李春梅，高艷宇，李慧

黑龍江省醫(yī)院口腔科，黑龍江哈爾濱 150001

乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoli?ated deciduous teeth，SHEDs）是一種外胚層來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，除了具有多向分化潛能及低免疫原性外，還表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖能力和成骨分化效率，在骨組織工程領(lǐng)域中備受青睞[1-3]。骨碎補(bǔ)總黃酮（total flavone of rhizoma drynariae，RDTF）是從百合科植物黃精中提取到的一種活性成分，可以從阻礙破骨細(xì)胞產(chǎn)生和促進(jìn)新骨形成兩方面增進(jìn)骨骼健康[4-5]。關(guān)于RDTF對(duì)SHEDs的功能調(diào)控作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究不同濃度RDTF對(duì)SHEDs增殖和成骨分化潛力的影響，2020年3月—2021年8月黑龍江省醫(yī)院檢驗(yàn)科初步篩選出適宜濃度的RDTF，為實(shí)現(xiàn)SHEDs在骨缺損修復(fù)的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

抗壞血酸（北京索萊寶），RDTF（西安楊凌慈緣）、CCK-8試劑盒、堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（上海碧云天），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hy?Clone，美國(guó)）

1.2 方法

1.2.1 SHEDs的分離與培養(yǎng) 本研究經(jīng)患者及家屬知情同意，收集口腔科因乳牙滯留而拔除的乳牙樣本，要求牙齒無(wú)明顯病變，牙根吸收小于1/2。4 h內(nèi)在無(wú)菌條件下劈開(kāi)牙齒，取出牙髓，用含2%青-鏈霉素雙抗的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered so?lution，PBS）反復(fù)沖洗并充分剪碎，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，用胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的3~5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SHEDs的鑒定 SHEDs消化重懸，取細(xì)胞懸液以1×106個(gè)/管加入待測(cè)樣本管中。使用人間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cells, MSC)表面標(biāo)記檢測(cè)試劑盒對(duì)SHEDs進(jìn)行鑒定，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.3 鈣鈷法染色 將SHEDs以1×105個(gè)/孔到接種到6孔板上，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液為溶劑，配置0、12.5、25、50 mg/L RDTF的培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)共分為4組，（0時(shí)段為對(duì)照組，24、48、72 h組）每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)7 d后進(jìn)行檢測(cè)。雙蒸水潤(rùn)洗，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)分組及成骨誘導(dǎo)步驟同1.2.3。分別加入骨轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcrip?tion factor 2, Runx2)、骨鈣素(osteocalcin, OCN）和β-ac?tin一抗（按1∶2 000稀釋），4℃孵育過(guò)夜，PBS清洗，加二抗（按1∶10 000稀釋），室溫孵育1 h，PBS清洗，用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察顯影，Image J軟件分析灰度值。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計(jì)分析堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以（）表示，采用t檢驗(yàn)；多重比較方差齊性時(shí)用各研究組分別與對(duì)照組進(jìn)行兩兩比較，采用Dunnett-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)采用Dunnett-T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHEDs分離培養(yǎng)情況

成功分離培養(yǎng)SHEDs。鏡下觀察，大部分原代細(xì)胞在培養(yǎng)第3天貼壁生長(zhǎng)，第7天可見(jiàn)克隆細(xì)胞團(tuán)形成，細(xì)胞呈集落狀生長(zhǎng)，胞體短小呈梭形，胞核較大呈圓形，第10天后細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到一定融合度。進(jìn)行傳代培養(yǎng)后，第一代細(xì)胞迅速增殖，密度增大，形態(tài)以紡錘形和長(zhǎng)梭形為主，呈旋渦狀生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1。

圖1 SHEDs的培養(yǎng)（×100）

2.2 SHEDs的鑒定結(jié)果

SHEDs擴(kuò)增培養(yǎng)至第3代，流式細(xì)胞儀對(duì)其表面抗原物質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示，間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD73、CD90及CD105表達(dá)率高于99%，造血干細(xì)胞及單核細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD19、CD45、CD11b及HLA-DR總體表達(dá)率低于1%（圖2A）。成骨誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色后可見(jiàn)細(xì)胞間橙紅色礦化結(jié)節(jié)（圖2B）。

圖2 SHEDs的鑒定

2.3 RDTF對(duì)SHEDs ALP染色及ALP活性的影響

以含有12.5、25、50 mg/L RDTF的為研究組，以不含RDTF的為對(duì)照組在細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的第7天，鈣鈷法檢測(cè)ALP染色結(jié)果顯示：各組在鏡下能觀察到黑棕色的染色結(jié)節(jié)，與對(duì)照組相比，25 mg/L RDTF組形成的染色結(jié)節(jié)數(shù)目最多，面積最大，其次是12.5 mg/L RDTF組（圖3）。

圖3 不同濃度RDTF對(duì)SHEDs ALP染色結(jié)果

成骨誘導(dǎo)7 d后，ALP 活性定量檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，12.5、25 mg/L RDTF 組 ALP 活性均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中25 mg/L RDTF 組ALP值的提升更為顯著，見(jiàn)表1。

表1 RDTF對(duì)SHED ALP 活性的影響()

表1 RDTF對(duì)SHED ALP 活性的影響()

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

組別對(duì)照組（n=3）12.5 mg/LRDTF 組（n=3）25 mg/L RDTF 組（n=3）50 mg/L RDTF 組（n=3）F值P值7 d ALP 表達(dá)量254.896±4.573（308.756±10.369）*（332.313±7.373）*249.660±14.061 52.038<0.001

3 討論

在探討SHEDs成骨分化的研究中，首先要驗(yàn)證RDTF對(duì)SHEDs生長(zhǎng)狀況的影響。因此，本研究采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示各組光密度（optical density, OD）值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示一定濃度范圍內(nèi)的RDTF對(duì)SHEDs的增殖能力無(wú)顯著影響，這與龐真貞等[6]，杜志豪等[7]學(xué)者的研究結(jié)果，OD值在第6天達(dá)到高峰值(OD值=0,43)一致。因此確定設(shè)置此干預(yù)濃度范圍，進(jìn)行后續(xù)成骨實(shí)驗(yàn)的研究。ALP作為成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志物之一，有學(xué)者報(bào)道代表著細(xì)胞外基質(zhì)的成熟程度（ALP=3.324 mmol/L）[8]。它在一定程度上可以反映出細(xì)胞的成骨分化能力，其活性升高則代表骨礦化過(guò)程處于活躍階段。龐真貞等[6]研究報(bào)道Runx2是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞成骨分化的早期階段起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，PCR結(jié)果顯示Runx2表達(dá)最高為25 mmol/L[9]。Runx2的表達(dá)標(biāo)志著成骨細(xì)胞開(kāi)始分化，目前已被證實(shí)可以誘導(dǎo)成骨相關(guān)基因OCN的表達(dá)。Moghadam FH等[10]報(bào)道OCN是成骨細(xì)胞向新骨形成過(guò)程的特異性指標(biāo)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入成骨分化晚期即礦化期，PCR結(jié)果顯示OCN為40 mmol/L其表達(dá)到達(dá)高峰(2.332 mmol/L)。OCN主要由成骨細(xì)胞合成分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，不僅起到結(jié)構(gòu)支撐作用，還在骨鈣代謝過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用，加速基質(zhì)礦化。本研究從蛋白水平對(duì)SHEDs早期及晚期的成骨分化能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在成骨誘導(dǎo)14 d后，12.5、25 mg/L RDTF組均能上調(diào)Runx2及OCN的蛋白表達(dá)，其中25 mg/L RDTF組的Runx2及OCN蛋白表達(dá)水平（332.313±7.373）呈顯著上調(diào)趨勢(shì)，這與Huang Y等[11]研究的RDTF對(duì)恒牙牙髓干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用（濃度為50 mg/L表達(dá)123·213 mg/mmol）不一致，本研究作用更明顯，這可能是乳牙牙髓干細(xì)胞活性更強(qiáng)的原因。ALP 作為成骨細(xì)胞分化早期的標(biāo)志物之一，代表著細(xì)胞外基質(zhì)的成熟程度。骨形成的關(guān)鍵在于羥基磷灰石的沉積，其過(guò)程不僅有游離磷酸的參與，同時(shí)又受到焦磷酸鹽抑制局部礦化能力的影響[12]。本研究在早期對(duì)ALP活性進(jìn)行了定量檢測(cè)，結(jié)果顯示：12.5和25 mg/L PSP組的ALP的表達(dá)均顯著提升(P<0.05)。而較高濃度（50 mg/L）PSP組與對(duì)照組相比，其ALP活性未見(jiàn)明顯升高。鈣鈷法染色的ALP定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也印證了這一結(jié)論，這與Zhai Q等[13]研究報(bào)道的對(duì)牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果相吻合（結(jié)果為16.231 mg/mmol）。Runx2是成骨分化中最早必不可少的特異性標(biāo)志基因，其表達(dá)標(biāo)志著SHEDs開(kāi)始向成骨細(xì)胞分化和成熟[14]。研究結(jié)果表明，一定濃度的PSP對(duì)SHEDs的成骨分化具有促進(jìn)作用，這與Peng X等[15]研究的其他中藥作用并不一致（結(jié)果為11.4 mg/L），可能是因?yàn)樗幚碜饔貌煌鴮?dǎo)致。體內(nèi)研究還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，骨碎補(bǔ)總黃酮對(duì)乳牙牙髓干細(xì)胞增殖及成骨向分化有增強(qiáng)作用，可為乳牙牙髓干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)，為臨床應(yīng)用提供參考。