宋宇航,張孟寒,周瑞祥, 陳新宜,華 夏,齊學(xué)禮,汪月霞,李 艷

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002; 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物分子育種研究院,河南鄭州 450002)

小麥產(chǎn)量的90%～95%來自光合作用[1],其中30%～50%來自于旗葉的光合作用,因而,旗葉光合能力的強(qiáng)弱與小麥產(chǎn)量密切相關(guān)[2]。小麥灌漿前中期是旗葉捕獲光能進(jìn)行光合作用以及積累光合產(chǎn)物最高效、快速的時(shí)期[3]。因此,探索調(diào)控小麥灌漿前中期旗葉光合效率的機(jī)制,對(duì)于揭示小麥產(chǎn)量相關(guān)性狀的形成以及選育高產(chǎn)品種至關(guān)重要。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素,高葉綠素含量是保證高光合速率以及累積更多光合產(chǎn)物的前提[4]。Sperdouli 等[5]研究表明,葉綠素、ATP和NADPH酶的含量及其活性在很大程度上反映了小麥將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的能力。小麥在進(jìn)行光合作用時(shí),葉綠體作為光合細(xì)胞器將光能轉(zhuǎn)化為同化力( ATP和NADPH),進(jìn)而參與后續(xù)碳同化過程[6]。葉綠體光合作用所固定的大部分碳以淀粉的形式儲(chǔ)存在葉片中,在夜間降解后主要以蔗糖的形式轉(zhuǎn)移至籽粒[7]。葉片中貯存的淀粉以淀粉粒的形式存在,但淀粉粒在葉片中過度積累會(huì)導(dǎo)致葉綠體變形,破壞其結(jié)構(gòu)[8]。利用透射電鏡可以直觀地看到葉綠體的各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),包括類囊體、淀粉粒以及反映葉綠體受損程度的嗜鋨顆粒[9],隨著葉片衰老,葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化,嗜鋨顆粒明顯增多[10],葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞進(jìn)一步導(dǎo)致光合性能發(fā)生紊亂[11]。前人對(duì)小麥葉片的光合特性和葉綠體結(jié)構(gòu)變化研究的比較深入,而對(duì)灌漿期葉片衰老過程中的光合特性及其與葉綠體結(jié)構(gòu)間的相關(guān)性尚不明確。

本研究以河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分子育種團(tuán)隊(duì)最新培育的綠色超高產(chǎn)小麥新品種鄭麥1860為主要研究對(duì)象[12],同時(shí)選取河南省已經(jīng)大面積種植的品種百農(nóng)207和周麥18為對(duì)照,這兩個(gè)小麥品種與鄭麥1860成熟期相當(dāng),具備產(chǎn)量高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)[13],通過對(duì)比不同小麥品種間葉綠體的超微結(jié)構(gòu)、光合作用過程中的關(guān)鍵酶活性及光合產(chǎn)物含量等差異,探究小麥籽粒灌漿過程中旗葉葉綠體結(jié)構(gòu)與光合速率及產(chǎn)物含量之間的相關(guān)性,以期為高產(chǎn)小麥品種的培育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試材料為小麥品種鄭麥1860、百農(nóng)207和周麥18,于2020年10月21日在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工氣候室進(jìn)行。選用底部帶孔的塑料盆 (46 cm×34 cm×15 cm),每盆填充8 kg的土壤 (營(yíng)養(yǎng)土∶蛭石=3∶1),土壤含堿解氮51 mg·kg-1、速效磷140 mg·kg-1和速效鉀240 mg·kg-1。每個(gè)小麥品種每盆定苗30株 (分3列,每列10株),每個(gè)品種種植10盆。生長(zhǎng)期間保持土壤最大持水量的70%以上,并于分蘗期施肥1次,拔節(jié)期、孕穗期和灌漿期每2個(gè)星期施肥1次,每次每盆施肥15 g,肥料包含氯化鉀 (含K2O 60% )、尿素 (含N 46%) 和磷酸二銨 (含P2O546%,N 18% )。小麥抽穗開花期溫室設(shè)置參數(shù):白天20 ℃/晚上18 ℃,光照14 h/黑暗10 h,光照強(qiáng)度1 000 μmol·m-2·s-1,相對(duì)濕度40%;花后灌漿期溫室設(shè)置參數(shù):白天23 ℃/晚上20 ℃ ,光照14 h/黑暗10 h ,光照強(qiáng)度1 200 μmol·m-2·s-1,相對(duì)濕度40%。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

于小麥開花期,選擇同一天開花(開花率達(dá)到50%以上)且長(zhǎng)勢(shì)一致的3個(gè)小麥品種進(jìn)行掛牌標(biāo)記并記錄開花日期[14]。

1.2.1 旗葉光合參數(shù)測(cè)定

于花后15～21 d每天上午9:00-11:00,用CIRAS-3 光合測(cè)定儀(PP Systems,美國)測(cè)定標(biāo)記小麥旗葉的凈光合速率(Pn) 、氣孔導(dǎo)度(Gs)和細(xì)胞間隙CO2濃度 (Ci),固定光照強(qiáng)度設(shè)置為1 200 μmol·m-2·s-1。

1.2.2 旗葉葉綠素含量測(cè)定

取花后15～21 d的旗葉100 mg左右,剪成大小均勻的碎片后,按照李合生[15]的方法,將樣品浸泡于10 mL丙酮乙醇混合提取液(乙醇∶丙酮∶水的體積比=4.5∶4.5∶1)中黑暗處理18 h,分別在663 nm和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A663和A645),根據(jù)以下公式計(jì)算葉綠素含量:

Ca=9.874×A663-0.990×A645;

Cb=21.426×A645-4.650×A663;

CT= (Ca+Cb)×10/M

其中,Ca、Cb分別為葉綠素a和b的含量;CT為葉綠素總量,是葉綠素a和b的含量之和;M為旗葉鮮重。

1.2.3 旗葉葉綠素相對(duì)含量(SPAD值)測(cè)定

選取花后15～21 d的旗葉葉中部位,避開葉中脈,使用葉綠素SPAD 502 PLUS儀器( Konica Minolta,日本) 測(cè)定旗葉葉綠素相對(duì)含量。

1.2.4 旗葉ATP酶活性測(cè)定

取花后15和21 d的新鮮旗葉0.1 g,置于預(yù)冷的研缽中,用液氮徹底研磨至白色粉末,4 ℃ 8 000 g離心10 min后取上清,按照ATP酶活性檢測(cè)試劑盒 (索萊寶,北京)說明書的方法測(cè)定吸光度,并計(jì)算ATP酶活性。

1.2.5 旗葉NADPH酶含量測(cè)定

取花后15和21 d的新鮮旗葉約0.1 g,冰浴研磨后于95 ℃水浴5 min。然后于4 ℃ 10 000 g離心10 min后取上清液,按照輔酶II NADP (H) 含量測(cè)定試劑盒 (科銘,蘇州) 說明書的方法測(cè)定吸光度,并計(jì)算NADPH酶含量。

1.2.6 旗葉蔗糖和淀粉含量測(cè)定

取花后15和21 d的新鮮旗葉約0.1 g,用間苯二酚比色法[16]測(cè)定小麥旗葉蔗糖含量,用蒽酮比色法[17]測(cè)定小麥旗葉淀粉含量。

1.3 總RNA的提取和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的測(cè)定

取花后15和21 d的新鮮旗葉,用KK Fast Plant Total RNA Kit (離心柱型) 試劑盒(莊盟國際,北京)提取小麥旗葉總RNA,用核酸蛋白檢測(cè)儀(賽默飛,美國) 檢測(cè)總RNA濃度和純度,用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒 (諾唯贊,南京) 合成cDNA第一條鏈。參照NCBI數(shù)據(jù)庫提供的TaSS、TaFBA和TaSSSⅡ基因的保守區(qū)域片段,用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物 (表1),并由尚亞生物技術(shù)公司合成。按照SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(艾科瑞,長(zhǎng)沙)說明書的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,在Bio-Rad iQTm5實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(伯樂,美國)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù),以β-actin[20]為內(nèi)參基因,采用2-△△Ct法[18]計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for quantitative real-time PCR

1.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

取花后15和21 d的小麥新鮮旗葉,將其切成小塊(約1 mm×3 mm),浸泡于3%的戊二醛固定液中進(jìn)行預(yù)固定,冰置;然后用1%的四氧化鋨 (哈靈,上海)進(jìn)行再固定,分別用30%、50%、70%、90%、100% ( 100%重復(fù)兩次)的丙酮進(jìn)行逐級(jí)梯度脫水,每次進(jìn)行12 min,采用Epon 812包埋。利用半薄切片光學(xué)定位后,進(jìn)行超薄切片,用枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色,用HITACHI HT7700型透射電鏡 ( 日立,日本)進(jìn)行觀察[19]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理,數(shù)值以3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,用DPS通過Duncan新復(fù)極差法檢驗(yàn)差異顯著性 (α<0.05),用Origin 2021繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 三個(gè)小麥品種旗葉光合參數(shù)的比較

測(cè)定結(jié)果(表2)表明,花后15～21 d,鄭麥1860的旗葉凈光合速率(Pn) 、細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)和氣孔導(dǎo)度(Gs) 波動(dòng)相對(duì)平緩。在絕大多數(shù)時(shí)間點(diǎn),百農(nóng)207和周麥18的Pn、Ci和Gs均顯著低于鄭麥1860,只有少數(shù)時(shí)間點(diǎn)例外。如,花后16 d,百農(nóng)207的Pn與鄭麥1860無顯著差異;花后17 d,百農(nóng)207的Gs顯著高于鄭麥1860,周麥18的Gs與鄭麥1860無顯著差異,百農(nóng)207和周麥18的Ci均顯著高于鄭麥1860。這表明鄭麥1860旗葉光合能力相對(duì)較高。

表2 灌漿期三個(gè)小麥品種的旗葉光合參數(shù)Table 2 Photosynthetic parameters of flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

2.2 三個(gè)小麥品種旗葉葉綠素含量的比較

花后15～21 d,鄭麥1860、百農(nóng)207和周麥18的旗葉葉綠素ɑ、葉綠素b、葉綠素總含量和SPAD值之間波動(dòng)趨勢(shì)相似,且較為穩(wěn)定(表3)。對(duì)于葉綠素ɑ含量,鄭麥1860在花后16 d和19 d顯著高于周麥18,在花后17、18和21 d顯著高于百農(nóng)207和周麥18,而在花后15 d三個(gè)品種間無顯著差異;對(duì)于葉綠素b含量,鄭麥1860在花后16 d顯著高于周麥18,在花后18 d顯著高于百農(nóng)207和周麥18,而在其他時(shí)間點(diǎn)三個(gè)品種間無顯著差異;對(duì)于葉綠素總含量,鄭麥1860在花后15 d顯著高于百農(nóng)207,在花后16 d和21 d顯著高于周麥18,在花后18 d顯著高于百農(nóng)207和周麥18,而在花后17 d三個(gè)品種間無顯著差異;對(duì)于SPAD值,鄭麥1860在花后18～21 d顯著高于周麥18,而在花后15 d鄭麥1860與百農(nóng)207和周麥18間均無顯著差異,在花后16 d和17 d三個(gè)品種間均無顯著差異。這說明相對(duì)于其他兩個(gè)品種,鄭麥1860能夠保持較高的葉綠素含量,有利于在灌漿前中期捕獲更多的光能。

表3 灌漿期三個(gè)小麥品種的旗葉葉綠素含量和SPAD值Table 3 Chlorophyll contents and SPAD values in flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

2.3 三個(gè)小麥品種旗葉ATP酶活性和NADPH酶含量的比較

對(duì)三個(gè)小麥品種花后15 d和21 d的ATP酶活性和NADPH酶含量進(jìn)行測(cè)定,從表4可以看出,對(duì)于ATP酶活性,花后15 d三個(gè)品種間無顯著差異;花后21 d鄭麥1860顯著高于百農(nóng)207和周麥18;與花后15 d相比,花后21 d百農(nóng)207和周麥18顯著降低了62.77%和48.70%,但鄭麥1860僅降低了15.44%,且差異不顯著。對(duì)于NADPH酶含量,花后15 d和21 d鄭麥1860與百農(nóng)207均無顯著差異,但顯著低于周麥18;與花后15 d相比,花后21 d鄭麥1860和百農(nóng)207分別顯著降低了24.04%和33.33%,而周麥18僅降低了9.27%,且差異不顯著。說明相對(duì)于其他兩個(gè)品種,鄭麥1860能保持較高的ATP酶活性。

表4 灌漿期不同小麥品種的旗葉ATP酶活性和NADPH酶含量Table 4 ATPase activities and NADPH contents in flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

2.4 三個(gè)小麥品種旗葉蔗糖和淀粉含量的比較

通過對(duì)三個(gè)品種花后15 d和21 d旗葉中蔗糖和淀粉的含量進(jìn)行比較,結(jié)果(表5)顯示,對(duì)于蔗糖含量,花后15 d鄭麥1860顯著低于百農(nóng)207,但與周麥18無顯著差異;花后21 d鄭麥1860顯著高于百農(nóng)207和周麥18;與花后15 d相比,花后21 d鄭麥1860顯著提高了21.19%,而百農(nóng)207和周麥18分別顯著降低了23.97%和33.41%。對(duì)于淀粉含量,花后15 d鄭麥1860顯著高于百農(nóng)207和周麥18;花后21 d鄭麥1860顯著低于百農(nóng)207和周麥18;與花后15 d相比,花后21 d周麥18顯著提高了80.57%,百農(nóng)207略有降低,但差異不顯著,而鄭麥1860顯著降低了41.81%。這說明鄭麥1860旗葉中具有較高的光合產(chǎn)物積累速度,進(jìn)而為灌漿后期形成更多的淀粉提供能量及糖類原料物質(zhì)。

表5 灌漿期三個(gè)小麥品種的旗葉蔗糖和淀粉含量Table 5 Sucrose and starch contents in flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

2.5 三個(gè)小麥品種旗葉蔗糖與淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)旗葉中蔗糖和淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果(表6)顯示,花后15 d,TaFBA基因在鄭麥1860中的表達(dá)量與百農(nóng)207無顯著差異,但顯著高于周麥18;TaSS基因在三個(gè)品種間的表達(dá)量均無顯著差異;TaSSSⅡ基因在鄭麥1860中的表達(dá)量顯著高于百農(nóng)207和周麥18?；ê?1 d,TaFBA基因在鄭麥1860的表達(dá)量顯著低于百農(nóng)207,但顯著高于周麥18;TaSS基因在鄭麥1860中的表達(dá)量與百農(nóng)207無顯著差異,但顯著高于周麥18;TaSSSⅡ基因在鄭麥1860中的表達(dá)量顯著高于百農(nóng)207,但與周麥18無顯著差異。表明灌漿期鄭麥1860和百農(nóng)207旗葉中蔗糖合成相關(guān)基因保持較高的表達(dá)水平;但與鄭麥1860和周麥18相比,百農(nóng)207的淀粉合成相關(guān)基因表達(dá)水平相對(duì)較低。

表6 灌漿期三個(gè)小麥品種旗葉蔗糖和淀粉合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量Table 6 Relative expression levels of sucrose and starch synthesis-related genes in flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

2.6 三個(gè)小麥品種旗葉葉綠體超微結(jié)構(gòu)的比較

利用透射電鏡對(duì)葉綠體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),花后15 d,周麥18和百農(nóng)207旗葉的葉綠體中沉積了較多的嗜鋨顆粒,且有較大的淀粉粒出現(xiàn),周麥18的葉綠體中類囊體片層排列重復(fù)疏松,而百農(nóng)207的葉綠體中類囊體片層排列相對(duì)緊密;相較于周麥18和百農(nóng)207,鄭麥1860的葉綠體中類囊體片層排列清晰有序,堆砌緊密,其內(nèi)部淀粉粒更大更飽滿,而且只有少量嗜鋨顆粒出現(xiàn)(圖1A、B、C)。 花后21 d,周麥18和百農(nóng)207的葉綠體中類囊體片層較花后15 d排列更為緊密,但是界限變得模糊,且周麥18出現(xiàn)了大量的嗜鋨顆粒,未能觀察到淀粉粒,而百農(nóng)207嗜鋨顆粒變少,淀粉粒較大;相較于周麥18和百農(nóng)207,鄭麥1860的葉綠體中類囊體片層依然排列清晰有序,并且堆砌緊密,嗜鋨顆粒較少,也未觀察到淀粉粒(圖1D、E、F) 。這表明與其他兩個(gè)品種相比,鄭麥1860在灌漿期間能更持久地保持葉綠體結(jié)構(gòu)的完整性,為后期光合作用提供良好的場(chǎng)所。

A、B和C分別為花后15 d的周麥18、百農(nóng)207和鄭麥1860,D、E和F分別為花后21 d的周麥18、百農(nóng)207和鄭麥1860。 Chl:葉綠體;Cm:類囊體;Hu:嗜鋨顆粒;St:淀粉粒。A, B and C: Zhoumai 18, Bainong 207 and Zhengmai 1860 at 15 days after anthesis; D, E and F: Zhoumai 18, Bainong 207 and Zhengmai 1860 at 21 days after anthesis; Chl: Chloroplast; Cm: Thylakoid; Hu: Hungry particles; St: Starch granules.圖 1 灌漿期三個(gè)小麥品種旗葉葉綠體的超微結(jié)構(gòu)Fig.1 Chloroplast ultrastructure in flag leaves of the three wheat varieties during grain filling stage

3 討論

旗葉是小麥灌漿前中期 (花后15～21 d) 進(jìn)行光合作用且為籽粒提供干物質(zhì)的重要器官[11]。本研究發(fā)現(xiàn),花后15～21 d,鄭麥1860旗葉的Pn、Gs和Ci變化趨勢(shì)較為穩(wěn)定,同時(shí)ATP酶活性以及葉綠素含量、NADPH酶含量、蔗糖含量(花后21 d)和淀粉含量(花后15 d)均保持較高水平,且蔗糖合成相關(guān)基因(TaSS、TaFBA)的相對(duì)表達(dá)量也較高,這些結(jié)果表明,鄭麥1860在花后15～21 d能捕獲和吸收更多光能,并產(chǎn)生較多的ATP和NADPH,這個(gè)過程需要吸收更多的CO2來參與,最終導(dǎo)致小麥葉片Gs增大,氣體交換速率、Ci和Pn提高,這與Ravi等[21]在甘薯中的研究結(jié)果一致。

蔗糖作為植物從源到庫的主要碳水化合物,高水平的蔗糖含量能進(jìn)一步提高光合產(chǎn)物積累的速度[22]。本研究結(jié)果表明,花后21 d鄭麥1860的旗葉仍能維持較高的蔗糖含量,表明該品種具有較快的光合產(chǎn)物積累速度,有利于為籽粒灌漿提供更多的糖類原料物質(zhì)。

TaSS和TaFBA作為蔗糖合成關(guān)鍵酶的相關(guān)基因,在光合作用中也發(fā)揮著重要作用,其中TaFBA基因參與植物的碳循環(huán),是控制光合速率的關(guān)鍵酶之一[23]。本研究發(fā)現(xiàn),花后21 d鄭麥1860的旗葉TaSS和TaFBA基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于周麥18,這可能是鄭麥1860旗葉蔗糖含量較高的重要原因。旗葉淀粉含量測(cè)定結(jié)果表明,花后15 d鄭麥1860的旗葉淀粉含量雖顯著高于另外兩個(gè)品種,但在花后21 d卻最低,表明在灌漿前期三個(gè)品種都在大量積累光合產(chǎn)物,并暫時(shí)儲(chǔ)存在旗葉中[3],隨著灌漿的進(jìn)行,旗葉中的光合產(chǎn)物往籽粒中運(yùn)輸[24],推測(cè)鄭麥1860旗葉光合產(chǎn)物的運(yùn)輸速率高于其他兩個(gè)品種。TaSSSⅡ是淀粉合成過程中的關(guān)鍵基因之一,其表達(dá)水平表明,花后21 d鄭麥1860仍具有較高的表達(dá)量,但旗葉中光合產(chǎn)物淀粉的含量相對(duì)最低,推測(cè)與淀粉向籽粒的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[14],這可能是鄭麥1860產(chǎn)量相對(duì)其他兩個(gè)品種較高的重要原因。同時(shí),相對(duì)于鄭麥1860,花后21 d百農(nóng)207具有較高的TaFBA基因表達(dá)量,但TaSSSⅡ基因的相對(duì)表達(dá)量卻相對(duì)較低,因此制約了其旗葉蔗糖和淀粉的合成及向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)的進(jìn)程。Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn),與低光效品種相比,高光效品種可以更加及時(shí)的將光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)阶蚜Ｖ?有助于維持其較高的光合速率。

類囊體膜作為植物光合作用能量轉(zhuǎn)換的“車間”,其類囊體片層完整和有序排列是葉綠體正常進(jìn)行光合作用的基礎(chǔ)[25]。小麥籽粒灌漿過程與旗葉衰老密切相關(guān),旗葉衰老過程中,葉綠體中嗜鋨顆粒會(huì)逐漸累積[9],進(jìn)而影響葉綠體類囊體膜的穩(wěn)定性,導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)發(fā)生分解[26]。本研究通過對(duì)三個(gè)小麥品種旗葉葉綠體的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)花后21 d鄭麥1860葉綠體的類囊體片層仍排列清晰有序且堆砌緊密,幾乎沒有嗜鋨顆粒,表明該品種可以維持完整的葉綠體結(jié)構(gòu),在灌漿中期仍能捕獲更多光能[27],進(jìn)一步將光反應(yīng)中心轉(zhuǎn)化的電能轉(zhuǎn)換為活躍的化學(xué)能,并最終促進(jìn)籽粒中淀粉的形成[5]。

4 結(jié)論

鄭麥1860具有較高的ATP酶活性以及葉綠素和NADPH酶含量,保證了高效的光能吸收和轉(zhuǎn)化利用效率;另外,鄭麥1860具有較為穩(wěn)定的葉綠體結(jié)構(gòu),使其在灌漿中期仍能捕獲更多的光能,維持較高的光合速率和光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)速度,最終促進(jìn)籽粒中淀粉的形成。