李明，劉景亮，申倩，李曉峰，張強

1.山東省公共衛(wèi)生臨床中心胸外科，山東濟南 250000；2.山東省公共衛(wèi)生臨床中心病理科，山東濟南 250000；3.山東省公共衛(wèi)生臨床中心骨科，山東濟南 250000

肺癌是目前全球最常見和致死率最高的惡性腫瘤。肺癌在我國男性中是發(fā)病第一位的癌癥，非小細胞肺癌是肺癌中最為常見的類型，占所有肺癌病例的85%~90%。抑制與預防非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移的研究具有重要意義[1-2]。相關研究內(nèi)容顯示，紡錘體與著絲粒相關蛋白3（spindle and kinetochoreassociated protein 3，SKA3）對動粒-微管之間的相互影響有直接介導作用，同時還可以進行細胞增殖以及細胞凋亡的調(diào)節(jié)[3-4]。SKA3經(jīng)過大量研究已經(jīng)被證實了可在肝癌、結腸癌、前列腺癌以及膀胱癌等病變中有高表達，影響了腫瘤的惡化和轉(zhuǎn)移[5-6]。然而，非小細胞肺癌中SKA3的詳細功能和潛在機制仍然存在很大程度的未知。本研究收集山東省公共衛(wèi)生臨床中心病理科2019年1—12月檢驗的60例非小細胞肺癌組織蠟塊標本作為研究對象，進一步驗證SKA3在非小細胞肺癌中的表達情況及其與患者預后的關系，探索SKA3在非小細胞肺癌細胞株中的生物學功能狀態(tài)。從而可以證實SKA3基因可在非小細胞肺癌等疾病的惡性生物學行為中作為一種關鍵分子標記物參與并發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，檢測SKA3可以預測患者靶點，進而為其后續(xù)治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集本院病理科檢驗的60例非小細胞肺癌組織蠟塊標本作為研究對象，其中男27例，女33例；患者年齡41~78歲，中位年齡55歲；肺腺癌38例，肺鱗癌22例，同時隨機取30例癌旁正常肺組織作為對照。

1.2 方法

選擇非小細胞肺癌細胞株A549及SK-MES-1，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒，SKA3單克隆抗體，DAB試劑盒，二抗兔SP檢測試劑盒（SP-9001）。

在高糖DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清（10%濃度）后在其中放入非小細胞肺癌細胞株，將培養(yǎng)基放置在有5%CO2以及37℃環(huán)境的濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行細菌株培養(yǎng)，隔天進行1次換液，最后獲取對數(shù)生長期細胞進行實驗操作。

采用免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）兩步法檢測SKA3在非小細胞肺癌及癌旁健康肺部組織中的表達。石蠟包埋組織標本，切片后分別使用二甲苯和梯度乙醇進行脫蠟和水化處理，通過磷酸緩沖鹽溶液對切片做常規(guī)清洗，添加適量檸檬酸抗原修復液做20 min加熱處理后對抗原進行修復，內(nèi)源性過氧化物酶的去除方法為滴加適量3%過氧化氫-甲醇，再滴加1%山羊血清進行組織封閉處理；滴加適量經(jīng)過稀釋處理的SKA3（1∶800）一抗以及AEG-1（1∶400）一抗，在4℃溫度下孵育一晚，第2天滴加適量二抗，在37℃環(huán)境中孵育0.5 h后應用DAB顯色劑處理，再通過蘇木素進行復染，最后在光學顯微鏡下對細胞進行觀察。

以非小細胞肺癌細胞系A549及SK-MES-1為體外研究模型，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SKA3 siRNA敲低A549及SK-MES-1中SKA3表達。對經(jīng)過轉(zhuǎn)染的兩組細胞接種至60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，對細胞變化進行定期觀察，并在肉眼可見的克隆已經(jīng)形成時完成固定染色操作，然后進行拍照和計數(shù)，對不同組別克隆形成數(shù)目、大小等指標進行對比分析。

Transwell侵襲實驗檢測敲低SKA3后對非小細胞肺癌細胞侵襲能力的影響。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SKA3 siRNA敲低非小細胞肺癌細胞株A549及SK-MES-1后24 h后消化，通過無血清培養(yǎng)液進行細胞懸液制備。在transwell小室的上室加入100 μl細胞懸液，在下室添加DMEM完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)液內(nèi)含有10%胎牛血清，培養(yǎng)液添加劑量為600 μl，先在孔板背后均勻地劃橫線，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。此后進行過夜培養(yǎng)。次日使用槍頭和直尺在橫線處做垂直劃線。應用磷酸緩沖鹽溶液進行3次漂洗放置在無血清培養(yǎng)基內(nèi)，再將其整體放置在培養(yǎng)箱中進行細菌株培養(yǎng)。在開始和第24小時分別在培養(yǎng)皿中獲取適量樣本，對其樣本進行觀察并拍攝照片。

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SKA3 siRNA敲低非小細胞肺癌細胞株A549及SK-MES-1后轉(zhuǎn)染24 h，替換成無血清培養(yǎng)基，然后通過饑餓處理誘導細胞逐漸凋亡，通過Annexin V-PI完成染色后利用流式細胞檢測儀對不同組別細胞凋亡情況進行檢測分析。

1.3 觀察指標

至少需要2名病理科醫(yī)師對檢查結果進行分析和閱片，以免疫組化染色的具體判讀標準確定染色結果或陽性或陰性。

通過平板克隆試驗檢測敲低SKA3后觀察癌細胞克隆能力的變化。對不同組別克隆形成數(shù)目、大小等指標進行對比分析。

Transwell侵襲實驗過夜培養(yǎng)后細胞次日進行拍照，記錄穿膜細胞數(shù)量，對細胞侵襲能力做出評價。

通過流式細胞術檢測敲低SKA3后的非小細胞肺癌細胞株，分析其表達情況，并評價其對非小細胞肺癌細胞凋亡能力產(chǎn)生的影響。

1.4 統(tǒng)計方法

應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布，以（）表示，組間比較行t檢驗；計數(shù)資料以[n(%)]表示，組間比較行χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SKA3在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達

免疫組化染色顯示，SKA3陽性染色呈棕黃色，也可呈褐色，細胞質(zhì)內(nèi)較多，細胞核內(nèi)較少。在非小細胞肺癌組織內(nèi)SKA3陽性表達率是68.3%(41/60)，高于癌旁正常肺部組織的16.6%(5/30)，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=18.678，P<0.05）。見圖1。

圖1 SKA3在癌旁組織和非小細胞肺癌組織中的表達

2.2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA細胞株敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞增殖能力變化

平板克隆試驗顯示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA細胞株敲低SKA3表達后，觀察組癌細胞克隆數(shù)為（11±2）個，明顯少于對照組的（97±11）個，差異有統(tǒng)計學意義（t=-652.977，P<0.05）。見圖2。

圖2 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞克隆數(shù)變化

2.3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA細胞株敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞凋亡變化

流式細胞儀檢測顯示，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染干擾組細胞G1/G0期和S期細胞比率分別為（71.7±6.1）%和（20.2±2.9）%，對照組相應為（53.4±5.4）%和（31.3±4.2）%，兩者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=13.922、-14.669，P<0.05）。見圖3。

圖3 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞凋亡減少

3 討論

惡性腫瘤組織的侵襲、轉(zhuǎn)移是一項十分復雜的過程，會涉及蛋白水解酶、相關黏附分子、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）或趨化因子等多分子變化的影響。SKA1、2、3均為SKA的靶向復合物，已有研究結果證實，SKA1、2、3可組成SKA復合物，于有絲分裂中期促使紡錘體微管在動粒（kinetochore，KT）上穩(wěn)定附著，以保證順利進行有絲分裂。SKA3是位于線粒體外層的子單元SKA復合物，位于13q號染色體上，在正常染色體分離和細胞分裂過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。已有的臨床結果顯示，SKA3針對肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移期間重要分子進行靶向治療對提升肺癌臨床治療效果有重要作用。對SKA3基因的表達和肺癌癥狀體征、預后之間的相關性結果表明，SKA3基因在肺癌病變的產(chǎn)生以及病情進展中均發(fā)揮著作用[10-13]。

本研究通過對非小細胞肺癌組織免疫組化結果相關數(shù)據(jù)做分析后發(fā)現(xiàn)，SKA3在非小細胞肺癌中的表達水平相比癌旁正常肺部組織更高（68.3% vs 16.6%）（P<0.05），與林劍鵬等[14]在結腸癌的研究比較類似，該項研究結果顯示50例結腸癌組織中高表達33例（66.00%），50例正常組織中高表達6例（12.00%），結腸癌中SKA3表達高于正常組織（P<0.05）。同時增殖能力脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞克隆數(shù)明顯降低，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA敲低SKA3表達后非小細胞肺癌細胞凋亡減少，與唐建信等[15]的研究結果有一致性。本研究通過siRNA干擾技術對非小細胞肺癌細胞株內(nèi)SKA3表達進行抑制，在細胞水平探討SKA3對肺癌細胞的惡性表型的作用。本研究初次建立對SKA3表達進行干擾的肺癌細胞模型且獲得了成功，也開展了細胞克隆實驗，結果顯示對SKA3干擾表達以后可促使細胞增殖能力下降，本次研究首次創(chuàng)建了干擾SKA3表達的肺癌細胞模型，并且結果顯示成功，也通過細胞克隆實驗的開展獲得了干擾SKA3的表達，在抑制SKA3對肺癌細胞增殖能力產(chǎn)生促進作用中有良好效果的結論，說明SKA3對肺癌細胞增殖能力有促進作用。通過Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)SKA3干擾表達后肺癌細胞侵襲能力明顯減弱。通過流式細胞術發(fā)現(xiàn)SKA3干擾表達后肺癌細胞凋亡明顯減少，說明SKA3可抑制肺癌細胞凋亡。

綜上所述，肺癌組織中可有SKA3表達，其在癌細胞增殖、侵襲、克隆形成以及凋亡的惡性表型中有選擇性促進作用，分析原因可能和其對細胞周期G1期進入S期的促進能力有一定相關性。干擾SKA3可能是治療非小細胞肺癌新的治療選擇。此后也會對SKA3在癌細胞增殖中的促進作用和分子機制相關開展進一步研究，以在防治肺癌的工作中發(fā)揮作用。