李逸菲，王瑞博，夏惠婷，任璞玉，趙丹丹，秦肖潔，李永華，張開(kāi)明

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院，鄭州 450002）

四季秋海棠（Begonia semperflorens）別稱四季海棠，是秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠屬（Begonia）多年生宿根草本開(kāi)花植物，原產(chǎn)巴西熱帶地區(qū)，是一類優(yōu)良的觀賞景觀花卉?；ㄆ陂L(zhǎng)且開(kāi)花繁茂，廣泛應(yīng)用于園林植物造景。四季秋海棠可通過(guò)扦插、播種、分株、組織培養(yǎng)等方法繁殖。葉片易受低溫、高光、干旱等脅迫變紅[1-2]。

對(duì)逆境脅迫響應(yīng)和適應(yīng)機(jī)制在一定程度上影響植物栽培繁育及園林價(jià)值。隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，園林植物逆境脅迫機(jī)理研究由生理水平進(jìn)入分子水平[3]。轉(zhuǎn)基因技術(shù)是改良植物特性重要手段，但缺乏穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系仍是制約四季秋海棠轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展的重要因素。國(guó)內(nèi)外關(guān)于四季秋海棠綠葉紅花品系‘超級(jí)奧林匹克’遺傳轉(zhuǎn)化的研究鮮有報(bào)道，相關(guān)研究主要集中在秋海棠屬為數(shù)不多的40 余個(gè)種中離體培養(yǎng)和再生體系初步研究方面。Karpova 等通過(guò)比較大花海棠離體培養(yǎng)與溫室植物葉片色素含量與葉色參數(shù)，設(shè)計(jì)出再生和高效離體繁殖方案[4]；張明等以四季秋海棠葉片為外植體建立離體再生體系，移栽成活率為96%[5]；Aswathy 等經(jīng)由組織解剖和遺傳特征解讀證實(shí)離體微繁是一種可靠的馬拉巴爾秋海棠大規(guī)模繁殖模式[6]；Hosseinabadi 等優(yōu)化用于實(shí)現(xiàn)蟆葉秋海棠高效再生體外培養(yǎng)體系[7]。此類研究為秋海棠屬植物快速繁殖培育及基因工程研究提供必要的材料體系與技術(shù)條件。目前，關(guān)于秋海棠屬植物遺傳轉(zhuǎn)化體系與生物工程研究的報(bào)道較多，楊夢(mèng)潔等借助葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法確立瓦氏秋海棠穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系[8]；趙志新以葉片為外植體初步建立四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系[9]；Xu 等研究竹節(jié)秋海棠中異位表達(dá)KNOX基因產(chǎn)生4 種觀賞類型轉(zhuǎn)基因植株[10]；Kiyokawa等為3種商業(yè)秋海棠品種開(kāi)發(fā)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系[11]。此類研究對(duì)推進(jìn)該屬植物分子育種進(jìn)程和基因功能鑒定具有重要意義。

借由基因工程技術(shù)開(kāi)展分子育種將成為優(yōu)良品種選育與物種資源提升的重要手段，而穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系將為植物基因功能研究提供豐富基因資源，推動(dòng)植物遺傳育種創(chuàng)新與新資源創(chuàng)制。Liang等基于農(nóng)桿菌高效轉(zhuǎn)化小麥幼胚的Pure?Wheat技術(shù)篩選得到再生能力與農(nóng)藝性狀更優(yōu)的小麥品系，為小麥轉(zhuǎn)基因與基因編輯研究提供合適的植物材料[12]；王思凡等綜合國(guó)內(nèi)外大麻遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，大麻種質(zhì)資源改良與高價(jià)值品種創(chuàng)制有賴于穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法[13]。

因此，本研究在課題組前期已建立四季秋海棠離體再生體系基礎(chǔ)上，以四季秋海棠無(wú)菌苗為試驗(yàn)材料，探究農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，優(yōu)化預(yù)培養(yǎng)、農(nóng)桿菌侵染液濃度（OD600）、侵染時(shí)間與共培養(yǎng)等參數(shù)，初步建立四季秋海棠高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，為四季秋海棠分子育種與基因功能研究提供技術(shù)支撐，對(duì)開(kāi)展多層次多領(lǐng)域四季秋海棠逆境脅迫應(yīng)答機(jī)制及植物新種質(zhì)創(chuàng)制提供材料資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

四季秋海棠綠葉紅花品系‘超級(jí)奧林匹克’種子購(gòu)自廈門(mén)愛(ài)墾園藝有限公司。種子播種于1/2MS基本培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為晝25 ℃/夜23 ℃，光周期為晝14 h/夜10 h，光照強(qiáng)度為10 000 lx，相對(duì)濕度為60%，約25 d 后發(fā)芽。待無(wú)菌苗長(zhǎng)至約有10 片展開(kāi)葉時(shí)，選取生長(zhǎng)健壯植株的葉片作為外植體材料。

1.1.2 菌株與載體

試驗(yàn)所需根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefa?ciens）菌株GV3101 購(gòu)自北京擎科生物科技有限公司；pCanG-EGFP超表達(dá)載體為深圳仙湖植物園李凌飛老師饋贈(zèng)，該載體含有35S啟動(dòng)子，NOS終止子，NPTⅡ基因（卡那霉素抗性基因）和EGFP基因（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因）；pCanG-EGFP-BsR?bohD過(guò)表達(dá)載體為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 試劑與培養(yǎng)基

乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）、利福平（Rifampicin，Rif）、卡那霉素（Kanamycin，Kan）、羧芐青霉素（Carbenicillin，Carb）、6-芐氨基嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）、萘乙酸（1-naphthl?cetic acid，NAA）等激素購(gòu)自鄭州金圖生物科技有限公司。反轉(zhuǎn)錄和熒光定量試劑盒購(gòu)自杭州碩盟生物科技有限公司。

①LB（農(nóng)桿菌培養(yǎng)基）：酵母提取物5 g·L-1，胰蛋白胨10 g·L-1，NaCl 10 g·L-1；

②MS 培養(yǎng)基：MS 4.4 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1；

1/2MS（基本培養(yǎng)基）：MS 2.2 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1；

③MS1（預(yù)培養(yǎng)基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA；

④MS2（懸浮液）：MS；

⑤MS3（共培養(yǎng)基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+AS 100 mol·L-1；

⑥MS4（過(guò)渡培養(yǎng)基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1；

⑦M(jìn)S5（篩選培養(yǎng)基）：MS+0.5 mg·L-16-BA+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1+Kan 25 mg·L-1；

⑧MS6（生根培養(yǎng)基）：1/2MS+0.12 mg·L-1NAA+Carb 400 mg·L-1+Kan 25 mg·L-1。

用于四季秋海棠組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基除MS2外，均加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂7.8 g·L-1，pH 5.8。121 ℃高溫高壓滅菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 篩選抗生素Kan與抑菌劑Carb濃度的確定

以無(wú)菌培養(yǎng)的四季秋海棠葉片為外植體，切成1 cm×1 cm 大小，分別接種至含有不同濃度Kan（0，15，25，35，45 mg·L-1）初代培養(yǎng)基MS1 上。弱光培養(yǎng)每15 d繼代一次，40 d后觀察統(tǒng)計(jì)不同處理中外植體分化率，確定合適篩選濃度。每個(gè)處理重復(fù)2 次，每次重復(fù)接種30 個(gè)外植體。通過(guò)查閱文獻(xiàn)分析農(nóng)桿菌對(duì)Carb 抗性，確定最優(yōu)抑菌濃度。

1.2.2 四季秋海棠葉片預(yù)培養(yǎng)

取無(wú)菌苗葉片切成1 cm×1 cm大小，接種至預(yù)培養(yǎng)基MS1中暗培養(yǎng)，設(shè)置溫度23~25 ℃，保持其他條件一致，僅設(shè)置不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間分別為1、2與3 d，誘導(dǎo)外植體處于不同感受態(tài)，探究預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染液濃度及侵染時(shí)間

將攜帶有目的載體質(zhì)粒pCanG-EGFP-BsRbohD的根癌農(nóng)桿菌GV3101 于LB 液體培養(yǎng)基中（含Kan 50 mg·L-1和Rif 50 mg·L-1）28 ℃、220 r·min-1搖菌培養(yǎng)36 h，MS2 懸浮液（MS 4.43 g·L-1）兩次重懸農(nóng)桿菌菌體，條件分別為25 ℃、4 000×g離心10 min收集菌液，棄上清，MS2 懸浮液重懸浮菌體并清洗，25 ℃、5 000×g 離心5 min 收集菌液，再次用MS2重懸液重懸菌體。方法參考劉紅利[14]。

兩次重懸菌體后，利用MS2 懸浮液分別調(diào)整農(nóng)桿菌菌液終濃度OD600為0.6、0.7 與0.8，保持其他條件一致，加入AS（按體積比AS∶菌液=1∶500）搖勻，黑暗靜置1~3 h后侵染葉片。選取預(yù)培養(yǎng)后形態(tài)完整且長(zhǎng)勢(shì)良好葉片置于侵染液中分別侵染10、12、14 min，侵染過(guò)程中不斷搖晃使葉片與菌液充分接觸，侵染后將葉片置于無(wú)菌濾紙上吸干多余菌液。40 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)愈傷組織數(shù)量，探究遺傳轉(zhuǎn)化最適宜侵染時(shí)間。

為初步篩選遺傳轉(zhuǎn)化4個(gè)參數(shù)最佳條件，設(shè)置預(yù)培養(yǎng)2、3 d，共培養(yǎng)2、3、4 d，侵染液濃度OD600=0.6、0.7、0.8，侵染時(shí)間10、12、14 min，4個(gè)參數(shù)不同條件共54 個(gè)排列組合；根據(jù)初步篩選結(jié)果調(diào)整預(yù)培養(yǎng)和侵染時(shí)間設(shè)置后3組試驗(yàn)；最終得出遺傳轉(zhuǎn)化效率較高的參數(shù)組合。

1.2.4 四季秋海棠葉片各培養(yǎng)階段

①共培養(yǎng)

將侵染后葉片外植體背面向下整齊接種于共培養(yǎng)基MS3 中暗培養(yǎng)，保持其他條件一致，共培養(yǎng)時(shí)間分別為2、3與4 d。60 d后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生抗性再生植株數(shù)量，探究遺傳轉(zhuǎn)化最適宜共培養(yǎng)時(shí)間。

②過(guò)渡培養(yǎng)

選擇共培養(yǎng)后生長(zhǎng)較好葉片外植體轉(zhuǎn)移至過(guò)渡培養(yǎng)基MS4中，于23~25 ℃光照培養(yǎng)箱中弱光培養(yǎng)7 d。

③篩選培養(yǎng)

選擇過(guò)渡培養(yǎng)后生長(zhǎng)較好葉片外植體轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基MS5 中，誘導(dǎo)愈傷組織大量分化出芽。弱光培養(yǎng)每15~20 d繼代一次。

④生根培養(yǎng)

30~35 d 后選擇篩選培養(yǎng)基中長(zhǎng)至一定大小且生長(zhǎng)狀態(tài)良好不定芽切下，轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基MS6中，10~15 d可誘導(dǎo)生根。

⑤煉苗移栽

當(dāng)生根培養(yǎng)基中再生植株生根達(dá)到一定數(shù)目時(shí)，將植株移栽至基質(zhì)（蛭石∶泥炭土=1∶3）中，于溫度23~25 ℃、光照強(qiáng)度10 000 lx光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待植株生長(zhǎng)健壯后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

使用十六烷基三甲基溴化銨法（來(lái)自華大基因）提取再生植株葉片DNA，設(shè)計(jì)引物作PCR 檢測(cè)。BsRbohD基因（基因登錄號(hào)MH784503）鑒定引物：BsRbohD-F1：5'CCAGCAGAACACCCCCATC3'，BsRbohD-R1：5'CCCAATACACTCGCCGAAC3'（即載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbo?hD-R，擴(kuò)增長(zhǎng)度為799 bp）。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：模板（DNA）1 μL，1×T3 Super PCR Mix 22 μL，上下游引物各1 μL。PCR 擴(kuò)增程序（35 個(gè)循環(huán)）：98 ℃2 min 預(yù)變性，98 ℃10 s 變性，60 ℃10 s 退火，72 ℃10 s 延伸，72 ℃2 min 延伸，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

使用十六烷基三甲基溴化銨法（來(lái)自華大基因）提取野生型和轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOROIVD，RTQ-202P）提供方法獲得各株系cDNA，并以此為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行半定量PCR 檢測(cè)。四季秋海棠內(nèi)參基因Bs18S（基因登陸號(hào)No．KJ959633）引物：Bs18S-F：5'GCTACCAC ATCCAAGGAAGG3'，Bs18S-R：5'CAATGGATCCT CGTTAAGGG3'；BsRbohD基因半定量引物、PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序同DNA水平檢測(cè)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用上段所述模板、內(nèi)參，以野生型四季秋海棠中BsRbohD基因相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照，根據(jù)熒光定量試劑盒（TOROIVD，QST-100P）提供方法檢測(cè)野生型和轉(zhuǎn)基因各株系中BsRbohD基因相對(duì)表達(dá)量。BsRbohD基因定量引物：BsRbohD-F2：5'AA TGAACGAGGTGGCTGAGA3'，BsRbohD-R2：5' T CCTTTTGTACACTTGGCGC3'。PCR反應(yīng)程序（45個(gè)循環(huán)）：50 ℃2 min 反應(yīng)，95 ℃1 min 預(yù)變性，95 ℃10 s 變性，60 ℃30 s 退火。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 pCanG-EGFP轉(zhuǎn)化四季秋海棠

采用pCanG-EGFP 載體代替重組質(zhì)粒pCanGEGFP-BsRbohD，參照上述遺傳轉(zhuǎn)化方法將pCanGEGFP 空載轉(zhuǎn)化四季秋海棠，根據(jù)EGFP基因序列設(shè)計(jì)引物作PCR檢測(cè)，引物序列為：EGFP-F：5'A TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT3'，EGFP-R：5'G GATCCATCGATTTCGAACCCGGGG 3'（擴(kuò)增長(zhǎng)度為747 bp）。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選抗生素Kan與抑菌劑Carb濃度確定

在含有一定濃度Kan的MS1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一段時(shí)間后外植體褐化死亡（見(jiàn)圖1）。將外植體分別接種于梯度濃度Kan的MS1培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，不同濃度Kan 對(duì)葉片分化的影響見(jiàn)表1，四季秋海棠葉片對(duì)濃度15 mg·L-1以下Kan有一定適應(yīng)能力，Kan濃度為15 mg·L-1時(shí)，愈傷組織分化率為16.7%，隨Kan濃度增加，濃度25 mg·L-1及以上Kan不誘導(dǎo)愈傷組織不定芽分化，因此，25 mg·L-1Kan 作為抗性愈傷組織篩選最適濃度。

圖1 卡那霉素對(duì)外植體生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of kanamycin on the growth of explants

Carb 在共培養(yǎng)后篩選培養(yǎng)中發(fā)揮抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的作用，同時(shí)，適宜濃度Carb 對(duì)受體細(xì)胞具有一定生物效應(yīng)，Carb 分解產(chǎn)物是生長(zhǎng)素和萘乙酸，可促進(jìn)愈傷組織增殖。本研究中Carb 濃度選擇400 mg·L-1[15]，且經(jīng)后期試驗(yàn)可知，400 mg·L-1Carb 濃度抑菌效果較好且無(wú)害于愈傷組織誘導(dǎo)生根。

2.2 四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系條件篩選

54組不同遺傳轉(zhuǎn)化條件組合結(jié)果表明（見(jiàn)表2），預(yù)培養(yǎng)2 d，共培養(yǎng)4 d，侵染液濃度OD600=0.7，侵染時(shí)間為10 min 時(shí)，可獲得成苗數(shù)為18，陽(yáng)性率為11.1%。當(dāng)預(yù)培養(yǎng)與侵染時(shí)間較長(zhǎng)分別為3 d 與12、14 min時(shí)，陽(yáng)性率均為0。為進(jìn)一步提升遺傳轉(zhuǎn)化效率，在組合22 基礎(chǔ)上縮短預(yù)培養(yǎng)和侵染時(shí)間設(shè)置后3組試驗(yàn)。由表2可知，預(yù)培養(yǎng)1 d，共培養(yǎng)4 d，侵染濃度OD600=0.7，侵染時(shí)間為8 min時(shí)，成苗數(shù)為17，陽(yáng)性率較高為58.8%。從葉片外植體初代培養(yǎng)到誘導(dǎo)愈傷組織需30 d，繼代培養(yǎng)15~20 d后愈傷組織分化產(chǎn)生大量不定芽，將不定芽移至生根培養(yǎng)基后需10 d生根，待2周后生根數(shù)量達(dá)到一定程度即可移栽培養(yǎng)（見(jiàn)圖2）。

表2 遺傳轉(zhuǎn)化體系不同條件組合篩選Table 2 Combination screening of genetic transformation system under different conditions

圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程Fig.2 Agrobacterium-mediated genetic transformation process of B.semperflorens

2.3 轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中獲得的兩批攜帶Kan抗性再生植株及野生型植株分別提取葉片DNA，以BsRbohD基因鑒定引物（即載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbohD-R）作PCR 擴(kuò)增檢測(cè)，其中第一批共檢測(cè)再生植株18 株，第二批共檢測(cè)再生植株17株。轉(zhuǎn)基因植株共有12株擴(kuò)增出與陽(yáng)性質(zhì)粒一致的條帶，非轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株均未擴(kuò)增出條帶（見(jiàn)圖3）。將PCR擴(kuò)增條帶正確產(chǎn)物送至河南尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，序列比對(duì)正確，表明目的基因BsRbohD已整合至四季秋海棠基因組。

圖3 轉(zhuǎn)BsRbohD基因四季秋海棠幼苗DNA分子水平鑒定Fig.3 DNA molecular level identification of B.semperflorens seedlings with BsRbohD gene

為進(jìn)一步檢測(cè)目的基因BsRbohD在四季秋海棠轉(zhuǎn)化植株中是否轉(zhuǎn)錄，對(duì)上述兩批轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株與野生型植株作半定量PCR 分析。內(nèi)參基因Bs18S在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株與野生型植株中均表達(dá)，而使用特異性引物（載體一端引物pCanG-F和目的基因一端引物BsRbohD-R）檢測(cè)時(shí)，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株均擴(kuò)增出亮度不一的目標(biāo)條帶，野生型植株均未擴(kuò)增出條帶（見(jiàn)圖4）。表明目的基因BsRbohD在四季秋海棠轉(zhuǎn)化植株中轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)基因四季秋海棠BsRbohD半定量PCR檢測(cè)Fig.4 Semi-quantitative PCR detection of BsRbohD in transgenic B.semperflorens

以野生型植株基因表達(dá)水平為對(duì)照，將12 株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株與野生型植株作實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株BsRbohD基因表達(dá)水平均高于野生型植株，為野生型植株5.38~57.74 倍（見(jiàn)圖5）。表明BsRbohD基因已轉(zhuǎn)入四季秋海棠并穩(wěn)定表達(dá)，可用于后續(xù)試驗(yàn)。至此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系已成功建立。

圖5 轉(zhuǎn)基因四季秋海棠BsRbohD熒光定量PCR檢測(cè)Fig.5 Fluorescence quantitative PCR detection of BsRbohD in transgenic B.semperflorens

2.4 轉(zhuǎn)pCanG-EGFP空載體植株獲得

為排除載體對(duì)受體植物正常生命活動(dòng)的影響，驗(yàn)證穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系、檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率并創(chuàng)建多種植物材料資源以利后續(xù)研究，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)將pCanG-EGFP 空載體轉(zhuǎn)化四季秋海棠，經(jīng)歷預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、過(guò)渡培養(yǎng)、篩選生根和煉苗移栽等過(guò)程獲得再生植株。以再生植株葉片總DNA 為模板，以EGFP-F/R為引物作PCR擴(kuò)增檢測(cè)，可擴(kuò)增出相應(yīng)片段8株，表明此pCanG-EGFP空載體已成功轉(zhuǎn)入四季秋海棠基因組（見(jiàn)圖6）。

圖6 轉(zhuǎn)pCanG-EGFP四季秋海棠幼苗DNA分子水平鑒定Fig.6 DNA molecular level identification of B.semperflorens seedlings transferred to pCanG-EGFP

3 討 論

秋海棠屬植物遺傳轉(zhuǎn)化受多種因素聯(lián)合制約，影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化效率因素主要包含以下方面：無(wú)菌苗狀態(tài)、外植體類型、抗生素類型及配比、侵染液濃度及侵染、預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)時(shí)間等。

選擇合適外植體用于基因轉(zhuǎn)化是成功建立遺傳轉(zhuǎn)化體系前提，合適外植體需穩(wěn)定高效的再生能力。不同植物品種、組織、器官之間分化能力具有較大差異，通常需選擇處于生長(zhǎng)初期或盛期植株幼嫩部位，此時(shí)外植體處于分裂旺盛期，再生能力強(qiáng)，更易于外源基因轉(zhuǎn)化及再生植株培養(yǎng)[16]。秋海棠屬植物離體和再生培養(yǎng)相對(duì)容易，目前用于其轉(zhuǎn)化的受體體系有葉片、葉柄、芽尖、花梗、花瓣、花粉及嫩莖等。四季秋海棠主要以葉片為外植體，也有用莖段[17]。Aswathy 等研究表明，馬拉巴爾秋海棠葉片外植體較莖段外植體愈傷組織產(chǎn)量更為顯著[6]；陳英轉(zhuǎn)等研究表明，以盾葉秋海棠葉片作為外植體建立高效繁育離體再生體系，再生植株移栽成活率可達(dá)90.63%以上[18]；Hirutani 等以四季秋海棠葉片為外植體成功實(shí)現(xiàn)植株再生與遺傳轉(zhuǎn)化[19]。從植物細(xì)胞全能性看，無(wú)論選取植物體哪一部分作為外植體均可誘導(dǎo)出完整植株，但誘導(dǎo)效果不同[20]。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，最終選擇葉片作為誘導(dǎo)再生植株外植體。因四季秋海棠含水量較大，在菌液侵染過(guò)程中較易失水萎蔫，此時(shí)生長(zhǎng)狀態(tài)良好葉片外植體抵抗力相對(duì)較強(qiáng)，經(jīng)侵染等過(guò)程后存活率更高。

在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，需兩種類型抗生素，分別作為抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抑菌劑和篩選轉(zhuǎn)化體的篩選劑，抗生素種類選擇和配比是遺傳轉(zhuǎn)化體系建立關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究中抑菌劑選擇400 mg·L-1Carb，且經(jīng)后期試驗(yàn)可知其抑菌效果較好且無(wú)害于愈傷組織誘導(dǎo)生根。篩選劑由轉(zhuǎn)基因植株所攜帶的載體抗性決定，本試驗(yàn)選擇目前植物基因工程中最早廣泛使用的Kan，其濃度確定對(duì)抗性芽篩選發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。四季秋海棠對(duì)不同篩選劑敏感性具有差異，課題組前期遺傳轉(zhuǎn)化選用的載體抗性是潮霉素（Hygromycin，Hyg），是一種較強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)篩選劑，對(duì)四季秋海棠葉片產(chǎn)生高毒性，外植體在Hyg抗性篩選培養(yǎng)基上約15 d完全褐化死亡。本試驗(yàn)在更換載體后選用Kan作為篩選劑，25 mg·L-1及以上濃度Kan抑制愈傷組織不定芽分化，因此選擇25 mg·L-1作為抗生素篩選最適濃度。

預(yù)培養(yǎng)與共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)植物遺傳轉(zhuǎn)化效率具有一定影響。研究表明，預(yù)培養(yǎng)有利于外植體在切口處形成微愈傷，改變其生理生化狀態(tài)，促進(jìn)植物組織細(xì)胞結(jié)合并連接外源基因，提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化率。有部分研究認(rèn)為，一些外植體遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)無(wú)需預(yù)培養(yǎng)[22]。共培養(yǎng)為農(nóng)桿菌提供合適生存環(huán)境，增加外植體與農(nóng)桿菌接觸，促使目的基因與受體基因組整合。共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短將導(dǎo)致農(nóng)桿菌活化程度低，不利于外源基因整合；共培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致農(nóng)桿菌迅速繁殖，阻礙植物吸取養(yǎng)分從而抑菌困難或死亡[23]。本試驗(yàn)探討不同預(yù)培養(yǎng)與共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為1 d、共培養(yǎng)時(shí)間為4 d時(shí)，遺傳轉(zhuǎn)化效果優(yōu)。

農(nóng)桿菌侵染液濃度和侵染時(shí)間也是遺傳轉(zhuǎn)化體系建立關(guān)鍵因素。如侵染液濃度過(guò)低，與外植體接觸的菌液量就減少，致使轉(zhuǎn)化效率降低；侵染液濃度過(guò)高，農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)部將產(chǎn)生相互拮抗使其無(wú)法生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化。侵染時(shí)間是外植體含農(nóng)桿菌數(shù)量的關(guān)鍵因素，侵染時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致基因整合概率降低而無(wú)法獲得轉(zhuǎn)基因植株；侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體由于菌液持續(xù)侵害而失去分化能力，抑菌能力弱，降低轉(zhuǎn)化效率。在選擇農(nóng)桿菌合適制備與應(yīng)用方法的前提下，保證農(nóng)桿菌侵染效率又避免農(nóng)桿菌污染[24-25]。農(nóng)桿菌菌液OD600=0.7、侵染時(shí)間8 min為最佳轉(zhuǎn)化條件。

4 結(jié) 論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展，穩(wěn)定高效的植物再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立將克服在植物中開(kāi)展基因工程研究的主要障礙，對(duì)闡明植物觀賞性狀分子機(jī)制和應(yīng)用基因組編輯技術(shù)不可或缺。更為轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系應(yīng)用于遺傳學(xué)、基因組學(xué)與基因整合探析，將帶來(lái)植物遺傳學(xué)研究的革命。實(shí)現(xiàn)跨物種植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的標(biāo)準(zhǔn)化與精簡(jiǎn)化將成為植物分子生物學(xué)進(jìn)程推進(jìn)的關(guān)鍵[26-27]。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將四季秋海棠BsRbo?hD外源目的基因?qū)肴~片外植體，對(duì)四季秋海棠‘超奧’品種進(jìn)行一系列遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程探索。分別從預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、侵染液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間4個(gè)方面確立最佳轉(zhuǎn)化條件，通過(guò)轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定獲得12 株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株及8 株空載體植株。其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株最高陽(yáng)性率為58.8%，BsRbohD基因已轉(zhuǎn)入四季秋海棠并穩(wěn)定表達(dá)；轉(zhuǎn)空載體植株的成功獲得表明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對(duì)受體植物細(xì)胞無(wú)影響，表明該體系可用于四季秋海棠穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。未來(lái)可通過(guò)多種生物學(xué)技術(shù)確定受體材料最佳處理時(shí)期以獲得更加穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化率[28]，并借由四季秋海棠遺傳轉(zhuǎn)化體系深入構(gòu)筑BsRbohD等基因分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。