張 莉，魏祥飛，冉耀祥，姜毓君，曲 波，王春梅

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

乳腺炎是奶牛飼養(yǎng)過程中較為常見的炎癥性疾病，對世界范圍內(nèi)乳制品行業(yè)造成巨大影響[1]。病原體侵入乳腺組織，繁殖并產(chǎn)生毒素，導(dǎo)致乳房損傷[2]。革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、克雷伯氏菌等是引發(fā)奶牛乳腺炎的主要病原微生物[3]。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上主要成分，也是主要致病毒素，進(jìn)入機(jī)體后可激活細(xì)胞相關(guān)信號通路，促進(jìn)多種細(xì)胞因子特別是炎性因子表達(dá)和釋放，引起機(jī)體一系列炎癥反應(yīng)[4]。

乳脂肪、乳糖和乳蛋白是牛奶中重要營養(yǎng)物質(zhì)，是決定牛奶營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[5-8]。DNA 甲基化作為主要表觀遺傳修飾機(jī)制之一，可在不改變DNA序列情況下調(diào)控基因表達(dá)[9]。近年來，研究表明DNA 甲基化參與炎癥反應(yīng)，在奶牛乳腺發(fā)育與泌乳調(diào)控等方面扮演重要角色[10-12]。AKT作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞生長、增殖、凋亡、代謝等方面發(fā)揮重要作用。在哺乳動物細(xì)胞中，AKT共有3種亞型，分別為AKT1、AKT2和AKT3，其中僅AKT1 在妊娠期奶牛乳腺中表達(dá)上調(diào)，且在調(diào)節(jié)乳汁合成的代謝過程中發(fā)揮重要作用[13]。為探究LPS 對奶牛乳腺上皮細(xì)胞（Bovine mammary epithelial cells，BMECs）乳糖、乳脂和乳蛋白合成影響及其潛在機(jī)制，本試驗構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮炎癥細(xì)胞模型，檢測DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1 和DNMT3A 表達(dá)變化、AKT1 基因啟動子甲基化水平變化，檢測泌乳指標(biāo)，以期發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在聯(lián)系，為研究LPS對奶牛泌乳功能的影響機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：I 型膠原酶，購自美國Gibco 公司；LPS 購自美國Sigma 公司；RNA 微量提取試劑盒，購自廣州美基生物科技有限公司；AxyPrep 基因組DNA 小量制備試劑盒，購自美國Axygen 公司；EZ DNA Methylation-LightningTM Kit，購自美國ZYMO RESEARCH 公 司；PrimeScriptTMRT re?agent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus），購自日本Takara 公司；CSN2 一抗，AKT1 一抗，PAKT1一抗，均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；DNMT1、DNMT3A一抗，購自美國Cell Signal?ing Technology 公司；組織細(xì)胞甘油三脂（TG）含量酶法測定試劑盒，購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Bovine Lactose ELISA KIT，購自上海瑞番生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo，F(xiàn)isher，激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica，PCR儀，購自美國Eppendorf，酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自英國Uvitec，實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher。

1.2 方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的獲取與鑒定

本試驗選取處于泌乳期的中國荷斯坦奶牛新鮮乳腺組織，利用膠原酶消化法分離得到原代乳腺上皮細(xì)胞，向細(xì)胞中加入含10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素DMEMF12 培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃無菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)體系中含有成纖維細(xì)胞和奶牛乳腺上皮細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶底，利用兩種細(xì)胞對胰酶的敏感性和耐受性差異，使用0.25%胰酶進(jìn)行純化去除成纖維細(xì)胞。

采用免疫熒光染色法對純化后奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18（CK18）染色鑒定。將純化獲得的奶牛乳腺上皮細(xì)胞傳代至3.5 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%左右時，棄培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛室溫固定20 min 后加入封閉液（含5%BSA的PBS/T溶液）在37 ℃環(huán)境下封閉1 h，然后加入封閉液稀釋的CK18（1∶200）一抗，4 ℃孵育過夜，棄一抗，用PBS清洗細(xì)胞后，加入封閉液稀釋的FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，逐滴加入DAPI 溶液，激光共聚焦顯微鏡檢測乳腺上皮細(xì)胞CK18的特異性熒光。

1.2.2 篩選LPS刺激BMECs的最佳劑量

取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 后，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，生長良好時，用0、1、10 和100 μg·mL-1的LPS 分別處理細(xì)胞12 h，每個處理設(shè)置5個重復(fù)。棄上清，每孔加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基（含10 μL CCK-8 溶液），繼續(xù)培養(yǎng)3 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔吸光值，以細(xì)胞抑制率（IR）≤10%為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定LPS 最佳處理濃度。IR=（空白OD-模型OD）/空白OD×100%。

1.2.3 BMECs中AKT1和炎癥因子表達(dá)變化

取狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細(xì)胞接種于六孔板，待細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%~90%時，棄培養(yǎng)液，分別加入含有濃度為0、1、10 和100 μg·mL-1LPS新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h。LPS 誘導(dǎo)細(xì)胞12 h 后，按照RNA 微量提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop2000 測定提取的RNA 濃度、OD260/OD280值及OD260/OD230值，檢測后RNA 應(yīng)立刻通過PrimeScriptTMRT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TB Green?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）試劑盒說明書步驟進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序為95 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，30 s，40 個循環(huán)。根據(jù)GenBank 中牛AKT1、TNF-α、IL-1β及IL-6 的mRNA 序列，借助Primer Premier 5.0 軟件分別設(shè)計擴(kuò)增引物。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of fluorescence quantitative PCR

1.2.4 DNMT1、DNMT3A、AKT1 及P-AKT1 蛋白表達(dá)水平變化

將各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，經(jīng)預(yù)冷PBS 洗滌3 次后，向各孔內(nèi)加入200 μL RIPA 裂解液，待細(xì)胞裂解充分后將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，10 000~14 000 g 離心3~5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管，加入等量2×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min，超聲3 次，每次15 s。在10%SDS-PAGE凝膠中將蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將濕轉(zhuǎn)后硝酸纖維素膜放入TBST配制的5%脫脂乳中37 ℃搖床封閉2 h,將NC 膜 置 于 含 有DNMT1、DNMT3A、AKT1 及PAKT1特異性抗體（所用抗體均屬兔源，按照1∶1 000的比例進(jìn)行稀釋）的一抗稀釋液中，4 ℃孵育過夜。次日，TBST 洗膜3×10 min，使用HRP 標(biāo)記的山羊抗兔二抗在37 ℃環(huán)境中孵育1 h，再次用TBST漂洗NC膜，ECL化學(xué)發(fā)光液檢測目的蛋白條帶，Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.2.5 AKT1基因啟動子甲基化水平變化

使用BSP 法檢測AKT1 基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游-2 000~-1 500 bp 區(qū)域CpG 島（該CpG 島內(nèi)共有16 個CG 位點）甲基化情況。使用Axygen 基因組DNA 提取試劑盒提取細(xì)胞總DNA 并用NanoDrop 2000 測定其濃度。使用EZ DNA Methylation-Light?ningTMKit 對基因組DNA 進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。使用在線網(wǎng)站MethPrimer Home（http://www.urogene.org/）和Primer premier 5軟件設(shè)計AKT1啟動子特異性BSP引物，正向引物序列為5'GGAGTAGAGAGTA TTATTTTTGGAAGGT 3'，反向引物序列為5'ACTA CTAACAAAACCAAACAACTATC 3'。以修飾后DNA為模板，使用Taq DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為252 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃8 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃40 s，45 個 循 環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃∞。PCR產(chǎn)物采用Axygen凝膠純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物克隆到pMD18-T 載體上，并轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)涂板，陽性克隆篩選，每個樣品至少挑取10 個克隆送至吉林庫美生物科技有限公司測序。

1.2.6 LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖、甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響

采用裂解液低溫處理細(xì)胞約10 min，短暫離心后收集上清70 ℃加熱10 min，按照組織細(xì)胞甘油三酯（TG）含量酶法測定試劑盒說明書操作，檢測各組細(xì)胞甘油三酯含量。

收集細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r·min-1離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL 離心管中，按照牛乳糖ELISA檢測試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀檢測標(biāo)準(zhǔn)品和樣品OD值。利用已知標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)OD 值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中乳糖濃度。采用Western blot 方法檢測乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白含量，具體步驟同1.2.4。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prim 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析法分析組間差異。P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著，均具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

本研究中原代乳腺上皮細(xì)胞是通過酶消化法從奶牛乳腺組織中獲取。成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞對胰酶敏感性存在差異，利用這一特點實現(xiàn)兩者分離，達(dá)到純化細(xì)胞目的。純化的奶牛乳腺上皮細(xì)胞呈橢圓形，排列較為緊密。角蛋白18 是乳腺上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，采用免疫熒光染色法檢測角蛋白18 表達(dá)，檢測結(jié)果如圖1 所示，細(xì)胞核被DAPI 染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)中綠色絲狀物質(zhì)為CK-18，圖像融合后可觀察到藍(lán)染的細(xì)胞核位于呈現(xiàn)綠色熒光的胞質(zhì)中，據(jù)此確定純化得到的細(xì)胞為奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞角蛋白18鑒定Fig.1 Identification of keratin 18 in bovine mammary epithelial cells

2.2 LPS刺激BMECs的最佳質(zhì)量濃度

設(shè)置3 組不同濃度LPS 分別處理BMECs 12 h，結(jié)果如圖2A 所示，隨濃度增加，LPS 對細(xì)胞活性抑制作用也逐漸增加，具有劑量依賴性。1 μg·mL-1LPS 抑制率為3.52%，10 μg·mL-1LPS 抑制率為9.71%，因此，按照細(xì)胞抑制率（IR）≤10%判定標(biāo)準(zhǔn)，選擇10 μg·mL-1作為誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生的最佳質(zhì)量濃度。

圖2 LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的影響Fig.2 Effects of LPS on mammary Epithelial Cells in Dairy Cows

2.3 炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達(dá)

為驗證LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞炎癥模型可靠性，采用RT-qPCR 法檢測奶牛乳腺上皮細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA 含量，由圖2B可知，1、10 和100 μg·mL-1LPS 處理組細(xì)胞中IL-1β、IL-6 和TNF-α的mRNA 含量均極顯著高于空白對照組（P<0.01），且10 μg·mL-1LPS 刺激條件下上述3種炎癥因子表達(dá)量均略高于其他處理組，表明LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外炎癥模型構(gòu)建成功，后續(xù)試驗均采用10 μg·mL-1LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥細(xì)胞模型。

2.4 BMECs中甘油三酯合成變化

采用10 μg·mL-1LPS 誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外炎癥模型后，根據(jù)組織細(xì)胞甘油三脂酶法測定LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯合成的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，在LPS 刺激12 h 后，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯含量極顯著降低（P<0.01）（見圖3A）。

圖3 LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能的影響Fig.3 Effects of LPS on lactation function of mammary epithelial cells in dairy cows

表明LPS 極顯著抑制BMECs 中甘油三酯合成，可能進(jìn)一步降低乳汁中乳脂含量。

2.5 BMECs中乳糖合成變化

采用牛乳糖檢測試劑盒檢測LPS刺激對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳糖合成的影響。結(jié)果表明，與空白對照組相比，炎癥模型組中乳糖含量極顯著降低（P<0.01，見圖3B）。表明LPS 對BMECs 中乳糖合成和分泌具有極顯著抑制作用。

2.6 BMECs中β-酪蛋白合成變化

采用Western blot 檢測LPS 刺激對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白合成的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，LPS處理的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白表達(dá)量極顯著下降（P<0.01，見圖3C和D）。表明LPS 抑制β-酪蛋白合成，并可能進(jìn)一步降低乳蛋白含量。

2.7 AKT1基因表達(dá)變化及P-AKT1蛋白含量檢測

采用熒光定量PCR 檢測LPS 對AKT1 mRNA 表達(dá)的影響，采用Western blot 檢測LPS 對AKT1 和P-AKT1 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果見圖4，LPS 處理組中AKT1 mRNA 表達(dá)量極顯著低于空白對照組（P<0.01），AKT1 和P-AKT1 蛋白表達(dá)量均極顯著低于空白對照組（P<0.01）。結(jié)果提示，LPS 抑制AKT1基因表達(dá)，且抑制AKT1蛋白激活。

圖4 LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中AKT1基因表達(dá)及AKT1蛋白磷酸化的影響Fig.4 Effects of LPS on AKT1 gene expression and AKT1 protein phosphorylation in mammary epithelial cells of dairy cows

2.8 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3A表達(dá)量檢測

采用Western blot 檢測LPS 對BMECs 中DNMT1和DNMT3A 表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，LPS 處理組DNMT1 和DNMT3A 蛋白表達(dá)極顯著上升（P<0.01，見圖5）。上述結(jié)果提示，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)顯著上調(diào)可能導(dǎo)致部分泌乳相關(guān)基因甲基化水平升高，進(jìn)一步抑制其表達(dá)。

圖5 LPS對奶牛乳腺上皮中DNMT1和DNMT3A蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of LPS on DNMT1 and DNMT3A protein expression in mammary epithelial cells of dairy cows

2.9 AKT1基因啟動子甲基化水平檢測

收集LPS誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞樣品，提取細(xì)胞全基因組DNA，通過BSP方法檢測AKT1啟動子甲基化水平。根據(jù)AKT1基因啟動子區(qū)CpG島位置設(shè)計BSP引物，以亞硫酸氫鹽修飾后基因組DNA為模板，使用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增后產(chǎn)物長度為252 bp，包含16個CG位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、DNA膠回收、連接及轉(zhuǎn)化后，挑取陽性單克隆菌落送至生物公司測序。電泳檢測結(jié)果見圖6A，目的條帶大小與實際相符，表明該BSP引物有效擴(kuò)增出目的基因片段。甲基化水平檢測結(jié)果見圖6B和C，與空白對照組相比，LPS誘導(dǎo)奶牛乳腺上皮細(xì)胞12 h后，AKT1基因啟動子甲基化水平極顯著升高（P<0.01），上升至18.75%，表明BMECs發(fā)生炎癥反應(yīng)后，AKT1表達(dá)受甲基化調(diào)節(jié)，AKT1啟動子甲基化水平受LPS作用影響。

圖6 LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中AKT1基因啟動子甲基化水平的影響Fig.6 Effects of LPS on methylation level of AKT1 gene promoter in mammary epithelial cells of dairy cows

3 討 論

在乳腺炎發(fā)生過程中，炎癥部位細(xì)胞短時間內(nèi)產(chǎn)生大量炎癥因子，Wu 等發(fā)現(xiàn)LPS 刺激奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，促進(jìn)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎性細(xì)胞因子分泌[2]。因此炎癥因子表達(dá)量增加作為乳腺炎發(fā)生重要特征之一，可衡量乳腺炎癥模型構(gòu)建是否成功。本研究在LPS 刺激BMECs 后通過對細(xì)胞活性、炎癥因子表達(dá)及泌乳指標(biāo)檢測驗證，成功構(gòu)建奶牛乳腺上皮炎癥細(xì)胞模型，為進(jìn)一步探究乳腺炎致病機(jī)制和治療靶點提供一個良好平臺。

研究發(fā)現(xiàn)，LPS 在誘導(dǎo)BMECs 炎癥反應(yīng)同時還抑制BMECs 增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[14-16]。眾所周知，AKT1 基因在調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞存活及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用，Lin等研究顯示當(dāng)沉默AKT1基因表達(dá)時，奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力和增殖活性均顯著降低[13]。Che 等研究報道AKT1 基因激活促進(jìn)小鼠B 細(xì)胞增殖和分化[17]。在小鼠C2 成肌細(xì)胞中，沉默AKT1 基因表達(dá)顯著降低細(xì)胞周期蛋白A含量，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯，表明AKT1 可通過調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程影響細(xì)胞增殖[18]。本研究通過CCK8 法檢測細(xì)胞增殖活性，通過RT-qPCR 檢測AKT1 mRNA 水平表達(dá)，Western blot 檢測AKT1 和P-AKT1 蛋白水平表達(dá)，結(jié)果表明經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞增殖活性受抑制，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中AKT1 mRNA、AKT1及P-AKT1蛋白表達(dá)均極顯著降低，該結(jié)果提示LPS對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖活性的抑制作用可能是通過AKT1 基因介導(dǎo)。

牛奶中乳蛋白、乳脂和乳糖含量是評價乳品質(zhì)主要指標(biāo)，其合成受諸多因素影響[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在10 μg·mL-1LPS處理12 h條件下，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂、乳糖、乳蛋白含量均顯著降低。關(guān)于LPS所致奶牛泌乳功能降低的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及DNA 甲基化等方面內(nèi)容鮮有報道。已證實AKT1促進(jìn)乳糖、乳脂和乳蛋白合成和分泌，在奶牛泌乳調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13,21-22]。實驗室前期工作也發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)和低產(chǎn)奶牛乳腺組織中AKT1基因啟動子甲基化水平存在顯著差異，確定AKT1啟動子甲基化水平與乳成分合成呈負(fù)相關(guān)[23]。因此，本研究檢測奶牛乳腺上皮炎癥細(xì)胞模型中DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)變化和泌乳相關(guān)基因AKT1啟動子甲基化水平變化，以期探究乳腺炎條件下DNA 甲基化在奶牛泌乳調(diào)控中的角色。

DNA 甲基化是由DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）催化的一種表觀遺傳修飾方式，與多種疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)[24-25]。哺乳動物中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶主要包括DNMT1、DNMT3A 和DNMT3B，其中DMNT1 主要參與維持甲基化狀態(tài)，DNMT3A 和DNMT3B 主要負(fù)責(zé)從頭甲基化。Ma 等研究發(fā)現(xiàn)LPS 處理后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞DNMT1 表達(dá)顯著增加[26]。Yang等研究表明，LPS誘導(dǎo)豬肺泡巨噬細(xì)胞（AMs）12 h，DNMT3A 基因表達(dá)增加[27]。Koval?chuk 等發(fā)現(xiàn)，小鼠連續(xù)2周飲用含LPS的水，顯著上調(diào)脾臟中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和MeCP2蛋白表達(dá)水平[28]。上述研究結(jié)果表明經(jīng)LPS 處理后，在多種不同類型細(xì)胞中均可檢測到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)升高，具有普遍性。本研究檢測BMECs 中DNMT1和DNMT3A 表達(dá)情況，結(jié)果表明LPS 誘導(dǎo)后，DNMT1 和DNMT3A 表達(dá)量也顯著增加。另外，AKT1 基因啟動子甲基化水平升高，AKT1 基因表達(dá)和P-AKT1 蛋白表達(dá)均降低，乳脂、乳糖和乳蛋白合成減少，表明DNA 甲基化參與乳腺炎條件下奶牛泌乳調(diào)控，且LPS也可通過增加DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1 和DNMT3A 表達(dá)提高AKT1 基因甲基化水平，抑制AKT1 基因表達(dá)，并影響AKT1蛋白磷酸化水平，抑制乳成分合成，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。本研究為LPS對奶牛泌乳功能的影響機(jī)制研究提供新思路和研究方向。

4 結(jié) 論

綜上，DNA 甲基化參與LPS 誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中泌乳功能調(diào)控，LPS也可通過增加泌乳關(guān)鍵基因AKT1甲基化水平抑制其表達(dá)，導(dǎo)致奶牛乳腺上皮細(xì)胞泌乳功能降低。