞淋巴管增殖影響：A為加入50 μg和100 μg的MM-exshprox-1與加入pbs組 對(duì)lec增殖情況的影響；B為加入50 μg的MM-ex與pbs組對(duì)lec增殖情況的影響；C為加入100 μg的MM-ex與pbs組對(duì)lec增殖情況的影響

2.4 黑色素瘤外泌體參與調(diào)控淋巴管生成的機(jī)制為從機(jī)制上探討MM-ex 促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，在MM-ex 和MM-exshProx-1作用于LECs的第12、24、36 h 評(píng)估淋巴管生成基因的表達(dá)（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MM-ex 預(yù)處理LECs 后，F(xiàn)oxC2、Prox-1、p-Akt 的表達(dá)隨著時(shí)間的推移而顯著增加至12 h 后逐漸衰減。經(jīng)MM-exshProx-1預(yù)處理LEC 后，F(xiàn)oxC2、Prox-1、p-Akt 隨著時(shí)間的表達(dá)變化量不明顯。免疫熒光染色證實(shí)人來(lái)源的CD9 陽(yáng)性MM-ex、MM-exshProx-1可以定位于LECs 的細(xì)胞質(zhì)中（圖9）。

圖8 作用于LECs的第12、24、36 h評(píng)估淋巴管生成基因的表達(dá)：A為黑色素瘤外泌體（MM-ex）；B為低表達(dá)Prox-1的黑色素瘤外泌體（MM-exshProx-1）

2.5 Prox-1 表達(dá)、MLVD 值與黑色素瘤臨床病理特征的關(guān)系2 例正常皮膚組織組織中Prox-1 表達(dá)為陰性。Prox-1 在黑色素瘤中主要染色部位在胞核。32 例黑色素瘤病理中，Prox-1 高表達(dá)率為62.5%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高表達(dá)率為87.50%，表達(dá)率顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組37.50%（P<0.05）；癌癥晚期組Prox-1 高表達(dá)率為79.17%，顯著高于癌癥早期組12.50%（P<0.05）；長(zhǎng)徑小于5 cm 的腫瘤Prox-1 高表達(dá)率為38.46%，而長(zhǎng)徑大于5 cm 的Prox-1 高表達(dá)率為78.94%（P<0.05）。性別和年齡因素對(duì)黑色素瘤組織中Prox-1 表達(dá)水平影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

黑色素瘤標(biāo)本中的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)免疫組化LYVE-1 抗體染色后呈現(xiàn)為棕黃色，32 例黑色素瘤MLVD 均值為7.48±3.91。性別、年齡和腫瘤長(zhǎng)徑對(duì)黑色素瘤組織中MLVD 值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），黑色素瘤有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和癌癥晚期組的MLVD 值分別高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、癌癥早期組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。具體情況見(jiàn)表1。

表1 黑色素瘤組織32例中Prospero同源異形盒蛋白1（Prox-1）表達(dá)、微淋巴管密度（MLVD）值與其臨床病理特征的關(guān)系

2.6 Prox-1 表達(dá)水平與MLVD 的相關(guān)性32 例黑色素瘤組織中，Prox-1高表達(dá)組MLVD 為8.88±4.20，低表達(dá)組MLVD 為5.15±1.72（r=0.47，P=0.007）。Pearson 相關(guān)分析顯示，Prox-1 表達(dá)情況與MLVD 值呈相關(guān)性，即Prox-1 高表達(dá)組的MLVD 值高于Prox-1低表達(dá)組的MLVD值。

3 討論

黑色素瘤是臨床常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，預(yù)后差，且治療方式有限。特別是在癌癥晚期且有腫瘤淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人5 年生存率仍然低至5%~10%［23-25］。因此，腫瘤的早發(fā)現(xiàn)和早治療是提升病人生存率的關(guān)鍵?，F(xiàn)階段，監(jiān)測(cè)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移仍具有一定的挑戰(zhàn)性。本研究旨在腫瘤淋巴管的形成中探索和發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移途徑。當(dāng)前，各類(lèi)皮膚腫瘤的外泌體已成為學(xué)者們研究的方向，為確定外泌體對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制的影響及預(yù)后指標(biāo)提供新的方向。本研究主要探究MM-ex 在腫瘤瘤體及周?chē)g質(zhì)的刺激對(duì)生成新生淋巴管的影響，結(jié)果表明MM-ex 促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)VEGFR-3、LYVE-1 陽(yáng)性淋巴管的生成。

黑色素瘤的進(jìn)展與淋巴管的誘導(dǎo)成形密切相關(guān)。大量文獻(xiàn)報(bào)道及研究?jī)H關(guān)于黑色素瘤血管生成及轉(zhuǎn)移的機(jī)制，關(guān)于淋巴管轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確?，F(xiàn)階段已有研究表明Prox-1、FoxC2［26］、LYVE-1、VEGFR-3［27-29］等淋巴管生成的標(biāo)志物已在黑色素瘤病人中被確立。迄今為止分析的所有標(biāo)志物并未將淋巴管生成與黑色素瘤的轉(zhuǎn)移相聯(lián)系作為一個(gè)新的預(yù)后判斷指標(biāo)。也有文獻(xiàn)報(bào)道Prox-1 調(diào)控LECs 的增殖及遷移和淋巴管的成熟，Prox-1 及其下游因子FoxC2 促進(jìn)淋巴管瓣膜及淋巴管壁的形成［30］。Prox-1 已在宮頸癌、胃癌中被證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。Prox-1在腫瘤細(xì)胞中作為淋巴管生成的起始因子，可使其成為監(jiān)測(cè)和治療的一個(gè)強(qiáng)有力的靶點(diǎn)。且MM-ex 由腫瘤細(xì)胞自分泌產(chǎn)生，表明此種細(xì)胞間遞質(zhì)可在胞質(zhì)中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

本研究分析了黑色素瘤細(xì)胞分泌的MM-ex 對(duì)腫瘤淋巴管生成的影響。為了驗(yàn)證這一假說(shuō)，我們進(jìn)行了Prox-1介導(dǎo)功能的缺失實(shí)驗(yàn)。這些實(shí)驗(yàn)證明Prox-1敲減后的外泌體顯著降低了腫瘤周?chē)馨凸艿纳?，減少了LECs 的增殖和遷移，從而有效的減緩了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的MM-ex 中Prox-1可激活A(yù)kt信號(hào)途徑，促進(jìn)腫瘤間質(zhì)中淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生淋巴管，同時(shí)促進(jìn)淋巴管生成因子受體VEGFR-3 的表達(dá)上調(diào)。因此腫瘤影響了正常組織淋巴管生成受體信號(hào)的表達(dá)和識(shí)別。由此支持了一種新興學(xué)說(shuō)：腫瘤細(xì)胞利用內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴管生成信號(hào)系統(tǒng)（即遷移、侵襲和增殖調(diào)節(jié)信號(hào)系統(tǒng)）來(lái)支持與腫瘤細(xì)胞自身進(jìn)展相關(guān)的侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制［31］。

本研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤病人癌巢及癌周組織中，Prox-1、LYVE-1 表達(dá)水平明顯高于正常皮膚組織。同時(shí)，Prox-1、LYVE-1 表達(dá)水平與病人的腫瘤負(fù)荷程度、疾病的分期和病人的生存率相關(guān)。與正常皮膚相比，黑色素瘤病人標(biāo)本中心灶Prox-1 有顯著差異，Ⅲ期和Ⅳ期黑色素瘤病人癌巢中心及周?chē)g質(zhì)，Prox-1、LYVE-1 的表達(dá)明顯高于Ⅰ期和Ⅱ期黑色素瘤病人。這使得病理切片及免疫組化可更高效地監(jiān)測(cè)腫瘤的進(jìn)展。

基于以上結(jié)果，可推測(cè)Prox-1 不僅是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志，在功能上也參與了黑色素瘤的轉(zhuǎn)移，由此進(jìn)一步推測(cè)腫瘤分泌含有Prox-1 的外泌體在此間發(fā)揮了重要作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證假說(shuō)，我們對(duì)腫瘤樣本及人源的黑色素瘤A375 細(xì)胞系中分泌的含有Prox-1的外泌體進(jìn)行了詳細(xì)研究。實(shí)驗(yàn)證實(shí)了外泌體被腫瘤細(xì)胞釋放后被間質(zhì)中相關(guān)的內(nèi)皮細(xì)胞所吸收，在信號(hào)傳遞中發(fā)揮了重要作用。因此相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)間高表達(dá)的Prox-1對(duì)監(jiān)測(cè)Ⅲ期及Ⅳ期腫瘤有顯著貢獻(xiàn)。

因此，本研究認(rèn)為Prox-1 是黑色素瘤進(jìn)展的一個(gè)新的標(biāo)志物，也可通過(guò)病理切片的染色判斷病人的預(yù)后。這項(xiàng)關(guān)于黑色素瘤外泌體Prox-1的研究具有廣闊前景，值得在更多的Ⅰ~Ⅳ期黑色素瘤病人中作出進(jìn)一步的分析。此外，外泌體作為一種新興的細(xì)胞間傳遞因子并結(jié)合黑色素瘤自分泌外泌體的特性，使通過(guò)針對(duì)外泌體來(lái)治療人類(lèi)黑色素瘤成為了一個(gè)新的趨勢(shì)。目前，人們正努力生成Prox-1及外泌體的新抑制劑以治療和干擾腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移。本研究數(shù)據(jù)有力地提供和證明黑色素瘤分泌的含有Prox-1 的外泌體促進(jìn)了腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的新途徑。并且提供了一個(gè)新的轉(zhuǎn)移監(jiān)測(cè)靶點(diǎn)，貢獻(xiàn)一個(gè)治療黑色素瘤的新策略。