夏麗秀，尹霞，肖瑞

腦組織供血不足時，快速再灌注是治療腦缺血的一項有效方法，但該治療方法也被證實會進一步引起腦缺血/再灌注（I/R）損傷，導致急性壞死、細胞凋亡［1-3］。目前臨床上并無預防神經(jīng)功能受損的有效治療手段，因此了解其潛在的機制并積極尋找新的治療方法十分重要。

金絲桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種從天然紅柳木中提取的黃酮類化合物，廣泛存在于薔薇科植物中［4］。其已被證明具有抗氧化、抗炎、抗癌等保護作用［5］。此外，金絲桃苷也被證實能夠保護大腦皮層神經(jīng)元免受缺氧、缺糖導致的再灌注損傷［6-7］。

許多miRNAs 被證實參與了缺血性腦損傷的多個環(huán)節(jié)，并逐漸成為缺血性腦損傷治療的新靶標［8］。有研究顯示抑制肌醇依賴性激酶1α 能夠通過miR-125/ NLR 家族Pyrin 域蛋白1（NLRP1）/胱天蛋白酶1（caspase-1）信號通路減輕缺氧缺血后神經(jīng)元焦亡，減少梗死體積，改善神經(jīng)行為結(jié)果，提高miR-125的表達可能是避免缺氧缺血腦損傷的重要靶點［9］。信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）編碼的蛋白質(zhì)是STAT家族的重要成員，有研究發(fā)現(xiàn)STAT3過表達能夠加重大腦中動脈閉塞（MCAO）所致的I/R 損傷，進一步促進大鼠的神經(jīng)功能障礙［10］。另外也有研究證實miR-124能夠通過抑制STAT3信號通路，進而減少I/R 神經(jīng)細胞焦亡、發(fā)揮神經(jīng)保護作用［11］。Tian 等［12］在關于皮膚鱗癌的研究中證實了miR-125b能夠通過靶向STAT3進而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，miR-125也被證實能夠靶向STAT3進而在高糖誘導的糖尿病視網(wǎng)膜病變中發(fā)揮保護作用［13］。盡管miR-125/STAT3作用軸已被證實在多種其他疾病中發(fā)揮作用，但是該作用軸是否影響I/R的進展仍有待進一步探討。

本研究于2021 年6 月至2022 年1 月開展，旨在探究金絲桃苷/miR-125a-5p/STAT3 在I/R 損傷中的作用和機制，為分子靶向技術治療I/R 損傷提供一定的理論基礎和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑30 只SPF 級SD 大鼠（6~7 周齡）購自廣東省實驗動物中心［實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2018-0002］；大鼠PC12 細胞購自北京協(xié)和醫(yī)學院；Hyperin 購自美國Sigma；乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司；雙螢光素酶分析報告系統(tǒng)購自翌圣生物；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒、白細胞介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒、放射免疫沉淀測定（RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（Bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑購自美國Invitrogen 公司；引物由廣州銳博生物科技公司設計并合成；PowerUp? SYBR?Green Master Mix 購自美國ThermoFisher 公司。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 生物信息學分析基因綜合表達數(shù)據(jù)庫（GEO）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中搜尋I/R損傷相關的基因表達譜（GSE82146）。該數(shù)據(jù)集分析了Long Evans雄性大鼠在缺血處理10 min以及再灌注8 h 后錐體神經(jīng)元中差異表達的mRNAs。lim?ma包對得到的基因表達譜文件進行差異基因篩選，校正后P值稱為adj.P.Val，其中符合|log2FC|>1 和adj.P.Val<0.05 的條件的基因被確定為顯著差異表達基因，pheatmap 包用于繪制差異基因表達熱圖。通過在線生物信息學工具DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）對差異表達基因進行KEGG 功能富集分析。在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.dis?genet.org/）獲取I/R 的疾病風險基因。String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）用于分析蛋白互作用關系（PPI）。DIANA（http：//carolina.imis.athena-innova?tion.gr/diana_tools/web/index.php）、starBase 預測網(wǎng)站（http：//starbase. sysu. edu. cn/browseNcRNA. php）、miRDB 預測網(wǎng)站（http：//mirdb.org/index.html）、Tar?getScan 預測網(wǎng)站（http：//www.targetscan.org/vert_72/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）檢索STAT3 的上游靶miRNAs，使用DIANA 在線基因本源（GO）注釋分析對進行miRNAs 進行篩選，并借助Venn 在線網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）繪制交集miRNAs。

1.3 大鼠腦中動脈閉塞法建立I/R動物模型模型建立的方法依據(jù)參考文獻［11］：取30只SPF級SD大鼠（6~7 周齡），體質(zhì)量范圍在200~250 g。造模前所有大鼠進行7 d習服，飼養(yǎng)環(huán)境保持22~24 ℃，相對濕度范圍45%~65%，12 h 光/暗循環(huán)以模擬真實晝夜變化，在習服過程中大鼠可以自由飲食和采水。將30只大鼠隨機分為四組：假手術組（n=6）、模型組（n=6）、金絲桃苷低劑量組（n=6）、金絲桃苷高劑量組（n=6）。進行灌胃給藥，金絲桃苷低劑量組組予20 mg/kg 金絲桃苷，金絲桃苷高劑量組組予50 mg/kg 金絲桃苷，模型組予同等劑量的生理鹽水，假手術組不作任何處理。于早晚灌藥各一次，持續(xù)給藥5 d。隨后在第6 天于SPF 環(huán)境下構(gòu)建鼠腦中動脈阻塞模型。在構(gòu)建模型的當天將各組大鼠進行8 h禁食處理，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，于頸部正中開一約2 cm的切口，分離右側(cè)頸總動脈，頸內(nèi)動脈和頸外動脈采用Nagasawa 法進行缺血2 h 后再灌注24 h 誘導。假手術組同樣進行中動脈分離，但不進行結(jié)扎阻塞和刺破動脈管壁處理?？p合傷口后各組大鼠均進行縫合并單籠飼養(yǎng)。本研究各項流程符合國家衛(wèi)生研究所的實驗室動物護理和使用指南。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺損評價待大鼠完全清醒后按照Masao Shmiizu-Sasamata 的方法進行神經(jīng)行為評分。嚴重程度評分從0~14 分，其中0 分代表正常，得分越高表示損傷越嚴重。評分準則見表1。

表1 大鼠神經(jīng)行為評分/分

1.5 大鼠腦組織含水量測定各組實驗大鼠于再灌注后24 h 在深麻醉狀態(tài)下斷頭取腦。取右側(cè)大腦半球用濾紙吸干表面血液，經(jīng)電子天平精確稱質(zhì)量后，放入120 ℃恒溫干燥箱烘烤48 h至恒質(zhì)量后，再精確稱質(zhì)量，并按Elliot干濕質(zhì)量法計算腦組織含水量，以百分率表示。腦組織含水量=［（濕重-干重）/濕重］×100%。

1.6 大鼠腦組織獲取與腦梗死體積評價組織采集前，將大鼠深度麻醉后斷頭取腦組織。剝除腦膜及血管后于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?0 min 取出后連續(xù)切4~5 張3 mm 左右厚切片。將切片加入2%的TTC的染色液，并在避光條件下浸染30 min，隨后用4%多聚甲醛灌流，固定后取出將腦片按順序整齊排列，濾紙吸干表面水分。Image-J軟件測定全腦片和梗死組織的面積，乘以腦片厚度即得全腦和梗死組織的體積。紅色區(qū)域為正常腦組織，蒼白色為腦梗死區(qū)域，梗死體積百分比=梗死組織的梗死體積/全腦體積的百分比。

1.7 氧-葡萄糖剝奪/復氧（OGD/R）誘導PC12 細胞建立體外I/R 細胞模型并轉(zhuǎn)染大鼠PC12 細胞在含10%胎牛血清、5%胚胎干細胞、100 U/mL 青鏈霉素合劑的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境設置為37 ℃、5%二氧化碳。將細胞進行相應的轉(zhuǎn)染操作。將20 mg 金絲桃苷與80 μL 二甲基亞砜混勻，并以20 μL 分裝，使用時用培養(yǎng)基稀釋至10 mL，并配置成含有50 μmol 金絲桃苷的培養(yǎng)基。利用Lipo?fectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-125a-5p 抑制劑（miR-125a-5p inhibitor）、miR-125a-5p 抑制劑陰性對照（inhibitor-NC）、過表達STAT3（pc-STAT3）和陰性對照（pcDNA 3.1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至對應的PC12 細胞，轉(zhuǎn)染步驟依據(jù)試劑盒說明書進行。轉(zhuǎn)染6 h后更換RP?MI1640 完全培養(yǎng)基。在37 ℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼續(xù)進行孵育，轉(zhuǎn)染48 h 后將生長狀態(tài)良好的PC12細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞貼壁后各組加入50 μmol 的金絲桃苷完全培養(yǎng)基預處理。含金絲桃苷的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，之后換上完全培養(yǎng)基將各組細胞轉(zhuǎn)移至缺氧的環(huán)境中，設置1%氧氣、94%氮氣和5%二氧化碳，12 h 后轉(zhuǎn)移至常氧條件即5%二氧化碳、95%空氣中培養(yǎng)5 h，用神經(jīng)元培養(yǎng)液替換無糖DMEM 培養(yǎng)基恢復24 h。并設未經(jīng)OGD/R處理的神經(jīng)細胞為對照組。

1.8 雙螢光素酶報告實驗利用在線生物靶點預測網(wǎng)站的預測結(jié)果合成包含miR-125a-5p 結(jié)合位點的STAT3 3’UTR 序列，構(gòu)建STAT3 3’UTR 野生型（WT）質(zhì)粒（STAT3-WT），并在此基礎上利用突變結(jié)合位點構(gòu)建STAT3 3’UTR 突變型（MUT）質(zhì)粒（STAT3-MUT）。將上述質(zhì)粒與miR-125a-5p mimic或mimic-NC 兩兩共轉(zhuǎn)染至PC12 細胞。轉(zhuǎn)染48 h后，裂解細胞，以12 000 r/min的速度離心1 min后收集上清液。使用雙螢光素酶報告分析系統(tǒng)檢測螢光素酶活性。相對螢光素酶活性用螢光素酶和海腎螢光素酶的比值表示。

1.9 ELISA 檢測將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在4 ℃條件下以2 500 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP 管并于-20 ℃下保存，避免反復凍融。根據(jù)試劑盒說明書對細胞上清液中IL-6及TNF-α的濃度進行測定。

1.10 LDH 與SOD 活力測定收集細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細胞數(shù)量以（500~1 000）∶1的比例加入提取液，超聲波破碎細胞，4 ℃條件下以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清，置冰上待測，根據(jù)試劑盒說明進行SOD 活力測定。根據(jù)細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到96 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞生長到合適密度后吸去培養(yǎng)液，用PBS 液洗滌一次。換新鮮無血清培養(yǎng)液，將各培養(yǎng)孔分組并做好標記，常規(guī)培養(yǎng)，根據(jù)試劑盒說明進行LDH活力測定。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測提取各組大鼠腦組織和細胞總蛋白，并用BCA 試劑盒進行蛋白濃度測定，以12 000 r/min 離心15 min 后收集上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳，電泳分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，隨后在室溫下用5%脫脂牛奶-PBS溶液封閉1.5 h。取出后用TBST 溶液洗膜，加入一抗后在4 ℃條件下孵育過夜，次日用TBST 洗膜3 次，加入二抗后在溫孵育1.5 h，TBST 再次洗膜3 次，配置ECL 化學發(fā)光液，加至膜上顯色顯影。并用Image J 軟件測量并計算目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比，每個蛋白樣品均以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參對照。

1.12 qRT-PCR按照Trizol 試劑盒說明書從腦組織和細胞中提取總RNA，以RNA 為樣本，用Super?Scrip?Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈基因，用SYBR Green PCR Kit 進行實時定量PCR。以上所有實驗步驟均按照試劑盒說明書進行操作。分別以GAPDH 和U6對STAT3 和miR-125a-5p 進行歸一化處理，2-ΔΔCt法對mRNA表達進行分析。詳細序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.13 統(tǒng)計學方法SPSS 23.0軟件被用于對本文數(shù)據(jù)進行分析。對計量資料進行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，若符合以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組內(nèi)兩兩比較采用SNK-q。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷能夠改善I/R大鼠腦損傷與假手術組組相比，模型組神經(jīng)功能缺損評分及腦含水量顯著增加（均P<0.05），金絲桃苷能提高I/R 大鼠神經(jīng)功能缺損評分，減少腦含水量，且效果呈劑量依賴性增強（均P<0.05）。TTC 染色評估腦梗死體積發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組腦梗死面積明顯增加，但金絲桃苷低劑量組腦梗死面積較模型組明顯縮小，金絲桃苷高劑量組腦梗死面積進一步縮?。ň鵓<0.05）。見表3。

表3 金絲桃苷對I/R大鼠腦損傷的改善作用/± s

表3 金絲桃苷對I/R大鼠腦損傷的改善作用/± s

注：①與假手術組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.2 金絲桃苷保護機制的生物信息學分析借助GSE82146 數(shù)據(jù)集分析I/R 中差異表達的基因，圖1A顯示了該數(shù)據(jù)集中I/R 大鼠與對照組的差異表達基因，將熱圖中顯示的上調(diào)基因進行KEGG分析，選擇與I/R 損傷相關的rno04066：HIF-1 信號通路（圖1B），該通路中富集的基因包括：CDKN1A，STAT3，HMOX1，TIMP1。將該通路中富集的基因和Dis?GeNET 數(shù)據(jù)庫查找到的I/R 風險基因進行PPI 蛋白互作用分析，PPI分析結(jié)果顯示STAT3在PPI網(wǎng)絡的中心位置，且與I/R 相關風險基因存在緊密聯(lián)系（圖1C）。qRT-PCR及蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果顯示，STAT3在模型組中較假手術組表達升高，且與模型組比較，金絲桃苷低劑量組STAT3 水平下調(diào)，而金絲桃苷高劑量組較金絲桃苷低劑量組水平更低（均P<0.05）。見圖2，表4。

圖2 金絲桃苷蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織中STAT3的mRNA和蛋白表達檢測結(jié)果/± s

表4 各組大鼠腦組織中STAT3的mRNA和蛋白表達檢測結(jié)果/± s

注：STAT3為信號傳導和轉(zhuǎn)錄激活因子3。①與假手術組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.3 miR-125a-5p 被證實為STAT3 的上游靶miR?NA利用DIANA、starBase、miRDB、TargetScan、miRWalk 對STAT3 的上游miRNA 進行預測并取交集，發(fā)現(xiàn)21個交集miRNAs（圖3），GO富集結(jié)果顯示hsa-miR-6835-3p、hsa-miR-125a-5p 均與血小板激活相關（P=0.035）。以往有研究證明，血小板活化異常與腦I/R 的發(fā)生和發(fā)展存在重要關聯(lián)［14-15］。qRTPCR結(jié)果顯示（表5），與假手術組相比，miR-125a-5p在模型組顯著下調(diào)，使用金絲桃苷后其表達水平顯著上調(diào)（均P<0.05），miR-6835-3p 表達在各組內(nèi)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。STAT3 和miR-125a-5p的特異性結(jié)合位點見圖4，雙螢光素酶報告實驗顯示，相對于mimic-NC 和STAT3-WT 共轉(zhuǎn)染組（1.00±0.12），miR-125a-5p mimic 和STAT3-WT 共轉(zhuǎn)染組（0.38±0.04）的螢光素酶活性顯著降低（P<0.05）。

圖4 靶向關系預測網(wǎng)站顯示的STAT3和miR-125a-5p的結(jié)合位點

表5 各組大鼠腦組織中miR-125a-5p和miR-6835-3p檢測結(jié)果/± s

表5 各組大鼠腦組織中miR-125a-5p和miR-6835-3p檢測結(jié)果/± s

注：miR-125a-5p 為微RNA-125a-5p，miR-6835-3p 為微RNA-6835-3p。①與假手術組比較，P<0.05。②與模型組比較，P<0.05。

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2.4 金絲桃苷對OGD/R 誘導的PC12 細胞的保護作用能被miR-125a-5p抑制劑部分消解與對照組相比，OGD/R 組細胞中miR-125a-5p 的表達顯著降低，金絲桃苷組較OGD/R 組miR-125a-5p 的水平上調(diào)（均P<0.05）。另外，與對照組比較，OGD/R 組細胞中IL-6、TNF-α 水平增加，LDH 水平上升，SOD 水平下降，使用金絲桃苷處理細胞后IL-6、TNF-α、LDH 水平下降，SOD 水平上升（均P<0.05）。而金絲桃苷+miR-125a-5p inhibitor 較金絲桃苷+inhibitor NC 組，IL-6、TNF-α 的濃度、LDH 活力均顯著提高，SOD活力下降（均P<0.05）。見表6。

表6 金絲桃苷對OGD/R誘導的PC12細胞的保護作用被miR-125a-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)/± s

表6 金絲桃苷對OGD/R誘導的PC12細胞的保護作用被miR-125a-5p inhibitor部分逆轉(zhuǎn)/± s

注：miR-125a-5p 為微RNA-125a-5p，IL-6 為白細胞介素-6，TNF-α 為腫瘤壞死因子-α，SOD 為超氧化物歧化酶，LDH 為乳酸脫氫酶，OGD/R為氧-葡萄糖剝奪/復氧。①與對照組比較，P<0.05。②與OGD/R組比較，P<0.05。③與金絲桃苷+inhibitor-NC組組比較，P<0.05。

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2.5 金絲桃苷對OGD/R 誘導的PC12 細胞的保護作用是通過miR-125a-5p/STAT3 實現(xiàn)的相對于OGD/R 組，使用金絲桃苷處理細胞后IL-6、TNF-α、LDH 水平下降，SOD 水平上升（P<0.05）。而相較于金絲桃苷+pcDNA3.1組，轉(zhuǎn)染pc-STAT3后IL-6、TNFα、LDH 水平提高，SOD 水平下降（P<0.05）。綜上結(jié)果說明金絲桃苷對OGD/R 誘導的PC12 細胞具有一定保護其不受炎性反應和氧化應激損傷的效果，而該效果能被過表達STAT3部分消解，結(jié)合實驗“2.3”部分，本研究認為金絲桃苷是通過上調(diào)miR-125a-5p抑制STAT3的表達發(fā)揮相應作用的。見表7。

表7 各組細胞炎性因子、SOD和LDH水平比較/± s

表7 各組細胞炎性因子、SOD和LDH水平比較/± s

注：IL-6為白細胞介素-6，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，SOD為超氧化物歧化酶，LDH為乳酸脫氫酶。①與OGD/R組比較，P<0.05。②與金絲桃苷+pcDNA3.1組比較，P<0.05。

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3 討論

先前研究表明，Hyperin能夠通過調(diào)節(jié)一氧化氮信號通路進而保護大腦皮層免受缺氧缺糖導致的再灌注損傷［6］。此外，劉佳佳等［16］在研究中使用50 mg/kg 的金絲桃苷處理腦I/R 小鼠，證實了其對神經(jīng)保護的作用。本實驗采用前人方法通過阻塞中動脈制備局灶性I/R，具有損傷小且時間可控的特點［17-18］。發(fā)現(xiàn)Hyperin 作用于大鼠腦I/R 損傷后，大鼠的神經(jīng)功能障礙有所改善，腦梗死體積顯著下降，腦水腫減輕。隨后進行生物信息學分析后發(fā)現(xiàn)異常上調(diào)的基因在HIF-1 通路中顯著富集。有證據(jù)表明，HIF-1 通路在I/R 損傷的病理進展密切相關：其介導的炎癥反應可預防I/R 損傷后神經(jīng)元的死亡［19］。該通路中富集的STAT3 基因與I/R 損傷風險基因緊密相關。STAT3可對多種細胞因子等進行調(diào)控從而發(fā)揮作用［20］。先前研究證明S1P 能夠激活STAT3，而抑制S1P 信號是一種治療腦缺血后血腦屏障損傷的策略［21］。下調(diào)STAT3 也被證實能夠改善I/R 損傷小鼠的神經(jīng)癥狀，縮小腦梗死范圍［22］。而miRNAs能通過與靶基因的3′-UTR端序列互補配對來促進靶基因的降解或抑制其翻譯，參與細胞分化凋亡及增殖等進程［23］。本研究進一步尋找可能調(diào)控STAT3 的上游miRNA，結(jié)合多種生物信息學工具最終將miR-125a-5p 納入研究。miR-125a-5p 經(jīng)GO 富集分析顯示與血小板激活通路相關。在腦缺血后期，血腦屏障遭到破壞，缺氧激活血小板通路釋放相關因子［24］。且miR-125已被證明其異常高表達能夠促進I/R 模型梗死體積減少，改善神經(jīng)行為等［9］。PC12 細胞來自大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系，與神經(jīng)細胞均來源于神經(jīng)脊，且與神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)、功能均有相似之處，且相較于神經(jīng)元更易獲得、培養(yǎng)［25］。因此本實驗借助前人方法［26］構(gòu)建PC12細胞的OGD/R 體外細胞模型，考察miR-125a-5p 與STAT3 在該疾病模型中的表達，并進行體外細胞學功能實驗。結(jié)果顯示Hyperin 能夠通過上調(diào)miR-125a-5p抑制STAT3的水平緩解炎癥因子的釋放。

此外本實驗考察了SOD 和LDH 的活力：SOD 在機體內(nèi)作為重要的抗氧化酶，可以參與清除氧自由基從而保護細胞不受氧化應激損傷，可作為考察體內(nèi)維持氧化還原平衡的重要因子［27］。而LDH 外滲常伴隨著較高的氧自由基，預示著胞內(nèi)鈣超載與膜脂質(zhì)的氧化損傷，從而導致細胞膜結(jié)構(gòu)改變，嚴重損害細胞功能，并造成神經(jīng)元死亡［28］。我們發(fā)現(xiàn)Hyperin 處理OGD/R 模型細胞能夠通過促進miR-125a-5p 的表達水平、抑制STAT3 表達，上調(diào)SOD 水平并降低LDH 的含量，從而顯著提高PC12 細胞的抗氧化應激能力。

綜上所述，本研究從動物及細胞模型兩個層面深入研究了Hyperin 在I/R 損傷中的生物學特性和功能，揭示了Hyperin 通過調(diào)控miR-125a-5p/STAT3軸在I/R 中發(fā)揮保護作用的可能機制。而擴大樣本數(shù)量、尋求金絲桃苷藥物的最佳治療劑量等，是本研究進一步完善的方向。綜上，本研究為I/R 治療提供了新的見解，顯示了中藥成分結(jié)合分子靶向技術潛在的應用價值。

（本文圖1，3見插圖7-1）