馬超，曾明輝，黃玉賢，張鈺斌，邱少霞，范紅順

粵北第二人民醫(yī)院感染科，廣東韶關(guān) 512028

慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。目前，我國約有7 000萬例HBsAg攜帶者，其中CHB患者為2 000~3 000萬例[1-2]。CHB患者肝組織內(nèi)ccc-DNA的持續(xù)存在是CHB難以治愈且停藥后易復(fù)發(fā)的主要原因[3]。1984年，Miller等首次觀察到與DNA雜合的HBV-RNA；1996年，德國學(xué)者K?ck證實(shí)了慢性HBV感染者的血清中存在多聚腺苷酰（polyA）化的HBV-RNA。2016年，證實(shí)血液中HBV-RNA的主要來源為未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的HBV pgRNA。HBV-RNA作為新的病毒學(xué)指標(biāo)近年得到更多關(guān)注，2019年以來我國、歐洲及美國肝病學(xué)會均推薦其作為cccDNA存在和轉(zhuǎn)錄活性的指標(biāo)[4-6]。肝組織ccc-DNA的檢測需要肝活體組織檢查，因?yàn)槭怯袆?chuàng)檢查，推廣受限，而血清HBV-RNA水平可反映肝組織內(nèi)ccc-DNA的活性，并與患者病毒學(xué)應(yīng)答和預(yù)后有關(guān)[7-8]。

目前，PEG-IFN-α治療下血清HBV-RNA可否準(zhǔn)確反映cccDNA的水平及其轉(zhuǎn)錄活性，仍需進(jìn)一步明確。基于此，本研究以2021年1月—2022年6月粵北第二人民醫(yī)院收治的恩替卡韋口服1年以上HBV-RNA陰性的39例慢乙肝患者為研究對象，加用聚乙二醇干擾素α-2b聯(lián)合原有的恩替卡韋治療24周后，測定CHB患者的血清HBV-RNA水平，分析其與各臨床指標(biāo)的相關(guān)性，旨在為將HBVRNA作為CHB治療評估的新型病毒學(xué)指標(biāo)提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究納入本院收治的39例慢性乙型肝炎患者，平均年齡（49.1±10.7）歲；男29例，女10例；HBeAg陽性3例，HBeAg陰性36例。本研究得到醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，患者均在充分了解研究計(jì)劃后簽署了知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2019年版慢性乙型肝炎相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者已連續(xù)服用恩替卡韋（國藥準(zhǔn)字20100129）0.5 mg ，1次/d 1年以上，間隔3個(gè)月以上兩次經(jīng)羅氏Cobas試劑檢測，均證實(shí)高敏HBV-DNA<20 IU/mL；③知情同意加用聚乙二醇干擾素α-2b 180 μg或135 μg，皮下注射，1次/周，聯(lián)合原有的恩替卡韋口服，抗病毒治療24周。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①重疊甲型肝炎病毒（hepatitis A vi?rus，HAV)、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）、丁型肝炎病毒（hepatitis D virus，HDV）、戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）等其他嗜肝病毒感染；②合并有人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染；③合并有藥物性肝病、自身免疫性肝炎、原發(fā)性硬化性膽管炎等其他肝損害病因；④肝惡性腫瘤。

1.3 方法

依據(jù)HBV-RNA陰性或陽性分組。所有患者均進(jìn)行血常規(guī)、肝功能、HBV血清標(biāo)志物、HBV-RNA、肝臟彩超等檢測。高敏HBV-RNA檢測采用羅氏診斷COBAS試劑，檢測下限20 IU/mL。乙肝五項(xiàng)血清標(biāo)志物（hepatitis B virus serum markers，HBV-M），采用乙型肝炎診斷試劑盒，以化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，其中乙肝表面抗原定量（quantification of hepatitis B sur?face antigen，qHBsAg），參考值范圍為0~0.05 IU/mL，有效檢測范圍0.05~250.00 U/mL，乙肝病毒e抗原（hepa?titis B e antigen，HBeAg）參考值范圍為0~0.1 IU/mL。肝功能指標(biāo)的檢測，采用貝克曼680全自動生化分析儀。以血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine amino?transferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）作為觀察指標(biāo)。

HBV-RNA檢測采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）配套儀器為AutoSAT全自動核酸檢測分析系統(tǒng)，原理為HBV特異性RNA寡核苷酸磁珠微粒提取靶標(biāo)RNA，MMLV酶逆轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)RNA為cDNA，T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄cDNA，合成大量可檢測的RNA負(fù)鏈，用含熒光和淬滅基團(tuán)的RNA分子信標(biāo)進(jìn)行檢測。檢測過程無需DNA酶處理、并采用內(nèi)標(biāo)定量，樣本的提取、洗滌、擴(kuò)增、檢測及定量結(jié)果均由配套儀器完成。通過HBV-RNA陰性、弱陽性、強(qiáng)陽性人血清稀釋樣本建立檢測線性范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到每個(gè)樣本HBV-RNA的濃度。檢測下限50 copies/mL，線性范圍2~8 log copies/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSSAU在線統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。將HBsAg定量及HBV-RNA檢測結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。HBV-RNA與HBeAg及qHBsAg水平之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)（r）分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床資料比較

據(jù)患者血清HBV-RNA是否可檢出分為兩組，RNA陰性患者18例為A組，占比46.2%，其中HBeAg陰性18例，HBeAg陽性0例；男4例，女14例。RNA陽性患者21例為B組，占比53.8%，其中HBeAg陰性18例，HBeAg陽性3例（HBV-RNA均為陽性）；男6例，女15例。兩組臨床資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組患者臨床資料比較()

表1 兩組患者臨床資料比較()

項(xiàng)目ALT（U/L）AST（U/L）PLT（×109/L）年齡（歲）A組（n=18）32.56±14.13 29.11±10.13 170.17±48.91 52.50±12.09 B組（n=21）38.67±35.56 33.57±22.52 163.29±69.28 46.29±8.72 t值-0.724-0.775 0.362 1.859 P值0.476 0.443 0.720 0.071

2.2 兩組HBsAg定量水平比較

A組的HBsAg定量水平低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖1。

圖1 HBsAg在HBV-RNA分組中的分布箱線圖

表2 HBV-RNA陰性和陽性組HBsAg的比較[()，IU/mL]

表2 HBV-RNA陰性和陽性組HBsAg的比較[()，IU/mL]

項(xiàng)目log10（HBsAg）A組（n=18）1.29±1.30 B組（n=21）2.66±0.65 t值-4.053 P值<0.001

2.3 HBV-RNA與臨床特征相關(guān)性分析

CHB患者血清HBV-RNA可測與qHBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）呈中等程度正相關(guān)。與ALT、AST、PLT、年齡、性別等變量無相關(guān)關(guān)系，見表3。

表3 HBV-RNA與臨床特征相關(guān)性分析

2.4 CHB患者血清HBV-RNA水平的影響因素分析

分別以年齡（賦值：連續(xù)性變量）、性別（賦值：男=1，女=2）、ALT（賦值：連續(xù)性變量）、AST（賦值：連續(xù)性變量）、qHBsAg（賦值：對檢測結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換）、HBeAg定量為自變量，以血清HBV-RNA為因變量[賦值：對檢測結(jié)果進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，即log（HBV-RNA），連續(xù)性變量]，進(jìn)行多因素線性回歸分析。結(jié)果顯示，qHBsAg是CHB患者血清HBVRNA水平的影響因素（P<0.05），見表4。

表4 CHB 患者血清HBV-RNA水平的影響因素線性回歸分析結(jié)果（n=39）

3 討論

既往研究顯示：核苷酸類似物（NAs）抗病毒治療前，HBV-RNA與HBV-DNA、HBsAg、HBcrAg（乙型肝炎病毒核心抗原相關(guān)抗原）均呈正相關(guān)，HBeAg陽性患者則更明顯[9-10]。NAs抗病毒治療后與HBV-DNA和HBsAg相關(guān)性會逐漸下降甚至消失，但與HBcrAg之間始終保持較好的相關(guān)性。接受長效干擾素治療的患者，HBV-RNA與DNA、HB?crAg在治療前后均具有良好的相關(guān)性，但治療后與HBsAg的相關(guān)性明顯減弱，甚至失去相關(guān)性。

那么，同時(shí)接受NAs和長效干擾素治療的患者，HBV-RNA的特點(diǎn)及能否用來預(yù)測抗病毒治療效果或指導(dǎo)NAs停藥，這方面的資料較少，通常，選擇NAs可強(qiáng)效抑制病毒復(fù)制，促進(jìn)HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，而NAs+peg-IFN聯(lián)合治療后，可促進(jìn)HBsAg下降，治療前HBsAg低水平（<1 500 IU/mL）及治療中HB?sAg快速下降（12周或24周時(shí)HBsAg<200 IU/mL或下降>1 lg IU/mL）的患者，聯(lián)合治療后HBsAg陰轉(zhuǎn)的發(fā)生率較高[11]。

本研究納入經(jīng)過NAs抗病毒治療后，HBV DNA已轉(zhuǎn)陰，且愿意繼續(xù)加用長效干擾素的患者為研究對象，入組人群中絕大多數(shù)已實(shí)現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。通過測定HBV-RNA水平，并考察HBV-RNA與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性。本研究提示，經(jīng)過序貫聯(lián)合治療后，HBV-RNA與qHBsAg、HBeAg仍具有中等程度相關(guān)性（r=0.485、0.387，P<0.05）。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過口服核苷（酸）類似物恩替卡韋治療后，HBV-DNA和HBeAg雙轉(zhuǎn)陰的患者占比達(dá)92.3%（36/39），HBV-DNA和HBeAg雙陰性患者中卻仍有61.1%（22/36）的患者HBV-RNA仍可檢出，且3例HBeAg陽性患者HBV-RNA均為陽性。箱線圖提示HBV-RNA與HBsAg水平密切相關(guān)，表面抗原滴度低于10 IU/mL者（HBsAg<1log)，HBV-RNA檢測值均為陰性；而HBV-RNA轉(zhuǎn)陰的患者，HBsAg整體水平較低，多在2.5log以下（見圖1）。

李小鵬等[12]選取70例高敏HBV-DNA檢測均為陰性的CHB患者，發(fā)現(xiàn)58例患者血清HBV-RNA仍為陽性，達(dá)到（2.7±1.1）log copies/mL，血清HBVRNA水平與HBeAg 水平呈顯著正相關(guān)（r=0.467，P=0.01），但與qHBsAg水平無顯著相關(guān)（r=0.146，P=0.275）。本研究發(fā)現(xiàn)，qHBsAg及HBeAg均是CHB患者血清HBV-RNA水平的影響因素，CHB患者血清HBV-RNA可測與HBsAg（r=0.485，P=0.002）、HBeAg（r=0.387，P=0.015）中等程度相關(guān)，進(jìn)一步的線性回歸分析僅顯示qHBsAg為影響因素，可能與入組患者中HBeAg陽性例數(shù)較少有關(guān)，二者相關(guān)性尚待進(jìn)一步更大樣本量的研究證實(shí)。

NAs停藥后臨床復(fù)發(fā)的預(yù)測一直是關(guān)注的熱點(diǎn)?；谀壳皣鴥?nèi)外指南推薦的停藥標(biāo)準(zhǔn)[1,13-14],聯(lián)合HBV-RNA指標(biāo)可進(jìn)一步降低停藥后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。然而，研究表明即使血清HBV-RNA轉(zhuǎn)陰，也仍有部分患者存在復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，可見仍未真正達(dá)到“安全”停藥之目標(biāo)。2020年南方醫(yī)科大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合血清HBV-RNA及其他指標(biāo)可以進(jìn)一步降低停藥后臨床復(fù)發(fā)率[15]。基于既往停藥標(biāo)準(zhǔn)（HBV-DNA和HBeAg轉(zhuǎn)陰），NAs停藥后4年累積臨床復(fù)發(fā)率高達(dá)30.8%，通過聯(lián)合HBV-RNA，NAs停藥后4年累積臨床復(fù)發(fā)率降至15.3%；而進(jìn)一步聯(lián)合HB?crAg，4年累積臨床復(fù)發(fā)率則為0%。這項(xiàng)研究提示將HBV-RNA、HBcrAg兩個(gè)指標(biāo)聯(lián)合用于預(yù)測NAs停藥后的臨床復(fù)發(fā)大有可為。2021年香港大學(xué)袁孟峰教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表在GUT雜志上的一項(xiàng)研究，發(fā)現(xiàn)停藥時(shí)HBV-RNA陰性+HBsAg<10 IU/mL的患者，NA停藥后1年累積病毒學(xué)復(fù)發(fā)率為9.1%，顯著低于單獨(dú)使用HBV-RNA或HBsAg水平指導(dǎo)停藥的患者（分別為36%~52%和36.7%）[16]。本研究證實(shí)，HBsAg低于10 IU/mL的患者，HBV-RNA一般呈陰性，故也可指導(dǎo)沒有條件行HBV-RNA檢測的地區(qū)或患者，若有強(qiáng)烈停藥意愿，也可通過對HBsAg定量檢測的充分評估，嘗試停藥。而HBV-RNA陽性組同時(shí)也伴有高水平的HBsAg（平均值2.5log），與我國專家共識一致[9]：對于符合現(xiàn)行停藥標(biāo)準(zhǔn)的接受鞏固治療的患者，若血清HBV-RNA檢測陽性，停藥后疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較大，不建議停藥。

綜上所述，經(jīng)過NAs及peg-IFN-α序貫治療后，HBV-DNA陰性的CHB患者血清HBV-RNA水平存在較大差異，HBeAg、qHBsAg與血清HBV-RNA水平具有相關(guān)性，且qHBsAg是CHB患者HBV-RNA低于檢測下限的影響因素。研究顯示，低水平HB?sAg（<10 IU/mL）多提示HBV-RNA陰性，CHB患者血清HBV-RNA水平在一定程度上可反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性，今后有望指導(dǎo)NAs停藥。本研究仍有著局限。沒有聯(lián)合干擾素前的HBsAg定量及HBVRNA資料，難以比較其動態(tài)變化。樣本量較少，HBeAg陽性的患者較少。之后將在下一步的工作中，通過更完善的研究設(shè)計(jì)，加以改進(jìn)，以進(jìn)一步探索HBV-RNA的預(yù)測效能。