黃仁權(quán)

(貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學院, 貴陽 551400)

葉綠素是綠色植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素,在光合作用的能量捕獲及能量傳遞中起著重要作用。葉綠素合成是一個復雜的過程,需要20多個基因編碼的16種酶共同參與完成[1],該途徑中任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生突變都可能影響葉綠素的合成,從而引起葉色異常甚至導致植株死亡。因此,對作物葉色突變體的研究,探討葉綠素的生物合成途徑具有重要意義。

水稻是一種重要的糧食作物,水稻生產(chǎn)對全球糧食安全以及可持續(xù)發(fā)展具有極其重要的地位[2]。黎平雜邊禾dss1突變體是貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室課題組通過EMS誘變獲得穩(wěn)定遺傳的水稻突變體,該突變體葉片從分蘗期開始表現(xiàn)葉色深綠,整個生長期都保持這一特性,是一份極具研究潛力的葉色突變體材料。為了探究黎平雜邊禾dss1突變體葉色深綠的突變機制,進一步豐富葉色育種突變體庫材料,本研究對dss1突變體葉綠素含量及葉綠素合成途徑中的前體物質(zhì)進行測定,同時對葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵基因表達量進行分析,以期為水稻葉色突變體育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

黎平雜邊禾dss1突變體由貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室提供。

1.2 方 法

1.2.1葉綠素含量測定

于水稻分蘗期采摘劍葉,測定時每份材料隨機選取長勢相對一致的植株各10株,葉綠素含量測定參照沈偉其[3]方法進行。利用BECKMAN DU 640型分光光度計測定浸提液在470 nm、645 nm和663 nm波長處的吸光值,3次重復。

1.2.2葉綠素前體物質(zhì)測定

選取籽粒飽滿的dss1突變體和野生型種子,利用1% NaClO溶液分別對其種子表面漂洗10 min,用清水沖洗20 min后盛入網(wǎng)袋,放置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng),待其露白后播種于培養(yǎng)皿中,并以濾紙作為固定基質(zhì),在黑暗條件下培養(yǎng)10 d后取子葉測定葉綠素前體物質(zhì)。其中,δ-氨基乙酰丙酸(ALA)參考Dei[4]方法測定,膽色素原(PBG)參考Bogorad[5]方法測定,尿卟啉原Ⅲ(Urogen Ⅲ)和糞卟啉原(Coprogen Ⅲ)參照Bogorad[5]方法測定,原卟啉Ⅸ(Proto Ⅸ)、鎂原卟啉(Mg-Proto)和原脫植基葉綠素(Pchlide)參考Rebeiz等[6]和Lee等[7]的方法測定。

1.2.3引物設計

根據(jù)GenBank中已報道基因序列,運用BIAST程序?qū)θ~綠素合成途徑中關(guān)鍵基因引物進行設計(表1)。

表1 葉綠素合成相關(guān)基因Real-time PCR檢測引物

1.2.4Real-time PCR反應

Real-time PCR反應根據(jù)ABI Power SYBR?Green PCR Master Mix使用操作說明進行,冰上配置反應液,ABI公司7500 Real time PCR儀上進行反應,PCR反應體系為:Power SYBR?Green PCR Master Mix 10 μL, Forward Primer 1 μL, Reverse Primer 1 μL, Template cDNA 1 μL, 水7 μL,反應條件為95 ℃ 10 min 1 cycle;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min 40 cycles。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗所得數(shù)據(jù)通過Excel軟件和SPSS軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 dss1突變體葉綠素含量

與野生型水稻相比,dss1突變體從分蘗期開始表現(xiàn)出植株矮小、葉色深綠的特征。分蘗期dss1突變體類胡蘿卜素含量與野生型含量差異不顯著,但葉綠素a和葉綠素b含量分別為野生型的1.4倍和1.3倍,光合色素含量比野生型增加25.6%,差異達極顯著水平(圖1 A;圖1 B)。說明dss1突變體葉色深綠是由于光合色素含量增加導致的。

圖1 dss1與野生型表型

2.2 dss1突變體葉綠素合成前體物質(zhì)含量

從圖2 C～圖2 E可以看出,在葉綠素合成途徑中,從δ-氨基乙酰丙酸(ALA)到原卟啉Ⅸ(Proto Ⅸ)含量都是dss1突變體低于野生型。隨著葉綠素合成代謝的進行,后期合成的Mg-Proto和Pchlide含量dss1突變體卻顯著高于野生型,dss1突變體中原卟啉(Proto Ⅸ)含量為野生型的47.5%,而鎂原卟啉(Mg-Proto)含量為野生型的1.71倍。

2.3 dss1突變體葉綠素合成途徑關(guān)鍵基因表達差異

利用Real-time PCR檢測分蘗期dss1突變體和野生型水稻中葉綠素合成途徑中關(guān)鍵基因的表達水平。由圖3 F可知,dss1突變體中CHLD基因的表達水平比野生型低,而CHLH基因和DVR基因的表達量比野生型高,分別為野生型的4.1倍和1.6倍,CAO基因的表達量與野生型差異不顯著。羅韜[8]研究表明,CHLH亞基在反應過程中主要是進行底物運輸,CHLH基因的表達水平是鎂離子鰲合酶活性調(diào)控的關(guān)鍵點。由此可以說明,dss1突變體中Mg-Proto Ⅸ的合成較野生型高,是由于CHLH基因高表達調(diào)控的結(jié)果。

3 結(jié)論與討論

葉綠素是綠色植物葉綠體內(nèi)參與光合作用的重要色素,其合成途徑中相關(guān)物質(zhì)含量發(fā)生變化,將會影響植株正常生長。關(guān)于葉綠素缺乏而導致的葉色突變體報道較多,如OsCAO1基因的突變會導致植株葉綠素b合成嚴重受阻和含量減少,并表現(xiàn)出蒼白葉表型,其植株不能正常進行光合作用,甚至早衰早亡[9];YGL1編碼葉綠素合酶,催化葉綠素酸醋a轉(zhuǎn)化為葉綠素a,該基因的突變導致突變體ygl1葉綠素合成受阻,表現(xiàn)為黃綠葉[10]。而在植株生長周期中葉色加深或保持綠色等相關(guān)的水稻突變體卻鮮有報道。本研究發(fā)現(xiàn),dss1突變體從分蘗期開始表現(xiàn)出葉色較野生型深綠,并且在后期的生長中葉色一直保持深綠的特征,這對維持植株后期較高的光合作用從而促進籽粒的積累具有重要作用。因此,dss1突變體可作為良好的科研材料,對豐富水稻葉色突變體庫以及品質(zhì)改良等方面具有重要的研究價值。

本研究通過前體物質(zhì)測定發(fā)現(xiàn),dss1突變體與野生型主要是在由鎂離子鰲合酶調(diào)控從Proto Ⅸ合成Mg-Proto這一步驟存在差異,其中編碼該酶的CHLH基因在dss1突變體中顯著上調(diào)于野生型,推測可能是由于在dss1突變體中控制該突變性狀基因發(fā)生突變,影響CHLH基因的表達從而影響鎂離子鰲合酶活性,最終影響植株葉綠素的合成。