盧保德, 韋柳興, 李鎮(zhèn)杰, 林志弟, 黃勇平

(右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 泌尿外科, 廣西 百色, 533000)

膀胱癌是泌尿外科常見的惡性腫瘤,據(jù)全球癌癥協(xié)會[1]統(tǒng)計, 2020年膀胱癌新發(fā)病例為57.3萬例,死亡病例為21.2萬例,其發(fā)病率和致死率均呈上升趨勢。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的常見原因,研究膀胱癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找新的潛在治療靶點,對膀胱癌的防治有重要意義。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA, 在細胞增殖、分化、蛋白修飾等方面發(fā)揮重要作用[2], 是近年來腫瘤學(xué)研究的熱點。LINC02178是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA, 在多種腫瘤中異常表達。SUN Z L等[3]基于公共數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn), LINC02178可能參與膀胱癌細胞自噬,并與患者預(yù)后不良相關(guān)。本研究在公共數(shù)據(jù)庫分析的基礎(chǔ)上,結(jié)合分子生物學(xué)實驗研究LINC02178對膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響,并初步探討其分子機制,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

細胞系J82、T24、5637、SV-HUV-1均購自中國科學(xué)院上海細胞庫; Trizol購自天根公司; TransStart?Green qPCR SuperMix購自北京全式金公司; LINC02178引物由上海生工公司合成; 胎牛血清購自Gibco公司; DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司; Lipofectamine2000購自Invitrogen公司; Transwell小室購自Corning公司; siRNA-LINC02178和陰性對照系列由湖州河馬生物公司設(shè)計合成,磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)等抗體均購自北京安諾倫公司。

1.2 方法

1.2.1 LINC02178在公共數(shù)據(jù)庫中的分析: 在腫瘤與癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中下載414例膀胱癌患者的RNAseq和臨床病理、生存數(shù)據(jù)。采用R語言的基礎(chǔ)R包、ggplot2包分析LINC02178在膀胱癌中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系。采用R語言的survival包分析LINC02178與膀胱癌患者生存預(yù)后的關(guān)系,并繪制生存曲線。

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染: 膀胱癌細胞系T24、J82、5637和正常膀胱上皮細胞SV-HUV-1細胞采用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2的相對飽和濕度。取對數(shù)生存期的J82細胞,采用Lipofectamine2000將LINC02178干擾系列和陰性對照系列轉(zhuǎn)染至細胞中,將細胞分為si-LINC02178組和si-NC組。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測LINC02178表達水平: 取各膀胱癌細胞系及經(jīng)不同處理的各組細胞(si-LINC02178組、si-NC組、T24、J82、5637、SV-HUV-1)培養(yǎng)48 h, 采用胰酶消化,提取總RNA, 檢測純度合格后,按照試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成互補DNA(cDNA), -20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板,進行實時熒光定量PCR, LINC02178上游引物為5′-GAGGGAGCCGAGGCAGTTTC-3′, 下游引物為5′-GAGGTCCTGTACCGAGGGGG-3′;GAPDH上游引物為5′-GCGGGGCCTCTCCAGAACATC-3′, 下游引物為5′-ACTGACACGTTGGCAGTGGG-3′; 反應(yīng)條件為95 ℃下35 s預(yù)變性, 95 ℃變性10 s, 60 ℃延伸35 s, 擴增38個循環(huán),采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.4 噻唑藍(MTT)實驗檢測細胞增殖: 將轉(zhuǎn)染si-LINC02178組、si-NC組J82細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,將細胞接種到96孔板中,待細胞貼壁后,各組細胞在0、24、48、72 h時,每孔加MTT溶液20 μL, 在培養(yǎng)箱中孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測定各孔光密度值(OD值),以時間為橫坐標(biāo),以450 nm處OD值(OD450 nm)為縱坐標(biāo),繪制細胞生長曲線。

1.2.5 Transwell檢測細胞遷移: 取各組細胞培養(yǎng)48 h, 胰酶消化,離心收集細胞,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),制備單細胞懸液,密度為3×105個/mL。將300 μL調(diào)好密度的細胞懸液加入上室中,下室加500 μL全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h, 采用4%多聚甲醛固定20 min, 棉簽擦去上室中的細胞,結(jié)晶紫室溫染色10 min, 沖洗掉多余染料, 100倍顯微鏡拍照,計算各孔穿過膜的細胞數(shù)量。

1.2.6 Transwell檢測細胞侵襲: 將基質(zhì)膠適當(dāng)稀釋,平鋪于上層小室,放入37 ℃培養(yǎng)箱中凝固,出現(xiàn)“白色層”后取出小室,其他步驟同1.2.5。

1.2.7 Western blot實驗: si-LINC02178和si-NC組擴大培養(yǎng),收集對數(shù)生長期細胞,采用RIPA緩沖液裂解細胞,提取蛋白,采用BCA試劑盒測定蛋白濃度,隨后通過凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上; 采用濃度為5%的脫脂奶粉封閉2 h, 洗膜2次,加入一抗, 4 ℃孵育過夜; 再次洗膜3次后,加入二抗,室溫孵育2 h后,化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達水平,以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS23.0和R3.6.3軟件進行分析, GraphPad Prism7.0軟件制圖。采用Kaplan-Meier法分析LINC02178表達與膀胱癌生存預(yù)后的關(guān)系。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用t檢驗,計數(shù)資料采用卡方檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LINC02178在膀胱癌組織中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示, LINC02178在膀胱癌組織中的表達高于膀胱正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。以中位數(shù)為臨界值,分為LINC02178高表達和低表達患者,結(jié)果顯示LINC02178表達與臨床病理T分期相關(guān)(P<0.05), 見表1。生存分析顯示, LINC02178高表達患者生存預(yù)后相較低表達患者更差,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

表1 LINC02178表達與臨床病理特征關(guān)系

A: LINC02178在膀胱癌中的表達; B: LINC02178與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系。圖1 LINC02178在膀胱癌組織中的表達及與預(yù)后的關(guān)系

2.2 LINC02178在膀胱癌細胞中的表達

LINC02178在膀胱癌細胞系J82、T24、5637中相對表達量分別為(2.13±0.01)、(1.84±0.03)、(1.73±0.04), 均高于SV-HUV-1細胞中的LINC02178表達量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 見圖2。因LINC02178在J82細胞中表達最高,故選用J82細胞進行下一步的研究。

2.3 轉(zhuǎn)染后細胞中LINC02718的表達

轉(zhuǎn)染后si-LINC02718組J82細胞LINC02718的表達量為(0.23±0.01), 低于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明細胞中LINC02178的表達被有效抑制。見圖3。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖3 LINC02178在J82細胞敲低效率驗證

2.4 沉默LINC02178對細胞增殖的影響

沉默LINC02178后, si-NC組48 h細胞活性O(shè)D值為(0.79±0.01), si-LINC02178組為(0.61± 0.02), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05); si-NC組72 h細胞活性O(shè)D值為(1.21±0.02), si-LINC02178組為(0.86±0.03), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明抑制LINC02178表達后,膀胱癌細胞增殖速度減慢。見圖4。

與si-LINC02178組比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖4 沉默LINC02178后細胞增殖曲線

2.5 沉默LINC02178后對細胞侵襲的影響

Transwell結(jié)果顯示, si-NC組侵襲細胞數(shù)為(179.30±4.26)個, si-LINC02178組為(91.33±2.02)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明沉默LINC02178后細胞侵襲能力減弱。見圖5。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖5 沉默LINC02178后細胞侵襲能力變化

2.6 沉默LINC02178后對細胞遷移的影響

遷移實驗顯示, si-LINC02178組細胞遷移數(shù)目為(98.33±3.84)個, si-NC組為(196.30±2.73)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 說明沉默LINC02178后細胞遷移能力下降。見圖6。

與si-NC組比較, ???P<0.001。圖6 沉默LINC02178后細胞遷移能力變化

2.7 沉默LINC02178后對PI3K/Akt信號通路的影響

沉默LINC02178后, si-NC組和si-LINC02178組中PI3K、Akt蛋白的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); si-LINC02178組中磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白的表達水平低于si-NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

與si-NC組比較, ??P<0.01, ???P<0.001。圖7 沉默LINC02178表達后的蛋白表達變化

3 討 論

膀胱癌在泌尿系腫瘤中發(fā)病率高,其中75%為非肌層浸潤膀胱癌, 25%為肌層浸潤性膀胱癌[4-5]。膀胱根治性切除是肌層浸潤性膀胱癌治療的金標(biāo)準(zhǔn),但有約50%的患者會出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移,發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者大部分在2年內(nèi)死亡[6], 其主要原因是現(xiàn)有的化療方案針對進展或轉(zhuǎn)移的晚期膀胱癌患者的治療效果有限,缺乏高效的靶向藥物[7]。因此,尋找新型分子標(biāo)志物,研究其進展、轉(zhuǎn)移的分子機制,對改善膀胱癌的診治方式以及降低死亡率有重要的意義。

研究[8]顯示lncRNA是一類無編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子,但在機體中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,尤其是在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中[9]。多項研究[10-11]發(fā)現(xiàn)lncRNA能參與調(diào)控惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)功能, lncRNA的異常表達與多種腫瘤的病理分期、預(yù)后相關(guān),有望成為腫瘤診斷、預(yù)后及靶向治療的新標(biāo)志物[12-13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1表達上調(diào)可促進膀胱癌細胞增殖和遷移,對膀胱癌具有較高的臨床輔助診斷價值,可作為膀胱癌預(yù)后不良的標(biāo)志物[15-16]。研究[17]發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在多種癌癥中異常表達, H19表達失調(diào)可通過多種機制影響癌癥生物學(xué),被認為是癌癥的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點[18]。LINC02178是新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,在腫瘤中的研究較少。PAN J F等[19]基于LUSC數(shù)據(jù)庫構(gòu)建肺癌預(yù)后相關(guān)的lncRNA風(fēng)險模型,發(fā)現(xiàn)LINC02178可作為預(yù)測肺腺癌預(yù)后的標(biāo)志物,指導(dǎo)患者的個體化治療。SUN Z L等[3]利用TCGA數(shù)據(jù)庫中膀胱癌患者數(shù)據(jù)進行分析,發(fā)現(xiàn)LINC02178與膀胱癌自噬相關(guān),且與患者總生存期存在顯著相關(guān)性。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析LINC02178在膀胱癌組織中的表達,發(fā)現(xiàn)LINC02178在膀胱癌組織中表達上調(diào),與臨床病理分期有關(guān),生存分析也發(fā)現(xiàn)LINC02178高表達的患者生存預(yù)后更差。上述研究表明LINC02178在癌癥的診斷和預(yù)后中有重要價值,但LINC02178在癌癥中的作用仍缺乏相關(guān)實驗研究。

本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,采用qRT-PCR檢測LINC02178在膀胱癌細胞中的表達水平,發(fā)現(xiàn)LINC02178在膀胱癌細胞T24、J82、5637中的表達量均顯著高于膀胱正常上皮細胞; 同時,轉(zhuǎn)染下調(diào)J82細胞中LINC02178的表達后, qRT-PCR檢測結(jié)果顯示si-LINC02178組細胞中LINC02178表達量顯著低于si-NC組,說明轉(zhuǎn)染干擾細胞后LINC02178表達被有效抑制; MTT細胞增殖試驗顯示, si-LINC02178組細胞在48、72 h的細胞活性顯著低于si-NC組,說明沉默膀胱癌細胞LINC02178后可降低細胞增殖活性,提示LINC02178可能參與了膀胱癌細胞的增殖過程; Transwell檢測顯示, si-LINC02178組侵襲和遷移細胞數(shù)均顯著低于si-NC組,說明沉默膀胱癌細胞LINC02178可抑制細胞的侵襲、遷移。PI3K/Akt是人體內(nèi)重要的信號通路,與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),涉及細胞增殖、分化、侵襲等多個調(diào)控環(huán)節(jié)。CHEN Y等[20]報道環(huán)狀RNA_0000326可以通過海綿化miR-338-3p上調(diào)ETS1, 激活PI3K/Akt通路而促進膀胱癌細胞增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)LINC02178表達后, PI3K、Akt蛋白表達水平無明顯改變,而p-PI3K、p-Akt表達顯著下調(diào),提示下調(diào)LINC02178可能通過抑制PI3K/Akt通路磷酸化來調(diào)控膀胱癌細胞的增殖和遷移。

綜上所述, LINC02178在膀胱癌組織中高表達,與患者預(yù)后不良有關(guān),沉默LINC02178后可抑制細胞增殖、侵襲和遷移,其機制可能是通過PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。